לאחר שחזור CD8 צולב מראש מ coculture, צנטריפוגות אותם ב 1100 גרם במשך 10 דקות ב 10 מיליליטר של מדיום גידול מלא. יש להשהות 1 x 10 בעוצמה של 7 תאים סה"כ ב-100 מיקרוליטר של מיקרו-כדוריות להסרת תאים מתים, ולדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הניחו את עמודי ההפרדה במפריד המגנטי ושטפו אותם באמצעות חיץ קשירה.
העבר מתלי תאים לעמודות הפרדה, ואסוף את הזרימה. לאחר שטיפת העמודה, אספו את התאים הלא מסומנים שעוברים דרכם, ושלבו אותם עם זרימה שנאספה בעבר. צנטריפוגה מועשרת CD8 חי צולב ב 1100 גרם במשך חמש דקות במדיום צמיחה שלם.
לאחר הספירה, תרבית CD8 תאים צולבים עם תאי MCA205 טריים ביחס של שניים לאחד ב -12 לוחות באר, ודגרה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 72 שעות. לפני שחזור CD8 אפקטור, להוסיף monensin ו brefeldin לתאים החיסון סרטן cocultures במשך שש שעות. לאחר מכן לשחזר אפקט CD8, צנטריפוגה פעמיים ב 1100 גרם במשך חמש דקות.
יש להשהות מחדש תאים בשלוש תערובות נוגדנים ראשוניות שונות שהוכנו במאגר FACS קר, ולדגור במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, תוך הגנה מפני אור. מוסיפים 100 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע לחיך התא ממיקס C ודגרים במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך. השהה מחדש את התאים במאגר שטיפה קרה, ודגר במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר שטיפת תאים פעמיים במאגר FACS, הוסף 100 מיקרוליטר של PBS המכיל את Vitality Fixable Aqua Dye לכדורי התא למשך 30 דקות. זהה תאים בעלי עניין בהתבסס על מאפייני FSCA ו- SSCA שלהם. לאחר מכן התווה FSCA ו- FSCH כדי לא לכלול כפילים וגושים של תאים מהניתוח.
התוויית מסנן פלסטר פליטה 525/50 ננומטר ו- SSCA להסרת תאים מתים, באמצעות מסנני פלסטר פליטה של 660/20 ו- 780/60 ננומטר, מזהים חיוביות תאים עבור CDAA ו- CD3 בשתי חלקות צפיפות פרמטרים. יתר על כן, לנתח תאים עבור CD44, CD25, ו CD69 סמנים עבור סמן CD137, ועבור אינטרפרון גמא חיובי ו granzyme B עבור תערובת A, B, ו- C, בהתאמה. לבדיקת הרג גידולים, השלימו את מדיום ההתרבות המשותפת עם צבע לכימות מוות תאי בזמן אמת.
לאחר חימום הצלחת ל-37 מעלות צלזיוס במערכת ניתוח התאים החיים, בצעו סריקת נתונים כל שעתיים למשך עד 72 שעות. צנטריפוגה את התאים פעמיים ב 1000 גרם במשך חמש דקות. לצבוע תאים לסמני פני השטח עם 20 מיקרוליטר של חיץ FACS קר ולדגור במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך.
לאחר מכן הוסיפו את צבע החיוניות פרופידיום יודיד כדי להכתים את התאים לאסטרטגיית גאט. זהה את התאים המעניינים בהתבסס על מאפייני FSCA ו- SSCA שלהם. לאחר מכן התווה FSCA ו- FSCH כדי לא לכלול כפילים וגושים של תאים מהניתוח.
השתמש במסנן פס פליטה של 450/50 ננומטר כדי לזהות תאים סרטניים שליליים ל- CD45. בהיסטוגרמה של פרמטר יחיד, באמצעות מסנן פליטת פסים של 610/620 ננומטר, יש לנתח תאים לשילוב יודיד פרופידיום כעוצמה פלואורסצנטית ממוצעת. באמצעות ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים, רמות ביטוי פני השטח של סמן ההפעלה המוקדמת CD69, סמני ההפעלה המאוחרת CD44 ו- CD25, ביטוי הממברנה של CD137 ו- CD107, השתפרו סמני תגובתיות הגידול.
הרמות התוך-תאיות של מולקולות ציטוטוקסיות, גראנזים B ואינטרפרון גמא חיובי עלו בהדרגה ובאופן משמעותי, והגיעו לשיא ביטוי לאחר 72 שעות של תרבות משותפת. תאי MCA205 בתרבית קוגנטית עברו רמות משמעותיות של מוות בתיווך אפקט CD8.
