הכנת דגימות דם שלמות עבור ציטומטריית זרימה וניתוח ציטוקינים כדי לקבוע חסינות מארח ספציפית לאנטיגן לפתוגנים פטרייתיים ונגיפיים

כדי להתחיל בהכנת דגימות לציטומטריית זרימה, הוציאו מהאינקובטור צינורות גירוי המכילים דגימות דם שלמות עם ברפלדין A. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת EDTA מולרית 0.5 לכל צינור גירוי המכיל Brefeldin A.העבר את הדגימות לצינורות צנטריפוגות 15 מיליליטר חדשים. לאחר מכן פיפטה מיליליטר אחד של חיץ אריתרוציטים ליזה לתוך כל צינור גירוי כדי לשטוף אותו.

העבירו את החיץ ואת מתלה התא לאותו צינור צנטריפוגה. צנטריפוגו את הצינורות ב 600 גרם במשך שבע דקות, בזהירות פיפטה החוצה supernatant. לאחר מכן להוסיף חיץ ליזה אריתרוציטים לגלולה ולהשעות אותו מחדש.

יש לדגור על הדגימות בטמפרטורת החדר עד שהדגימות נראות ברורות או למשך שש דקות לכל היותר. צנטריפוגה את הצינורות ב 600 גרם במשך שבע דקות. לאחר השלכת supernatant, להוסיף מיליליטר אחד של HBSS לכדור.

העבירו את תרחיף התא לצינורות תגובה של שני מיליליטר. ואז צנטריפוגה את הצינורות ב 400 גרם במשך חמש דקות. יש להשליך את הסופרנאטנט לפני ביצוע צביעה ציטומטרית של זרימה.

מעבירים את הדגימות מצינורות הגירוי שאינם מכילים ברפלדין A לצינורות 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה צינורות ב 2, 000 גרם במשך 20 דקות. כעת הכניסו בזהירות את הסופרנאטנט לצינור טרי של 1.5 מיליליטר.

אם לא מנתחים את הסופרנאטנט מיד, משמרים את הדגימה בהקפאה בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. בעת שימוש בדגימות קפואות, צנטריפוגות הפשיר supernatants שוב במהירות גדולה מ 7, 000 גרם במשך חמש דקות לפני הניתוח. ביצוע טרום דילול של הדגימות כנדרש על ידי פרוטוקול בדיקת ציטוקינים.

השהה מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של מאגר הגנת RNA. Cryopreserve אותו ב 80 מעלות צלזיוס עבור בידוד RNA לאחר מכן. לחלופין, יש להשהות מחדש את כדורית התא ב-700 מיקרוליטר של חיץ ליזיס לבידוד RNA מיידי.