כדי להפיק מקרופאגים ממח העצם של עכבר בוגר מסוג פראי, צלחו את תאי מח העצם בלוח תחתון שטוח 96 באר שטופל אופטית המכיל DMEM בתוספת 10% FBS ו-10% LCCM. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 7% פחמן דו חמצני במשך 10 ימים. לאחר ההתמיינות, פיפטה 75 מיקרוליטר של Mycobacterium abscessus תרחיף לתוך מקרופאגים המכילים בארות.
לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 7% פחמן דו חמצני למשך ארבע שעות. באמצעות מתקן מגיב microplate, מצויד קלטת קטנה, להוסיף 110 מיקרוליטר של DMEM בתוספת 10% FBS ו 10% LCCM לתוך תרכובות או עמודות בקרת ממס. יש להוציא 104 מיקרוליטר נוספים של DMEM בתוספת 10% FBS ו-10% LCCM לעמודות המכילות את הריכוז הגבוה ביותר של התרכובת או הממס.
עכשיו פיפטה 5.9 מיקרוליטר של תרכובות או ממס לתוך בארות ייעודי שלהם בעמודים. באמצעות מיקרופיפטה רב ערוצית, לבצע שני דילול טורי עבור כל תרכובת וממס. לאחר הדילול האחרון, להשליך את עודף 110 מיקרוליטר של בינוני מן הבאר האחרונה.
הוסף 110 מיקרוליטר של DMEM בתוספת 10% FBS ו- 10% LCCM לכל העמודות, למעט בארות ריקות. הכן פתרון של clarithromycin בריכוז של שני מיקרוגרם למיליליטר ב DMEM. לאחר הדגירה, יש להסיר את הצלחת בת 96 הקידוחים המכילה מקרופאגים נגועים מהאינקובטור.
באמצעות מכונת כביסה לצלחות, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר של תמיסת שטיפת זיהום. מעבירים 200 מיקרוליטר של התרכובות לצלחת המכילה את המקרופאגים הנגועים. לאחר מכן להוסיף 200 מיקרוליטר של תוספת תרבית תאים בינוני פתרון clarithromycin לבארות שלהם.
דוגרים על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 7% פחמן דו חמצני למשך 48 שעות. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים הנגועים שלוש פעמים כל אחד עם 200 מיקרוליטר של תרכובות תמיסת שטיפה. באמצעות מיקרופיפטה רב ערוצית, להוציא 200 מיקרוליטר של פתרון קיבוע לתוך כל הבארות לדגור במשך 10 דקות.
לאחר שטיפת התאים, להעביר 200 מיקרוליטר של פתרון חדיר לתוך כל הבארות לדגור במשך 15 דקות. לאחר מכן, שאפו את הפתרון החדיר לפני הוספת 100 מיקרוליטר של תמיסת הצביעה לכל הבארות. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר של תמיסת השטיפה של התרכובת. כדי לסנן את הלוח באמצעות מערכת הדמיה בעלת תוכן גבוה, בחר באפשרות סוג צלחת כלוח 96 מיקרו-טיטר (96 microtiter). יעד כ-20X עם צמצם מספרי 0.4 ומצב לקונפוקל.
לאחר מכן, בחר את DAPI, CellMask אדום עמוק וערוץ mCherry כדי ללכוד את הגרעינים, הציטופלסמה והאות החיידקי המוכתמים, בהתאמה. בחר את הבארות של הצלחת ואת השדות המתאימים של כל באר לניתוח. לאחר מכן, לחץ על הבדיקה וללכוד תמונה כדי לבדוק את ההגדרות.
לבסוף, הגדירו רובוט לטיפול בציוד כדי להפוך את רכישת התמונות לאוטומטית בן לילה. זרוע רובוטית זו מחליפה את הלוחות במערכת ההדמיה בעלת התוכן הגבוה ללא התערבות אנושית. תרכובות דאונורוביצין, דוקסורוביצין, תיאוסטרפטון, אפירוביצין ופירוויניום פמוט היו רעילות למיקובקטריה שנדבקו במקרופאגים, מה שהוביל לפחות מ-85% מיכולת הקיום של התאים.
לתרכובות moxalactam ו-besifloxacin הייתה פחות מ-50% כדאיות מיקובקטריה ב-13.3 מיקרומולרית, אך לא הראו הבדל משמעותי מבקרת DMSO. תרכובות cefdinir, gatifloxacin, ו moxifloxacin היו חזקים נגד מיקובקטריה תאית ב 13.3 micromolar עם תרכובת pyrvinium pamoate להיות הפעיל ביותר. תרכובות רוקיתרומיצין, קלריתרומיצין וריפאבוטין הדגימו עוצמה קיצונית נגד מיקובקטריה תוך-תאית, כאשר קלריתרומיצין הפחיתה את יכולת הקיום של המיקובקטריום לפחות מ-10% בכל הריכוזים.
