כדי להתחיל, לחתוך את רשתות מתכת לרצועות בגודל 25 על 8 מ"מ. מניחים את רשתות ההתאמה האישית במיכל עיקור ואוטוקלאבה למשך שעתיים. לאחר autoclaving, מניחים את מיכל העיקור ואת בקבוקוני 1.8 מיליליטר מתחת לספסל זרימה למינרית.
פתח את מיכל העיקור והסר את רשת המתכת. הכנס את הרשת למכסה של בקבוקון 1.8 מיליליטר וסגור את הבקבוקון. לאחר איסוף רקמת קליפת השחלה האנושית, להסיר את medulla לחתוך את הרקמה לצורות רצויות.
הוסף חמישה מיליליטר של תמיסת ויטריפיקציה 1 לבאר הראשונה של צלחת שש בארות. באמצעות מסננת התא, לאזן את רקמת קליפת השחלות במשך חמש דקות באר 1 של הצלחת. העבירו את מסננת התא עם רקמת קליפת המוח לבאר 2 המכילה חמישה מיליליטר של תמיסת ויטריפיקציה 2 ואזנו למשך חמש דקות.
לאחר מכן, הניחו את המסננת המכילה רקמת קליפת המוח לתוך באר 3 מתוך צלחת בעלת שש בארות, המכילה חמישה מיליליטר של תמיסת ויטריפיקציה 3 למשך שש דקות. ממלאים את בקבוקון הקריו המוכן בחנקן נוזלי מעוקר ומניחים אותו בכלי הדיואר של הקריו המלא בחנקן נוזלי. טען את דגימות הרקמה על רשת המתכת של מכשיר הוויטריפיקציה תוך דקה אחת.
לאחר מכן הכנס את רשת המתכת לחנקן הנוזלי בבקבוקון הקריו מבוסס הרשת. הוסף שישה מיליליטר של תמיסת שיווי משקל לבאר 1 של צלחת סטרילית בעלת שש בארות, ולאחר מכן העבר שישה מיליליטר של RS, כל אחד לבארות 2 ו -3. דוגרים במשך שעה בטמפרטורת החדר.
חממו את תמיסת ההתחממות המהירה בכוס דגימה סטרילית למשך שעה על פלטת חימום המוגדרת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מתחת לספסל הזרימה הלמינרית, פתחו את הבקבוקונים שהשתמרו בהקפאה המכילים רקמת קליפת המוח השחלתית הזגוגית. העבירו במהירות את הרשת לתמיסת ההתחממות המהירה.
בעזרת מלקחיים סטריליים מעבירים את הרקמה לתמיסת שיווי המשקל ודגרים במשך שלוש דקות על שייקר נדנדה. לאחר מכן, שטפו את הרקמה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות כל אחת עם RS1 ו-RS2 על שייקר נדנדה. להמיס calcein ב 100 מיקרוליטר של DMSO.
מעבירים שלושה מיקרוליטרים של קלצאין לתחתית צינור של 1.5 מיליליטר ומאחסנים במינוס 20 מעלות צלזיוס. מוסיפים 0.007 גרם של collagenase בצינור 1.5 מיליליטר, ומאחסנים את הצינור במינוס 20 מעלות צלזיוס. הוסף 997 מיקרוליטר של DPBS לשלושת המיקרוליטרים הקפואים של קלצאין והשהה מחדש כדי להמיס את הקלצאין.
לאחר מכן להוסיף אבקת collagenase קר כדי לקבל 1000 מיקרוליטר של פתרון עבודה. לאחר מכן להוסיף 500 מיקרוליטר של פתרון calcein עובד ולהעביר שתי חתיכות של שני מילימטרים של שברי קליפת השחלות לתוך בארות של צלחת ארבע בארות. לאחר מכן לדגור במשך 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, הגנה מפני אור.
לבסוף, תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לקבוע את הכדאיות הפוליקולרית.
