נתמך על ידי אוניברסיטת קנטקי, החוג לביולוגיה, משרד לימודי הסמכה ו במכללה לאמנויות ומדעים.

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פוטנציאל ממברנה כבר ב 1902, היה ברנשטיין להתמודד עם סוגיות של פוטנציאל מנוחה האקסון של דיונון. זה מרתק לבחון כיצד רעיונות אלו מוקדם תצפיות ברשטיין (1902) ו נרנסט (1888) השפיע מאוחר יותר מחקר בפיזיולוגיה הממברנה. (ראה סקירה על ידי Malmivuo ו Plonsey, 1995; זמין גם על www <a href="http://www.bem.fi/book/">http://www.bem.fi/book/</a> ). יש עדיין, עד עצם היום הזה, פריצות דרך נעשים על פונקציה ערוץ יון ותכונות של ממברנות ביולוגיות, כי הם מאוד משמעותי בהבנת הפיזיולוגיה הסלולר המתייחס לתפקוד של רקמות, איברים ומערכות. השוואה של השפעות הנגזר ניסיוניים תיאורטית של חיצוני [K +] על פוטנציאל הממברנה מנוחה מציין את ההשפעה של יונים על פוטנציאל הממברנה. ניסויים נוספים באמצעות הכנת אותו להישאר להתבצע במטרה לענות על שאלות הפיזיולוגיים הבסיסיים. חלקם היו מודגשים בחזרה בשנת 1968 על ידי אטווד פרנס ו טרם התמודד באופן מלא. בעזרת טכניקות השיג בתרגיל זה, אפשר להמשיך לענות על שאלות רבות שנותרו ההכנות ניסיוני אחרים, כמו גם ביישומים פיזיולוגיים הקשורים לרפואה ובריאות. אנחנו הדגימו את התועלת של הכנת מודל חוליות במטרה לענות על שאלות יסוד הנוגעות לכל בעלי החיים. עם הידע שנצבר על הדרגתיים אלקטרוכימי של יוני בתרגיל זה לעיל, עכשיו אתה יכול להתקדם רגישות של ממברנות ידי בדיקת הולכה סינפטית על ההכנות neuromuscular ב סרטנים. מדידת התגובות Synaptic הפרטים שנקבעו בחלק הראשון של המעבדה הזו, הסרט קשור, סיפקו שלבים עיקריים הקלטה פוטנציאל הממברנה חוקרת מבנה השריר. בחלק השני של המעבדה זה, הפגנה של דיסקציה שידור הקלטה הסינפטי על NMJs של יחידות מוטוריות phasic טוניק סיפק חשיפה מושגי יסוד בפיזיולוגיה. החשיפה במעגל העצבי, אשר יכול בחלק ניתן להסביר התנהגויות הקשורות, בתוך החיה שלם יש פוטנציאל לא רק לתלמידים לחקור שונים שאלות פתוחות בתוך תרגיל מעבדה שלהם אלא גם למחקר עתידי על מעגלים עצביים ב היטב חוליות הכנה הוקמה (קנדי et al, 1969;. Antonsen ואדוארדס, 2003) תכשירים אלה יכולים לשמש גם כדי לחקור סיוע דיכאון הסינפטי, לטווח ארוך פלסטיות (לא נחקרו במחקר זה במעבדה). אפילו בתוך כמה מינים של סרטנים, הפלסטיות העצבית תלוי בתנאי הגירוי הניסיוני (מרסייה אטווד, 1989;. Cooper et al, 1998), כמו גם בסביבתם הטבעית. במידה מה את היכולת לשנות היעילות הסינפטית ודינמיקה השריר משמש החיה נשארת להיחקר. מאז סרטנים משנים את התנהגותם ביחס וריאציה עונתיים מחזור הנשירה, יש יחסית לטווח ארוך הבדלים בפעילות מערכות neuromuscular שלהם. הוכח כי העצב phasic מנוע מסופים של השרירים טופר קרוב התערוכה מורפולוגיה phasic קלאסי במהלך החורף, אבל להתנפח ולהפוך דליות יותר לאורך הטרמינל במהלך חודשי הקיץ (Lnenicka 1993; Lnenicka ו זאו, 1991). כמה מחקרים מוקדמים שנערכו סרטנים (LG) interneurons לרוחב ענק בתוך העצב בחוט הגחון הפגינו נוכחות הפער צמתים (Johnson, 1924; ווטנבה Grundfest, 1961). עובדה ידועה היא כי ה-CO 2 יש השפעה על התקשורת חשמל על ידי שיחררה את סוגר פער צמתים (Arellano et al, 1990). זה היה הראו לאחרונה כי העצב ותקשורת בתוך מעגל חושית-CNS-מנוע השריר, כפי שמתואר בדו&quot;ח זה, הוא גם רגיש CO 2 חשיפה, המעידים על נוכחות של פער צמתים (Bierbower, 2010; Bierbower וקופר, 2010) הפעילות הספונטנית של שורש 3 rd המנוע כבר נושא מאז 1960 של מתי אקרט (1961) בדקו אם טוניק ירי שרירים סטטי קולטן איבר (MRO) בתוך קטע זהה או השכנה יכול להסביר את הכונן מנוע ספונטנית. אלה מחקרים קודמים התברר כי הפעילות היה מונע את העצב בתוך חוט הגחוני (VNC) ואולי גם ממרכזי גבוה יותר (אקרט, 1961; קנדי טאקדה, 1965a, b;. Strawn et al, 2000). מאז נוכחות של CO 2 עצר את פעילות ספונטנית, אפשר להניח במקום כלשהו בכונן לתאי העצב המוטורי שאולי יש צמתים הפער או כונן מעוררים glutamatergic. NMJs חסומים או להציג ירידה ברגישות גלוטמט בנוכחות של CO2, והם עשויים להיות גושked גם בתוך מערכת העצבים המרכזית (Bierbower, 2010; Bierbower וקופר, 2010: ראה גם Badre et al, 2005).. הפעולה של neuromodulators שונים הוא גם למד בקלות על סוגים שונים של NMJs (קופר קופר, 2009; Griffis et al, 2000;. סאוט et al, 2000;.. Strawn et al, 2000). בנוסף, השפעות שונות המופעל על ידי neuromodulators על המעגלים מערכת העצבים המרכזית. הוצע כי 5-HT ונוירונים octopaminergic יכול לתפקד &quot;להרוויח-קובעי&quot; בשינוי התפוקה של מעגלים עצביים (מא et al, 1992;. שניידר et al, 1996;. הורנר et al, 1997;. אדוארדס et al., 2002). עבודה רבה המלאכה לפני שנוכל להבין את ההשפעות של neuromodulators על התאים היעד בודדים. בהתחשב בכך neuromodulators שונים יפעלו בתיאום אחד עם השני, ניתוח של הפעולה שלהם מעורב הוא אזור למחקר עתידי (Djokaj et al., 2001). בנוסף, מחקרים מעטים, בעיקר בעלי חוליות, כתובת ההשפעות של neuromodulators על כל המסלולים אשר יכולים לווסת התנהגות ספציפיים. לקראת חושית-CNS-מנוע יחידה זו ניתן לבחון את ההשפעה של הקלט החושי והן neuromodulators על הפעילות של הנוירונים המנוע (Kennedy et al., 1969). מאז זה כבר הניחו כי 5-HT משחק תפקיד בוויסות מצב התנהגותי של סרטנים, לובסטרים, סרטנים ו (ליווינגסטון et al, 1980;.. Sneddon et al, 2000), מספר ניסיונות נעשו כדי לקבוע את ריכוזו VNC, hemolymph ו בגרעיני מבודד של לובסטרים (ליווינגסטון et al, 1980;. האריס ו-Warrick קרביץ 1984;. Fadool et al, 1988). עם זאת, חלה וריאציה ניכרת את המדידות נרשמו, לא ניתן ספציפי מנה תגובה קשרים אשר יכול להסביר את פעולות התנהגותיות. סרטנים עם צבתות החזיק בעמדה גדל עם הזנב תחובה מתחת לבטן שלה כבר חשבתי להציג תנוחה לשלוט (ליווינגסטון et al. 1980). מדינת כיפוף בטן סרטנים אינו מופיע להיות יציבה כי סרטנים דומיננטיים, בתוך זוג, התערוכה במהלך אינטראקציות חברתיות או תוך שמירה על מעמדו ההיררכי דומיננטי (Listerman et al., 2000). סרטנים כנוע אפילו טאק הבטן שלהם תחת עצמם כפי שהם לסגת יריב. תוחב זנב כזה נראה גם הגנה יציבה (Listerman et al., 2000). התנהגויות אלו נצפו בקלות בתחום ובמסגרות מעבדה (Bovbjerg, 1953, 1956; ברוסקי ו Dunham, 1987; Li et al, 2000;.. Listerman et al, 2000). מעניין, תנוחות התנהגותיים ציין לובסטרים (ליווינגסטון et al. 1980) מתהפכים עבור 5-HT וזריקות octopamine ב סרטנים האוסטרלי, הורס Cherax (מקריי, 1996). ייתכן, תגובות שונות לחלוטין יהיה לצפות בהכנת מכופף שטחית סרטנים האוסטרלי. בנוסף, מאז הדומיננטיות היא בדרך כלל בגודל הקשורים בין סרטנים, ניתן לצפות במערכת התגובה פלסטיק מאוד התנאים החברתיים להשתנות במהירות (Strawn et al., 2000). הפלסטיות של היענות neuromodulators ב חסרי חוליות הוא שטח פתוח החקירה. Wyttenbach, ג&#39;ונסון, הוי (1999) יצרו מדיה דיגיטלית מדריך מעבדה experimentations סרטנים שונים מעורבים שרירים זהה המוצג בדוח זה בנוסף להכנות סרטנים אחרים. זהו משאב מצוין עבור תרגילים סטודנט.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרטן הנהרות (Procambarus כלארקיי). Atchafalaya ביולוגית אספקת ושות, Raceland, לוס אנג&#39;לס., ארה&quot;ב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן סרטנים מלוחים: השתנה מפתרון של ואן Harreveld (1936). (מ&quot;מ) 205 NaCl, KCl 5.3, 13.5 CaCl 2 2H 2 O, 2.45 MgCl 2 6 שעות 2 O; 5 HEPES והותאמו pH 7.4. , סרוטונין ודופמין גלוטמט נעשים מלוחים סרטנים. פתרון מקבע של Bouin שימש ישירות מתילן כחול הוא עשה מלוחים סרטנים. כימיקלים כל מתקבלים Sigma כימיים החברה (סנט לואיס, מיזורי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dissection כלים: פיין # 5 פינצטה, מספריים בסדר, בעל להב סכין, # 26002-20 סיכות חרקים (להשיג כל כלי מן המדע פיין (ארה&quot;ב), Inc, 373-G Vintage פארק דרייב, פוסטר סיטי, קליפורניה 94404-1139) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sylgard בעל תחתית צלחת זכוכית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוסות (להחזיק תמיסות כימיות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אותות חשמל נרשמות על הקו לממשק PowerLab 26T למחשב (ADInstruments, קולורדו ספרינגס, קולורדו, ארה&quot;ב). אנו משתמשים בתוכנה מבית תקן ADInstruments בשם תרשים או היקף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגם 3000 AC / DC מגבר להקלטות תאיים וכן תאית יכולה לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הביתור מיקרוסקופ עם פונקציית הזום הקלטות תאיים. להקלטת מוקדי על מסופי דמיינו מיקרוסקופ תרכובת עם מטרות זקוף (4 x ו-20X) משמש. אחד צריך מקור אור כספית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הקלטות תאיים אנו משתמשים בצינור זכוכית נימי (קטלוג # 30-31-0 מתוך fhc, ברונסוויק, ME, 04011, ארה&quot;ב). אלקטרודה תאיים צריך התנגדות של mOhm 20-30. אלקטרודות תאיים היו מלאים 3M KCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודה יניקה משמש כדי להקליט אותות תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלוב פאראדיי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוצמת הפנס גבוהה (מקור האור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micromanipulator </li></ol>

membrane potentials, synaptic responses, neuronal circuitry, neuromodulation and muscle histology using the crayfish: student laboratory exercises

מטרת דו&quot;ח זה היא לעזור לפתח הבנה של ההשפעות שנגרמו הדרגתיים יונים על פני קרום ביולוגי. שני היבטים המשפיעים על פוטנציאל הממברנה של התא שבו אנו כתובת בניסויים אלה: (1) ריכוז של יון + K בצד החיצוני של הקרום, ו (2) את החדירות של הממברנה ליונים מסוימים. סרטנים שרירי הבטן extensor הם קבוצות עם טוניק קצת להיות (לאט) ואחרים phasic (מהר) ב פנוטיפים ביוכימיים פיזיולוגיים שלהם, כמו גם במבנה שלהם; הנוירונים המנוע innervate השרירים האלה הם שונים בהתאם במאפיינים פונקציונליים. אנו משתמשים בשרירים אלו, כמו גם את השריר השטחי מכופף טוניק, הבטן כדי להדגים נכסים בשידור סינפטי. בנוסף, אנחנו מציגים חושית-CNS-הנוירון המוטורי, השריר המעגל כדי להדגים את ההשפעה של גירויים חושיים cuticular כמו גם את השפעתם של neuromodulators על היבטים מסוימים של המעגל. בעזרת טכניקות השיג בתרגיל זה, אפשר להתחיל לענות על שאלות רבות שנותרו ההכנות ניסיוני אחרים, כמו גם ביישומים פיזיולוגיים הקשורים לרפואה ובריאות. אנחנו הדגימו את התועלת של ההכנות חוליות מודל במטרה לענות על שאלות יסוד הנוגעות לכל בעלי החיים.

Watch this Scientific Journal Video about Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises at JoVE.com

Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises

הניסויים להפגין גישה נוחה לסטודנטים לצבור ניסיון לבחינת מבנה השריר, תגובות הסינפטי, את ההשפעות של הדרגתיים יונים חדירות על פוטנציאל הממברנה. כמו כן, חושית-CNS-מנוע שריר מעגל מוצג להראות אמצעי לבחון השפעות של חומרים במעגל עצבי.

ממברנה פוטנציאלים, התגובות Synaptic, המעגלים הנוירונים, Neuromodulation ו היסטולוגיה שרירים שימוש סרטן הנהרות: מעבדה תרגילים סטודנטים

The purpose of this report is to help develop an understanding of the effects caused by ion gradients across a biological membrane. Two aspects that ...

membrane-potentials-synaptic-responses-neuronal-circuitry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

58.4K Views.  University of Kentucky. הניסויים להפגין גישה נוחה לסטודנטים לצבור ניסיון לבחינת מבנה השריר, תגובות הסינפטי, את ההשפעות של הדרגתיים יונים חדירות על פוטנציאל הממברנה. כמו כן, חושית-CNS-מנוע שריר מעגל מוצג להראות אמצעי לבחון השפעות של חומרים במעגל עצבי.

Video: Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises

Recording Behavioral Responses to Reflection in Crayfish

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems. One important issue concerns the relative roles of each sensory modality in guiding behavior. The role of visual inputs has been examined by isolating visual stimuli from mechanical and chemosensory stimuli. In some studies (Bruski &amp; Dunham, 1987: Delgado-Morales et al., 2004) visual inputs have been removed with blindfolds or low light intensity, and effects of remaining sensory modalities have been elucidated. An alternative approach is to study the effects of visual inputs in the absence of any appropriate mechanical and chemosensory cues. This approach aims to identify the exclusive role of visual inputs. 
We have used two methods to provide visual stimuli to crayfish without providing chemical and mechanical cues. In one method, crayfish are videotaped in an aquarium where half of the walls are covered in mirrors to provide a reflective environment, and the other half are covered in a non-reflective (matte finish) plastic. This gives the crayfish a choice between reflective and non-reflective environments. The reflective environment provides visual cues in the form of reflected images of the crayfish as it moves throughout half of the tank; these visual cues are missing from the non-reflective half of the tank. An alternative method is to videotape the behavior of crayfish in an aquarium separated by a smaller chamber at each end, with a crayfish in one small chamber providing visual cues and an inert object in the opposite small chamber providing visual input from a non-moving, non-crayfish source. 
Our published results indicate that responses of crayfish to the reflective environment depend on socialization and dominance rank. Socialized crayfish spent more time in the reflective environment and exhibited certain behaviors more frequently there than in the non-reflective environment; isolated crayfish showed no such differences. Crayfish that were housed in same-sex pairs developed a social rank of either dominant or subordinate. Responses to reflection differed between dominant and subordinate crayfish (May &amp; Mercier, 2006; May &amp; Mercier, 2007). Dominant crayfish spent more time on the reflective side, entered reflective corners more frequently and spent more time in reflective corners compared to the non-reflective side. Subordinate crayfish walked in reverse more often on the reflective side than on the non-reflective side. Preliminary data suggest similar effects from visual cues provided by a crayfish in a small adjoining chamber (May et al., 2008).

We have developed two methods for studying effects of visual cues on behavior in the absence of tactile and chemical cues. One method involves videotaping responses of crayfish to reflective walls in an aquarium; the other examines effects of visual inputs provided by a live crayfish behind a transparent partition.

הקלטה תגובות התנהגותיות כדי השתקפות של סרטן הנהרות

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems.  One important issue concerns the relative roles of each ...

Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor neurons innervating the extensor muscle in the walking leg of a crayfish. Distinct differences are present in the physiology and morphology of the phasic and tonic nerve terminals. The tonic axon contains many more mitochondria, enabling it to take a vital stain more intensely than the phasic axon. The tonic terminals have varicosities, and the phasic terminal is filiform. The tonic terminals are low in synaptic efficacy but show dramatic facilitated responses. In contrast, the phasic terminals are high in quantal efficacy but show synaptic depression with high frequency stimulation. The quantal output is measured with a focal macropatch electrode placed directly over the visualized nerve terminals. Both phasic and tonic terminals innervate the same muscle fibers, which suggests that inherent differences in the neurons, rather than differential retrograde feedback from the muscle, account for the morphological and physiological differentiation.

This article demonstrates how to conduct electrophysiological recordings of synaptic responses on the extensor muscle in the walking leg of a crayfish and how the nerve terminals are visualized to show the gross morphological differences of high- and low-output nerve terminals.

הקלטות פיזיולוגיים של NMJs פלט גבוה ונמוך על שרירים ברגליים סרטן הנהרות extensor

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor ...

Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive information for an animal. An additional objective of this experiment is to learn anatomy of the preparation by staining, dissection and viewing of neurons and sensory structures under a dissecting microscope. This is performed by using basic neurophysiological equipment to record the electrical activity from a joint receptor organ and staining techniques. The muscle receptor organ (MRO) system in the crayfish is analogous to the intrafusal muscle spindle in mammals, which aids in serving as a comparative model that is more readily accessible for electrophysiological recordings. In addition, these are identifiable sensory neurons among preparations. The preparation is viable in a minimal saline for hours which is amenable for student laboratory exercises. The MRO is also susceptible to neuromodulation which encourages intriguing questions in the sites of modulatory action and integration of dynamic signals of movements and static position along with a gain that can be changed in the system.

The primary purpose of this experiment is to understand how primary sensory neurons convey information of joint movements and positions as proprioceptive information for an animal. An additional objective of this report is present the anatomy of the preparation by dissection and viewing of neurons under a dissecting microscope.

קולטן שרירים איברים בבטן סרטן הנהרות: מעבדה הסטודנטים תרגיל הפרופריוספציה

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive ...

Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise

The purpose of the report is to describe dissection techniques for preparing the crayfish hindgut and to demonstrate how to make physiological recordings with a force transducer to monitor the strength of contraction. In addition, we demonstrate how to visually monitor peristaltic activity, which can be used as a bioassay for various peptides, biogenic amines and neurotransmitters. This preparation is amenable to student laboratories in physiology and for demonstrating pharmacological concepts to students. This preparation has been in use for over 100 years, and it still offers much as a model for investigating the generation and regulation of peristaltic rhythms and for describing the mechanisms underlying their modulation. The pharmacological assays and receptor sub-typing that were started over 50 years ago on the hindgut still contribute to research today. This robust preparation is well suited to training students in physiology and pharmacology.

In this report we demonstrate techniques that can be used to investigate the biology of the crayfish hindgut. We show how to dissect a crayfish abdomen and study the associated anatomy, physiology and modulation of activity. The peristaltic activity and strength of contractions are measured using a force transducer.

ניסויים פיזיולוגיים עם במעי האחורי סרטן הנהרות: תרגיל מעבדה סטודנטים

The purpose of the report is to describe dissection techniques for preparing the crayfish hindgut and to demonstrate how to make physiological recordings ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Proprioception and Tension Receptors in Crab Limbs: Student Laboratory Exercises

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons responsible for proprioception as they are detecting joint position and movement, and muscle tension. Electrical activity from crustacean proprioceptors and tension receptors is recorded by basic neurophysiological instrumentation, and a transducer is used to simultaneously measure force that is generated by stimulating a motor nerve. In addition, we demonstrate how to stain the neurons for a quick assessment of their anatomical arrangement or for permanent fixation. Staining reveals anatomical organization that is representative of chordotonal organs in most crustaceans. Comparing the tension nerve responses to the proprioceptive responses is an effective teaching tool in determining how these sensory neurons are defined functionally and how the anatomy is correlated to the function. Three staining techniques are presented allowing researchers and instructors to choose a method that is ideal for their laboratory.

Physiological and anatomical techniques are demonstrated to address function and structure for joint proprioceptors and muscle tension receptors in crustacean walking limbs.

רצפטורים פרופריוספציה והמתח בסרטן איברים: תרגילי מעבדה הסטודנטים

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the pathophysiological basis of these diseases, it is necessary to precisely characterize in which way the processing of information is disturbed between the different neuronal parts of the circuit. Using extracellular in vivo electrophysiological recordings, it is possible to accurately delineate neuronal activity within a neuronal network. The application of this method has several advantages over alternative techniques, e.g., functional magnetic resonance imaging and calcium imaging, as it allows a unique temporal and spatial resolution and does not rely on genetically engineered organisms. However, the use of extracellular in vivo recordings is limited since it is an invasive technique that cannot be universally applied. In this article, a simple and easy to use method is presented with which it is possible to simultaneously record extracellular potentials such as local field potentials and multiunit activity at multiple sites of a network. It is detailed how a precise targeting of subcortical nuclei can be achieved using a combination of stereotactic surgery and online analysis of multi-unit recordings. Thus, it is demonstrated, how a complete network such as the hyperdirect cortico-basal ganglia loop can be studied in anesthetized animals in vivo.

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

In this study, the methodology is presented on how to perform multi-site in vivo electrophysiological recordings from the hyperdirect pathway under urethane anesthesia.

חַד<em&gt; בויבו</em&gt; הקלטות אלקטרו של הפוטנציאל שדה מקומי פעילות מרובת יחידות מן מסלול Hyperdirect ב חולדות הרדמה

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-כמו האסטרוציטים מאתר באמצעות פרוטוקול AWESAM מהירה, פשוטה וזולה

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...