עבודה זו ממומנת על ידי מענק NIH RR021905 P20-01, CF rpd מענק STANTO07R0, ועל נאס&quot;א מענק NNH09ZNE002C.

<img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. סכמטי לניתוח SESI-MS של נדיפים חיידקי. אמיץ של התרבות חיידקי שנעקרו על ידי CO 2 (1) החדרה התגובה SESI (2). כפי נדיפים לעבור את תא התגובה SESI כשהם עוברים דרך ענן electrospray ולהיות מיונן (3). מיונן פעם, נדיפים הם משכו לתוך ספקטרומטר מסה לניתוח (4). גז המוביל עודף נדיפים חיידקי unreacted הם עברו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר (5), כאמצעי הגנה נוספים, פרקו את מכסה המנוע כימי. הבלעה: מחט electrospray SESI הוא סיליקה נימי (40 מזהה מיקרומטר) עם קצה מחודד ומחט. כמו הפגנה של השימוש SESI-MS לאפיון של נדיפים חיידקים, E. coli K12 ו פ PAO1 aeruginosa הם מתורבתים aerobically ב 37 שעות במשך 24 מ&quot;ל ב 50 LB-לנוקס ° C ואת ספקטרום SESI-MS של נדיפים אמיץ נאספים 2 דקות. דו תחמוצת הפחמן (99.99%) בקצב זרימה של L 2 / min משמש הגז המוביל למסירה נדיפים לתא התגובה. תא התגובה SESI היה מנהג נבנה מצויד ה-API-3000 (SCIEX), להחליף את המקור יון electrospray. ספקטרה נאספים במצב יון חיובי באמצעות חומצה פורמית 0.1%, מתנול 5.0% ו 94.9% מים (v / v) כפתרון electrospray, שנשא 5 NL / s דרך סיליקה שאינו מוליך נימי עם קצה מחודד ומחט (40 מזהה מיקרומטר). המתח הוא מיושם 2.5 kV. 1.4.2 אנליסט תוכנה (Applied Biosystems) משמש לאיסוף נתונים עם הפרמטרים הבאים: 20-500 דה, MCA מצב, 40 סריקות, 3 s / סריקה, ו -2 דקות הזמן הכולל ניתוח. 1. Culturing מערכת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הכלי המתאים לגידול תרביות שלך, בהתחשב בדרישות הגידול של מינים של הניסוי שלך (למשל, אוורור אור, טמפרטורה וכו &#39;), כמו גם אספקה ​​יעילה של נדיפים כדי ספקטרומטר מסה. הבקבוקים תרבות אנחנו בוחרים להשתמש הם סטנדרטיים 100 מ&quot;ל פיירקס בקבוקי המדיה מצויד כמוסות הליכי כי יש לפחות שתי יציאות luer. קו היניקה מוחדר דרך בנמל אחד luer למסירה המוביל גז הבקבוק מדגם קו לשקע מוחדר דרך נמל אחר למסירה VOC אל המכשיר (איור 1). כל יציאות נוספות מחוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני culturing דגימות, לחצים על כלי שיט לצלול במים כדי לבדוק דליפות. דליפות גז הם הגורם העיקרי תוצאות טיפוסיות בצורת אותות חלשים או נעדרים יון נדיפים. </li></ol> 2. ניסוי ביולוגי: הגדרת הבטיחות שיקולים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבויות שלך בתנאים המתאימים ההשערה שלך. מומלץ כי לפחות שני ביולוגי משכפל, כל אחד עם שתי טכניות משכפל, משמשים עבור כל משתנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ריק עבור כל מצב התרבות (בינוני, אנטיביוטיקה, וכו &#39;) דגירה ריק באותם תנאים כמו דגימות שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעסיק אמצעי הבטיחות המתאימים גורמים ביולוגיים אתה משתמש, תוך התחשבות ברמת biosafety (ים) של המינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע זיהום של המכשיר שלך והעברת קווי גז עם גורמים ביולוגיים קיימא, להתקין פילטרים של גודל הנקבוביות המתאים לתוך הקו המוביל את הגז. המסננים לא יפריע להעברת נדיפים לתא התגובה SESI, אבל אולי מעט השפעה על יעילות העברת אירוסול. 6 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בלימה משנית או קבינט biosafety בעת צירוף את הכובע העברת הגז בקבוק התרבות שלך כדי להבטיח את הבלימה הנכונה במקרה של שפיכת גורמים ביולוגיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום הפסקת זרימת הגז המוביל אל בקבוק מדגם שלך בצורה לא תבנה הלחץ בתוך הבקבוק. </li></ol> 3. כלי אופטימיזציה הערה: SESI-MS היא תוכננה במיוחד כדי נדיפים המדגם, כך להגביל את השימוש ריחני פריטים טיפול אישי (למשל, מי קולון, מי פה, קרם לחות, מרכך), מסטיקים, סיגריות וכו &#39;לפני השימוש במכשיר. חזק כובע כל כימיקלים נדיפים במעבדה, ואוויר לשלוט טיוטות ככל האפשר במהלך הבדיקה. הפרמטרים הבאים אינסטרומנטלי, אשר משפיעים על עוצמת האות ואת היציבות, יהיה צורך אופטימיזציה עבור כלי הניסוי שלך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון electrospray וקצב הזרימה: בחר את הפתרון המתאים electrospray לשיעור של מולקולות ברצונך להתמקד, תוך לקיחה בחשבון את המכשיר ההפעלה הקוטביות (מצב חיובי או שלילי-ion) ואת האופי המולקולרי של תרכובות מטרה. בניסוי זה הפתרון electrospray הוא חומצה פורמית 0.1%, מתנול 5.0%, 94.9% מים (V / V), אשר משפר את עוצמת האות של מולקולות קוטביות פחות whilהדואר לספק יציבות אות טוב. הפתרון מועבר בקצב הזרימה של 5 NL / s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גז המוביל קצב זרימה: גז הספק קצב הזרימה יכולה להשפיע על יציבות electrospray ועוצמת האות. CO 2 (≥ 99.99%) בקצב זרימה של L 2 / min משמש כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צורת מחט ואת המיקום: קצה מחט הצורה ואת המיקום מאוד משפיע על עוצמת האות ויציבות. בעת התקנת מחט חדשה, המיקום של המחט צריך להיות מותאם כדי ליצור איזון בין הרקע נמוך, בעוצמה גבוהה אות אנליטי, ויציבות האות. על מנת לשחזר ספקטרה SESI לאחר שינוי מחט, יש צורך מעת לעת לגבות ספקטרה כפי שאתה להתאים את מיקום המחט עד שתוכלו להתאים את ספקטרום נצפתה הרשומות שלך. המרחק בין קצה מחט electrospray אל פתח spec המונית יהיה 1-5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתח יישומית: מתח המוחלת על המערכת משפיעה על עוצמת האות יון ואת היציבות של טיילור electrospray חרוט. בנוסף, מתח אופטימלית תלויה פתרון electrospray שלך ואת צורת קצה המחט. בתחילת הסדרה שלך של ניסויים, לקבוע את המתח כי התשואות ספקטרום אופטימלי ויציבות האות עבור המערכת שלך, ולאחר מכן להשתמש מתח עבור כל הניסויים הבאים. עבור המערכת שלנו, מתח של 2.0-5.0 kV לספק עוצמת האות אופטימלית ויציבות electrospray. לצורך ניסוי זה 2.5 kV משמש. </li></ol> 4. הפעלת וכוונון SESI-MS לניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין, על ידי הבטחת כי אספקת מתח מבוטלת וכי מערכת ריקה של חשמל. לעשות זאת על ידי 1) להבטיח את נוריות החיווי על אספקת מתח כבויים, 2) להבטיח את המתח על מודד הוא אפס, ו 3) הארקה מוביל חשמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את הפתרון המתאים electrospray עבור הניסוי שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל גז המוביל ולהגדיר את זרימת קצב המתאים עבור הניסוי שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל הלחץ המאגר electrospray ליזום את אספקת פתרון electrospray לתא התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את אספקת מתח ולהתאים את מתח לערך המתאים לניסויים שלך. </li></ol> הערה: בשלב זה משטחי מתכת מקור יינון מסוגלים לספק הלם מסוכן. תרגיל בזהירות רבה כאשר עובדים סביב המכשיר פעם אספקת מתח הופעל. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת שיטת כוונון לניטור ספקטרום SESI-MS תוך מכויל התאמות מתח מיושם. שימוש בפרמטרים הרכישה שיש לך אופטימיזציה עבור המערכת שלך הניסוי. נקה את ערוץ מרובים רכישה (MCA) תיבת הסימון (אם קיים) כדי לסרוק את כל הספקטרום מייצר עצמאית, לקבוע את זמן הרכישה עד 10 - 15 דקות, ולהתחיל את הרכישה. ספקטרה הרקע גז המוביל כעת אמור להיות שנצפו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את מכויל התאמות מתח להחיל להשיג chromatogram יציב יון הכולל (עוית) וסריקות לשחזור התואמים את ה-CO 2 סריקות לניסויים הקודמים שלך. לאחר התאמות מתח נעשו, ממשיכים לאסוף ספקטרה ועוד עוית ​​במשך חמש דקות, כדי להבטיח את המכשיר הוא התייצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר יציבות אינסטרומנטלי מובטחת, להגדיר את שיטת הרכישה, בהתאם דגימות שלך, כדי להתאים את זמן הרכישה, טווח הנתונים, ואת הבחירה MCA כנדרש. איסוף גז המוביל רקע ספקטרום עבור הרשומות שלך. </li></ol> 5. קבלת טביעת אצבע נדיף של התרבות חיידקי שלך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאסוף קשת ריק, לכוון את זרימת הגז המוביל דרך לעקוף את הקווים, ולאחר מכן לצרף את המדגם ריק (שסתומים סגורים) כדי להעביר קווי גז של המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את השסתומים כדי בקבוק המדגם, ולסגור את השסתומים של קווי מעקף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר מערכת לאזן למשך 30 שניות, במהלכן הלחות בחדר התגובה היא ייצוב. זו תקופה של איזון הכרחי להשגת ספקטרום לשחזור. על מנת להבטיח כי המערכת היא equilibrated, מומלץ לעקוב אחר עוית, אשר ישתנו במהלך תקופת איזון, ולייצב לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמערכת equilibrated, ליזום איסוף ספקטרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקשת נאסף, להסיר את הבקבוק מדגם קודם כל פתיחת גז המוביל קווי מעקף, ואז סגירת שסתומים מדגם, ולבסוף הסרת בקבוק המדגם. לרוקן את המערכת עם גז המוביל עבור 2-4 דקות, להסיר את הלחות נדיפים adsorbed מקווי ההעברה, למניעת המדגם ל-מדגם שריד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 5.2-5.5 עבור כל דגימה חיידקי, לסירוגין איסוף ספקטרום ריק נוסף כדי להבטיח חיסור ריק יסודית. חיסור ריק הושלמה יובילהמראה של רקע פסגות כימיים בספקטרום מעובד שלך המשותפים טכניקות יינון לחץ אטמוספרי, (למשל, פתלטים, סיליקון וכו &#39;). 9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר איסוף ספקטרום שלך, להבטיח את האותות יון לא לעבור את גבולות איתור ליניארי של המכשיר שלך, כפי שנקבע על ידי עוית ​​ואת עוצמתו המרבית של פסגות בודדים. יונים מעל המגבלות העליון של גלאי המכשיר שלך יכול לייצר פסגות חפץ, כי הם לא מדגם מייצג של שלך. </li></ol> 6. נציג תוצאות כדוגמה ספקטרה SESI-MS כי ניתן לקבל עבור נדיפים חיידקי, במצב חיובי יון טביעות אצבעות נדיפים עבור E. coli ו פ aeruginosa גדל aerobically במשך 24 שעות בתוך לנוקס LB ב 37 ° C מוצגים (איור 2). E. coli ספקטרום תנודתי נשלט על ידי אינדול ב m / z = 118, אשר נותן E. coli תרבויות ריח אופייני שלהם, ואילו הקשת של פ aeruginosa מכיל מגוון גדול יותר של פסגות protonatable. שים לב לעוצמות היחסי של פסגות בספקטרום נדיפים תלויים בפרמטרים אינסטרומנטלי המתואר בסעיף 3. פרמטרים אלה חייבים להיות מבוקרים היטב מניסוי לניסוי על מנת לקבל ספקטרום לשחזור. <img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2 בלנק, מחוסר יון חיובי במצב SESI-MS ספקטרה (20 - 150 מ &#39;/ z). של E. coli K12 ו פ aeruginosa PAO1 נדיפים לאחר צמיחה h 24 אירובית לנוקס LB ב 37 ° C. לפרטים נוספים על הפסגות שנצפתה הספקטרום SESI, אנא פנה אל ג&#39;ו, et al. 8.

<ol>
	<li>Fuerstenau, S., Kiselev, P., Fenn, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESI-MS+in+the+analysis+of+trace+species+in+gases.">ESI-MS in the analysis of trace species in gases.</a> , (1999).</li><li>Wu, C., Siems, W. F., Hill, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+electrospray+ionization+ion+mobility+spectrometry/mass+spectrometry+of+illicit+drugs.">Secondary electrospray ionization ion mobility spectrometry/mass spectrometry of illicit drugs.</a> Anal. Chem. 72, 396-403 (2000).</li><li>Tam, M., Hill, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+electrospray+ionization-ion+mobility+spectrometry+for+explosive+vapor+detection.">Secondary electrospray ionization-ion mobility spectrometry for explosive vapor detection.</a> Anal. Chem. 76, 2741-2747 (2004).</li><li>Martinez-Lozano, P., Rus, J., de la Mora, G. F., Hernandez, M., de la Mora, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+electrospray+ionization+(SESI)+of+ambient+vapors+for+explosive+detection+at+concentrations+below+parts+per+trillion.">Secondary electrospray ionization (SESI) of ambient vapors for explosive detection at concentrations below parts per trillion.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 287-294 (2009).</li><li>Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-line+detection+of+human+skin+vapors.">On-line detection of human skin vapors.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1060-1063 (2009).</li><li>Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+of+volatiles+in+breath.">Electrospray ionization of volatiles in breath.</a> Int. J. Mass Spectrom. 265, 68-72 (2007).</li><li>Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F., F, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+fatty+acid+vapors+in+breath+by+electrospray+ionization+and+atmospheric+pressure+ionization-mass+spectrometry.">Direct analysis of fatty acid vapors in breath by electrospray ionization and atmospheric pressure ionization-mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 80, 8210-8215 (2008).</li><li>Guo, X. H., Bruins, A. P., Covey, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+typical+chemical+background+interferences+in+atmospheric+pressure+ionization+liquid+chromatography-mass+spectrometry.">Characterization of typical chemical background interferences in atmospheric pressure ionization liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3145-3150 (2006).</li><li>Rudzinski, C. M., Herzig-Marx, R., Lin, J., Szpiro, A., Johnson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathogen detection using headspace analysis. , 16-16 (2004).</li><li>Lechner, M., Fille, M., Hausdorfer, J., Dierich, M., Rieder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+bacteria+in+vitro+by+mass+spectrometric+fingerprinting:+A+pilot+study.">Diagnosis of bacteria in vitro by mass spectrometric fingerprinting: A pilot study.</a> Curr. Microbiol. 51, 267-269 (2005).</li><li>Schulz, S., Dickschat, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+volatiles:+The+smell+of+small+organisms.">Bacterial volatiles: The smell of small organisms.</a> Nat. Prod. Rep. 24, 814-842 (2007).</li><li>Ligor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+for+breath+investigation.">Analytical methods for breath investigation.</a> Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 2-12 (2009).</li><li>Cao, W. Q., Duan, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breath+analysis:+Potential+for+clinical+diagnosis+and+exposure+assessment.">Breath analysis: Potential for clinical diagnosis and exposure assessment.</a> Clin. Chem. 52, 800-811 (2006).</li><li>Law, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+characterization+of+complex+viscous+liquids+at+the+molecular+level.">Rapid characterization of complex viscous liquids at the molecular level.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 8277-8280 (2009).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+analytes+from+cheese+products+for+fast+detection+using+neutral+desorption+extractive+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Sampling analytes from cheese products for fast detection using neutral desorption extractive electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal. Bioanal. Chem. 397, 1549-1556 (2010).</li><li>Fleming-Jones, M. E., Smith, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatile+organic+compounds+in+foods:+A+five+year+study.">Volatile organic compounds in foods: A five year study.</a> J. Agric. Food Chem. 51, 8120-8127 (2003).</li><li>Calkins, C. R., Hodgen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fresh+look+at+meat+flavor.">A fresh look at meat flavor.</a> Meat Sci. 77, 63-80 (2007).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

חיידקים לייצר שילובים שונים של נדיפים, אשר יכול להיות מנוצל לצורך זיהוי חיידקים 10-12 והערכת מצב מטבולי. השיטה SESI-MS המתואר כאן מספק אמצעי במהירות המאפיינת חיידקים נדיפים (תוך שתי דקות או פחות) בלי שום הכנה המדגם, יצירת &quot;טביעת אצבע&quot; חיידקי לזיהוי המין. 8 בעשורים האחרונים בלחץ אטמוספרי יינון אחרות טכניקות MS הוחלו על אפיון של תרכובות נדיפות, כולל צינור זרימת סלקטיבית יון (לנפות) ולהעביר פרוטון תגובה (PTR) ספקטרומטריית מסה. יתרון ייחודי זה מספק SESI על שיטות אלה יינון אחרות היא שזה אפשרי פסגות קטע ספציפי (בתנאי את הסוג המתאים של ספקטרומטר מסה הותאם SESI), המהווה כלי חשוב לזיהוי המתחם. אנחנו לא הכתובת הפיצול שיא בפרוטוקול המפורטים לעיל, אלא דוגמאות לאופן שבו מידע הפיצול ניתן להשתמש באפיון של חיידקי נדיפים, אנא פנה אל ג&#39;ו, et al. 8 SESI-MS יש השלכה ישירה על איתור באתרו של דלקות ריאות חיידקית באמצעות ניתוח נשימה, אבל יכול גם להיות מיושם על כל הגדרה אשר הדגימה נדיפים אפשרי. למשל, ניתוח של נדיפים בשתן, דם, נשימה, אשר רלוונטיים האבחון של הפרעות מטבוליות, מחלות סרטן gastroenteric, וחשיפה סביבתית, הם גם מתאים SESI-MS. 13,14 SESI-MS יש גם מגוון רחב של יישומים שאינם קליניים טביעת אצבע VOC, כולל ניתוח מהיר של מזונות עבור נדיפים מאפיין הקשורים הבשלה, הזדקנות, או מקלקל. 15-18

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> חומר שם </td><td> סוג </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> הערה </td></tr><tr><td> API-3000 טריפל quadrupole </td><td> מכשיר </td><td> SCIEX </td><td></td><td> נרכש עם אנליסט 1.4.2 (Applied Biosystems) </td></tr><tr><td> SESI מקור יון </td><td> מכשיר </td><td></td><td></td><td> מחוייט, ראה התייחסות 6 </td></tr><tr><td> זרימת גז מטר </td><td> ציוד </td><td> קול, בן הזוג </td><td> EW-03217-74 </td><td></td></tr><tr><td> פחמן דו חמצני </td><td> ציוד </td><td> Airgas </td><td> CD I300 </td><td> ≥ 99.99% טהור </td></tr><tr><td> חנקן </td><td> ציוד </td><td> Airgas </td><td> NI UHP300 </td><td> טוהר גבוהה במיוחד </td></tr><tr><td> 100 מ&quot;ל ובקבוקי זכוכית התקשורת </td><td> ציוד </td><td> VWR </td><td> 89012-114 </td><td> GL45 בורג האשכולות </td></tr><tr><td> בקבוק כמוסות עם יציאות luer </td><td> ציוד </td><td> Bio Chem fluidics </td><td> 00945T-3 </td><td> שווי הרכבה </td></tr><tr><td> Luer המתחבר ליציאת </td><td> ציוד </td><td> Bio Chem fluidics </td><td> 009LP </td><td> שווי הרכבה </td></tr><tr><td> Tubing 1 / 4 &quot;(OD) x 1 / 8&quot; (ID) </td><td> ציוד </td><td> קול, בן הזוג </td><td> EW-95875-02 </td><td> שווי הרכבה &amp; להעביר קווי גז </td></tr><tr><td> Tubing 1 / 8 &quot;(OD) x 1 / 16&quot; (ID) </td><td> ציוד </td><td> קול, בן הזוג </td><td> EW-06605-27 </td><td> שווי הרכבה </td></tr><tr><td> דו דרך שסתומים </td><td> ציוד </td><td> קול, בן הזוג </td><td> 07391-04 </td><td> שווי הרכבה </td></tr><tr><td> סנן כיתה AAQ </td><td> ציוד </td><td> Balston מסננים </td><td> 9922-05 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה פורמית, LC / MS כיתה </td><td> מגיב </td><td> דיג </td><td> A117-05AMP </td><td> Electrospray פתרון </td></tr><tr><td> , מתנול LC / MS כיתה </td><td> מגיב </td><td> דיג </td><td> A456-500 </td><td> Electrospray פתרון </td></tr><tr><td> מים, LC / MS כיתה </td><td> מגיב </td><td> דיג </td><td> W6-500 </td><td> Electrospray פתרון </td></tr></tbody></table>

characterizing bacterial volatiles using secondary electrospray ionization mass spectrometry (sesi-ms)

משני יינון electrospray ספקטרומטריית מסה (SESI-MS) היא שיטה שפותחה לצורך זיהוי מהיר של תרכובות נדיפות, ללא צורך המקדים המדגם. השיטה תוארה לראשונה על ידי פן ועמיתיו 1 ו הוחל זיהוי של סמים וחומרי נפץ 2 3-4, אפיון של נדיפים עור 5, ועל ניתוח נשימה 6-7. יינון SESI מתרחשת על ידי העברת תגובות בין פרוטון הפתרון electrospray ואת אנליטי תנודתי, ולכן הוא מתאים לניתוח הטרו מולקולות אורגניות, בדיוק כמו יינון electrospray המסורתית (ESI). עם זאת, בניגוד ESI סטנדרטי, העברת הפרוטון תהליך SESI מתרחשת בשלב אדי ולא הפתרון (איור 1), ולכן SESI הוא המתאים ביותר לאיתור נדיפים אורגניים אירוסולים. אנחנו מרחיבים את השימוש SESI-MS על זיהוי של נדיפים חיידקי כשיטה לזיהוי החיידק ואפיון 8. אנחנו הוכיחו כי SESI-MS טביעת אצבע נדיפים, בשילוב עם שיטת ניתוח סטטיסטי, יכול לשמש כדי להבדיל בין סוגים חיידקי, מין, ותרבויות מעורבת במגוון רחב של מדיה צמיחה. 8 הנה אנו מספקים את הצעדים להשגת טביעות אצבעות נדיפים חיידקי באמצעות SESI -MS, כולל פרמטרים אינסטרומנטלי כי צריך להיות מותאם על מנת להבטיח זיהוי חיידקים אפיון חזקים.

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS at JoVE.com

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

משני יינון electrospray ספקטרומטריית מסה (SESI-MS) מאפשרת זיהוי של תרכובות אורגניות נדיפות (VOCs) ללא צורך המקדים כל המדגם. פרוטוקול זה מספק הוראות לאפיון (בתוך דקות) המהירה של VOCs חיידקי באמצעות SESI-MS.

נדיפים חיידקית משנית אפיון באמצעות Ionization electrospray ספקטרומטריית מסה (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

characterizing-bacterial-volatiles-using-secondary-electrospray

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

17.9K Views.  University of Vermont. משני יינון electrospray ספקטרומטריית מסה (SESI-MS) מאפשרת זיהוי של תרכובות אורגניות נדיפות (VOCs) ללא צורך המקדים כל המדגם. פרוטוקול זה מספק הוראות לאפיון (בתוך דקות) המהירה של VOCs חיידקי באמצעות SESI-MS.

Video: Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

ליפידים מיצוי נייד עבור דילול ממוקד איזוטופ יציב ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית-Mass

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

גילוי חיידקים וזיהוי באמצעות חיישנים אלקטרוכימיים

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

הדמיה של רקמות ביולוגיות על ידי Desorption electrospray יינון המוני ספקטרומטריית

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

לדוגמא הכנת אסטרטגיות להדמית ספקטרומטריית המסה של מודלי תרבית תאי 3D

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in complex mixtures. It is often used to analyze gasoline, jet fuel, diesel, bio-diesel and the organic fraction of bio-crude/bio-oil. In most of those analyses, the first dimension of separation is non-polar, followed by a polar separation. The aqueous fractions of bio-crude and other aqueous samples from biofuels production have been examined with similar column combinations. However, sample preparation techniques such as derivatization, solvent extraction, and solid-phase extraction were necessary prior to analysis. In this study, aqueous fractions obtained from the hydrothermal liquefaction of algae were characterized by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry without prior sample preparation techniques using a polar separation in the first dimension followed by a non-polar separation in the second. Two-dimensional plots from this analysis were compared with those obtained from the more traditional column configuration. Results from qualitative characterization of the aqueous fractions of algal bio-crude are discussed in detail. The advantages of using a polar separation followed by a non-polar separation for characterization of organics in aqueous samples by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry are highlighted.

A two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method is described for characterization of the aqueous fraction of bio-crude produced from hydrothermal liquefaction of algae. This protocol can also be employed to analyze the aqueous fraction of liquid products from fast pyrolysis, catalytic fast pyrolysis, catalytic deoxygenation and hydro-treating.

אפיון איכותי של השבר מימית מ הידרותרמיות עיבוי של אצות באמצעות גז כרומטוגרפיה 2D עם זמן של הטיסה ספקטרומטריית מסה

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

הדמיה של כל הגוף ספקטרומטריית מסה על ידי אינפרא אדום מטריקס בסיוע לייזר Desorption electrospray יינון (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

אפיון נדידת תאים בתוך תלת מימדי במבחנה פצע סביבות

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

הנדסת קרינה פלואורסצנטית 'הזהב' על-ידי הלחץ הסלקטיבי התאגדות של חומצות אמינו קאנונית, אנליזת חלבונים באמצעות ספקטרומטר מסה, קרינה פלואורסצנטית

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria can undergo changes in the physiology due to the exposure to host growth environment and the presence of the host cells. We developed an assay to rapidly measure the virulence state of bacteria that minimize the extent to which bacteria grow in the presence of host cells. Bacteria and amoebae are mixed together and immobilized on a single imaging plane using an agar pad. The procedure uses single-cell fluorescence imaging with calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) as an indicator of host cell health. The fluorescence of host cells is analyzed after 1 h of exposure of host cells to bacteria using epifluorescence microscopy. Image analysis software is used to compute a host killing index. This method has been used to measure virulence within planktonic and surface-attached Pseudomonas aeruginosa sub-populations during the initial stage of biofilm formation and may be adapted to other bacteria and other stages of biofilm growth. This protocol provides a rapid and robust method of measuring virulence and avoids many of the complexities associated with the growth and maintenance of mammalian cell lines. Virulence phenotypes measured here using amoebae have also been validated using mouse macrophages. In particular, this assay was used to establish that surface attachment upregulates virulence in P. aeruginosa.

Here, we present a protocol to measure the virulence of planktonic or surface-attached bacteria using D. discoideum (amoeba) as a host. Virulence is measured over a period of 1 h and host killing is quantified using fluorescence microscopy and image analysis. We demonstrate this protocol using the bacterium P. aeruginosa.

וזמינותו התקפה אלימה חיידקי מהירה מבוססת תמונה באמצעות אמבה

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

הכנת חלבון הפקת תאים סינתטיים באמצעות שולפת תא חינם בקטריאלי, ליפוזומים והעברת אמולסיה

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...