עיכול רקמת חלב לבידוד תאי אפיתל חלב אנושיים

התחל על ידי ניתוק הרקמה. השתמש בשני זוגות של מלקחיים כדי להסיר את רקמת השומן מרקמת החלב. ודא כי רקמת החלב הנותרת שוקלת כגרם אחד.

שטפו את רקמת החלב בחמישה מיליליטר של תמיסת אתנול 75% למשך חמש שניות. לאחר מכן, שטפו עם 20 מיליליטר של תמיסת כביסה פעמיים במשך חמש דקות כל אחת. לאחר מכן, השתמש בשני להבים כירורגיים כדי לחתוך את רקמת החלב לשברים קטנים יותר.

ברציפות במשך 15 דקות כדי לקבל הומוגנט רקמה, להעביר את הרקמה גרוס צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר. הוסף 10 מיליליטר של תמיסת דיספאז וקולגנאז, שלושה מיליליטר של 0.25% טריפסין, ושבעה מיליליטר של PBS לקבלת סך של 20 מיליליטר של תמיסת עיכול. מניחים את הצינור באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס לדגור במשך 1 1/2 שעה, לנער את הצינור כל 20 דקות.

כדי לעצור את תהליך העיכול, להוסיף 20 מיליליטר של פתרון מנטרל. לאחר מכן, פיפטה את התוכן כ 15 פעמים כדי להבטיח ערבוב יסודי. סננו את התערובת דרך מסנן רשת של 100 מיקרון.

לאחר מכן, צנטריפוגה ב 156G במשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר את supernatant. חזור על הדגירה של הגלולה עם 20 מיליליטר של פתרון מנטרל, ולאחר מכן לערבב על ידי pipetting.

שוב צנטריפוגה למשך חמש דקות. בזהירות להסיר את supernatant ו resuspend את גלולת התא עם 10 מיליליטר של מדיום התרבית הראשונית. לוחים את תרחיף התא בצלחת תרבית תאים בקוטר 100 מ"מ.

לטפח את התאים באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס. החליפו את מדיום התרבית המקורי בתווך תאי אפיתל טריים כל שלושה ימים. בדוק את התאים ורענן את המדיום כל יומיים.

באמצעות פרוטוקול זה, בודדו תאי אפיתל חלב אנושיים מרקמת החלב. ניתוח לאחר בידוד הראה כי תאים שטופלו במעכב ROCK Y-27632 הציגו צמיחה בולטת בהשוואה לקבוצת הביקורת. בדיקת CCK-8 גילתה כי תאים בתווך המכיל Y-27632 התרבו בקצב גבוה משמעותית מאלה בתווך הבקרה.

בדיקות אימונופלואורסצנטיות אישרו כי רוב התאים ביטאו סמני תאי אפיתל חלב, CK7 ו- GATA3, עם נוכחות זניחה של סוגי תאים אחרים במעברים הבאים. יתר על כן, מחקרי qRT-PCR הראו רמות ביטוי עקביות של CK7 ו- GATA3 על פני מספר מעברים המצביעים על פנוטיפ עקבי או יכולת התמיינות עקבית.