פיתוח אפיתל שחלות אנושי חד-שכבתי ואורגנואידים לחקר התחדשות והשפעות תרופתיות

כדי להתחיל, להפשיר cryopreserved תאי אפיתל פני השחלות האנושיות. מערבבים את התאים עם 10 מיליליטר של אמצעי כביסה. לאחר צנטריפוגה של התאים, להשהות מחדש גלולה בשני מיליליטר של אפיתל פני השחלות או OSE 2D בינוני ולהעביר אותו לתוך שתי בארות של צלחת 12 בארות.

הוסף מיליליטר אחד של מדיום OSE 2D נוסף לבאר ותרבית ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני במשך 72 שעות לפני חידוש המדיה הראשון. השתמש בצביעת Trypan Blue כדי לספור תאי אפיתל חיים של פני השחלות האנושיות שבודדו או נשמרו בהקפאה עם מונה תאים אוטומטי. מערבבים את מספר התאים הרצוי במיליליטר אחד של מדיום בסיסי אורגנואיד OSE קר כקרח, וצנטריפוגה את הצינור ב 240 גרם למשך חמש דקות.

באמצעות פיפטה, להשעות מחדש את גלולת התא בתמיסת תמצית קרום מרתף לא מדולל קר כקרח כדי להשיג 10, 000 תאים לכל 10 מיקרוליטר. הוסף 10 טיפות מיקרוליטר של תמיסת מיצוי קרום מרתף OSE לכל באר במגלשה מרובת תאים מחוממת מראש והנח את הצלחת הפוכה ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני למשך 15 דקות. לאחר שהג'ל מתמצק, מוסיפים 100 מיקרוליטר של מדיום תלת ממדי OSE ותרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני.

לאחר הסרת המדיום בילה, להוסיף 100 מיקרוליטר של מתקדם קר כקרח DMEM F12 לכל באר. מגרדים את תחתית הבארות עם קצה פיפטה P1000 כדי לנתק את טיפות הג'ל ומעבירים כל טיפת ג'ל צפה לצינור של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור ב 240 G במשך חמש דקות.

לאחר השלכת הסופרנטנט, יש להשהות מחדש את הגלולה ב-300 מיקרוליטר של חיץ דיסוציאציה של תאים ולהניח את הצינורות באמבט חרוזים שחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 עד 10 דקות. לאחר מכן, להוסיף 300 מיקרוליטר של אורגנואיד OSE אנושי בינוני בסיסי, צנטריפוגה ב 240 גרם במשך חמש דקות. לבסוף, להשהות מחדש את הגלולה בנפח הרצוי של פתרון תמצית קרום מרתף לא מדולל כדי לזרוע אותם מחדש ביחס מתאים לתרבית.

תאי אוז"ה אנושיים ראשוניים הציגו מורפולוגיה דמוית אבן מרוצפת עד מעבר שלוש, אך הראו סימני הזדקנות לאחר מכן. אורגנואידים אנושיים של OSE מתאי OSE שבודדו לאחרונה גדלו יותר מאלה של תאי OSE מורחבים דו-ממדיים לאחר 14 יום בתרבית. מורפולוגיות שונות נצפו באורגנואידים תלת-ממדיים של OSE, כולל צבירי תאים ציסטיים, חד-שכבתיים, רב-שכבתיים ולא לומניים.