Blocker Displacement Amplification-Enhanced Sanger Sequencing לגילוי מוטציות בתדר נמוך ברקמות סרטניות

כדי להתחיל, לבצע תגובת שרשרת פולימראז, או PCR, כדי להגביר את האזור הרצוי של ה- DNA שחולץ רקמה. הביאו את תערובת מאסטר אנזים ההגברה לריצוף, חיץ ומים מזוקקים פעמיים לטמפרטורת החדר והסתחררו מיד. לאחר הכנת הצינורות לריצוף, הניחו את צינור ה-PCR על מכשיר ה-PCR שנקבע מראש להגברה.

לאחר מכן הסר את המוצר ממכשיר ה- PCR ואחסן את מוצרי התגובה במקרר, מוגן מפני אור. מערבלים היטב את החרוזים המגנטיים. הוסף 10 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים ו 40 מיקרוליטר של 80% אתנול לצלחת 96 באר ואטום את הצלחת עם סרט.

הניחו את הצלחת בת 96 הבארות על שייקר מערבולת למשך 10 שניות כדי להשהות ולערבב את החרוזים במלואם. לאחר מכן הדקו את הצלחת בגומייה על מתנד אופקי ורטטו בהגדרה המקסימלית למשך שלוש עד חמש דקות. לאחר מכן, הניחו את לוחית ה-PCR על מעמד מגנטי, וודאו שהיא לחוצה היטב.

שמור על המעמד בארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות לספיחה סטטית. לאחר ספיגת החרוזים, הסירו את סרט התקרה ושפכו את נוזל הפסולת. שטפו את החרוזים פעמיים עם 40 מיקרוליטר של 80% אתנול.

לאחר ששפכתם את נוזל הפסולת, הניחו את הצלחת על נייר סופג וייבשו אותה בטפיחות עדינות. הכניסו את הנייר הסופג עם הלוח המגנטי לצנטריפוגה וסובבו ב-120 גרם לזמן קצר. לאחר הסרת האלכוהול, מניחים את הצלחת בתנור ב 60 מעלות צלזיוס במשך שלוש עד חמש דקות כדי לייבש את החרוזים לחלוטין.

לאחר מכן, להוסיף 40 מיקרוליטר של מים טהורים לצלחת ולאטום אותו עם סרט. נערו אותו על שייקר מערבולת למשך שלוש עד חמש שניות והניחו את הצלחת על שייקר אופקי. אבטחו אותו ותנו לצלחת לרעוד במשך שלוש עד חמש דקות כדי להמיס את מוצר הרצף המטוהר.

לבסוף, סובב את מוצר הריצוף המומס ב -180 גרם והשתמש במוצר לניתוח גנומי באמצעות אלקטרופורזה נימית. שיטה זו יכולה לזהות את מוטציית RHOA G17V הידועה ומוטציות אחרות בתדר נמוך במרווח ההגברה של פריימרים במעלה ובמורד הזרם. מוטציות בשני גנים נוספים, כלומר IDH2 ו-JAK1, נותחו גם הן נכון בשיטה זו.