טרנספקציה של טפיל מלריה בשלב הטבעתי עם פלסמידים פונקציונלי לחיווט מחדש של התמליל

כדי להתחיל, לקבל את סורביטול מסונכרן טבעת טפילים בשלב של פלסמודיום falciparum. הכינו 50 מיליליטר של חיץ ציטומיקס 2x ודללו אותו 1 עד 1 במים סטריליים. לאחר מכן, שטפו 100 מיקרוליטר של RBCs טפיליים בשלב טבעת ארוז פעמיים עם 5 מיליליטר של חיץ ציטומיקס 1X וצנטריפוגו אותם ב-994G למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הסרת החיץ, להוסיף 50 מיקרוגרם של כל פלסמיד לתוך התאים, ולאחר מכן נפח מתאים של חיץ 2x. התאם את עוצמת הקול ל 400 מיקרוליטר עם חיץ 1x לפני העברת התמיסה מוכנה לתוך cuvettes 0.2 ס"מ עבור כל transfection. לאחר מכן, אלקטרופורציה את התאים בזהירות.

לאחר ההתחשמלות, מערבבים ודגרים את התאים עם מדיום סל"ד מלא בבקבוק T25 בנפח כולל של 15 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את הטפילים הנגועים בצינור חרוטי 50 מיליליטר ב 994G במשך שלוש דקות. לאחר הסרת supernatant, לשטוף את הטפילים עם 10 מיליליטר של RPMI שלם.

מקציפים אותם בסל"ד מלא טרי במשך יומיים, ומחדשים את המדיום לאחר 24 שעות. לאחר 48 שעות, הסר את הסל"ד המלא מכל בקבוק. להשעות מחדש את התרבית בסל"ד מלא הוסיף עם סמים.

לדגור על התרבית בבקבוק T75 יחד עם 400 מיקרוליטר של תאי דם אדומים טריים במשך שבועיים ביום ה -14, aliquot 200 מיקרוליטר של התרבית transfected לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. צנטריפוגו את הצינור ב-500G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שאיפת הסופרנטנט, העבירו את התאים לשקופית והניחו עליה שקופית נוספת בזווית של 45 מעלות כדי לבצע מריחה.

לאחר קיבוע מתנול, יש לטבול את המגלשה בכתם Giemsa למשך 20 דקות. שטפו את המגלשה תחת מים זורמים וייבשו אותה היטב. יש להתבונן במגלשה תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 100 לאחר מריחת שמן טבילה.

לאחר הטפילים הם דמיינו, לחדש את המדיום מדי יום במשך יומיים עד שלושה.