מחקר זה מומן בחלקו על ידי תוכנית המחקר עירונית של המוסד הלאומי לסרטן.

1. תרבית תאים ותחזוקה של רדום גרורתי שורות תאים סרטניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים סרטניים רדומים (D2OR / MCF7/K7M2-AS.46) ו גרורתית (D2A1 / MDA-MB-231 / K7M2) ב 10 תרבות צלחות ס&quot;מ המכיל בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) גלוקוז גבוהה ו -10% בסרום שור עוברית ( FBS) ואנטיביוטיקה. לאחר שהתאים מגיעים מפגש 70-80%, המשך מבחני הבאה. </li></ol> 2. התפשטות תאים assay של תאים סרטניים רדומים (שקט) ו גרורתית (מתרבים) בתרבית מערכת 3D-BME Culturing תאים רדומים / גרורתית במערכת 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי Cultrex גורם הגדילה מופחת מרתף ממברנה חלץ (BME) ב 4 ° C במקרר לילה לפני ביצוע assay. שים לב BME יש לנהוג על קרח בכל עת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, במקום צלחת 96 היטב על מגש של קרח בתוך ברדס למינרית. מעיל אחד טוב עם 50-100μl של BME קרח קר באמצעות מתקן עם מזרק. ודא שאין בועות נוצרות הבארות. מניחים את צלחת 96 גם מצופה ב BME חממה humidified עם 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים לשאוב התקשורת של תאים סרטניים רדומים או גרורתי (מוכן בסעיף 1). לשטוף צלחות תרבות עם 10 מ&quot;ל בופר פוספט pH מלוחים, 7.4 (PBS). לשאוב PBS ולהוסיף 2ml טריפסין מראש התחמם ב 37 מעלות צלזיוס, על צלחות תרבות. דגירה צלחות של 5% CO 2 humidified על 37 מעלות צלזיוס, במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים צינור חרוטי 15 מ&quot;ל המכיל 5 מ&quot;ל של גלוקוז DMEM גבוהה בתוספת FCS ואנטיביוטיקה 10% לספור את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין את מספר הסלולרי הכולל להיות מתורבת בצנטריפוגה תרבות רקמות במהירות של 1500g, בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. ב מבחני שלנו אנו מכינים 2x10 3 תאים / גם עבור כל קו התא או נקודת זמן כדי להיבחן. עם זאת, זה עשוי להשתנות בהתאם לקווי תא בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant. שימו לב, ברוב המקרים גלולה אינה גלויה. לכן, להשאיר מאחורי התקשורת. לחץ על החלק התחתון של צינור חרוטי 15 מ&quot;ל עם האצבעות על מנת להבטיח כי השעיה של תאים בודדים מתקבל. Re-להשעות את גלולה עם גלוקוז DMEM נמוך עם אנטיביוטיקה בתוספת 2% FCS BME + 2% (assay התקשורת). 100 μl של התקשורת assay יש להוסיף עבור כל 3 תאים 2x10. Triturate התאים פעמים רבות עם פיפטה 5 מ&quot;ל להבטיח כי ההשעיה תא יחיד נשמרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100μl פלייט של התערובת לכל תא היטב על גבי צלחת 96 מצופה היטב BME. לצורך ההערכה רקע (בסעיף 2.8) צלחת 100μl בנוסף לכל היטב רק התקשורת assay על גבי צלחת 96 מצופה BME היטב. דגירה מתורבת 96 צלחות היטב humidified 5% CO 2 באינקובטור ב 37 ° C. תאים צריך להיות מחדש נמאס כל 4 ימים עם התקשורת assay. </li></ol> הפצת assay: <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay הפצתו של התאים: להוסיף את הבארות בזמן הרצוי נקודות 20 μl של תאים titer 96 מימית פתרון אחד ערכת התפשטות תאים assay. מדגירים את humidified 5% CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות 2h. שימוש Reader פלייט אליסה להקליט את ספיגת ב 490nm. לצורך ההערכה רקע וחיסור, להוסיף 20μl של titer תא 96 מימית פתרון אחד ערכת התפשטות תאים assay כדי מצופה מראש בארות עם BME ויצף רק עם התקשורת assay. שימוש Reader פלייט אליסה להקליט את ספיגת ב 490 ננומטר. </li></ol> 3. מכתים Immunofluorescent עבור התא מולקולות איתות (שקט) תאים רדומים הגידול ו / או גרורתי (מתרבים) תאים סרטניים Culturing תאים רדומים / גרורתית במערכת 3D עבור מכתים immunfluorescence * פרוטוקול הבא הוא שינוי של הפרוטוקול תרבות 3D בהוצאת Debnath J ואח&#39; 18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן BME כמתואר בסעיף 2.1. למחרת: מקום 8-קאמרית שקופיות מערכת זכוכית על מגש של קרח בתוך ברדס למינרית. מעיל טוב עם כל 50ul של BME קרים כקרח באמצעות pipetman 200μl. ודא BME הוא להתפשט באופן שווה וללא בועות נוצרות הבארות. הנח את זכוכית חדר 8 שקופיות מצופה BME ב CO של 5% humidified 2 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים רדומים או גרורתי מסעיף 1 ולהכין לתרבות, כמתואר בסעיף 2.3-2.4. אסוף את המספר הכולל של תאים בתרבית להיות צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. אנחנו מכינים 5 x10 3 תאים / היטב עבור כל שורה התא נקודת זמן כדי להיבחן. ספין למטה התאים בצנטריפוגה רקמות התרבות במהירות של 1500g, בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. לשאוב supernate בזהירות. שים לב גלולה אינה גלויה, ולכן להשאיר כמה התקשורת מאחור. לחץ על החלק התחתון של צינור חרוטי 15 מ&quot;ל עם האצבעות על מנת להבטיח כי השעיה תא בודד מתקבל.Re-להשעות את גלולה עם התקשורת assay. 400μl של התקשורת assay יש להוסיף עבור כל 3 תאים 5x10. Triturate התאים פעמים רבות עם פיפטה 5 מ&quot;ל. שלב זה חשוב מאוד כדי להבטיח כי ההשעיה תא יחיד נשמרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 400μl של התערובת לכל תא היטב על גבי כל אחד 8 חדרים מצופה BME. דגירה תרבותי 8 לתאי מערכת שקופיות הזכוכית humidified 5% CO 2 באינקובטור ב 37 ° C. תאים צריך להיות מחדש נמאס כל 4 ימים עם התקשורת assay. </li></ol> Immunofluorescence מכתים: <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודות הזמן הרצוי, לשאוב את השכבה העליונה של התקשורת ולהוסיף 200μl של מקבע Paraformaldehyde המכיל 4% (PFA), סוכרוז 5% ו 0.1% Triton X-100 ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. לשאוב מקבע ולהוסיף 200μl של PFA 4% סוכרוז המכיל 5% ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב מקבע, מוסיפים 400 μl של בופר פוספט (PBS) היטב כל אחד. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשאוב PBS ולהוסיף 400 μ PBS המכיל 0.05% Tween 20 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק תאים קבוע בטמפרטורת החדר עם 200μl של חמור או בסרום של 10% או 3% עם BSA עבור 1hour (חסימת פתרון לשמש יש לקבוע באופן אמפירי עבור כל נוגדן ראשוני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הפתרון חוסם ולהוסיף 200μl של הנוגדן הראשוני (דילול צריך להיקבע באופן אמפירי עבור כל נוגדן ראשוני לשמש). לדלל את הנוגדן העיקרי בסרום חמור של 10% אם 10% חמור בדם שימש חסימה או לדלל הנוגדן העיקרי BSA 3% 3% אם פתרון BSA חסימת היה בשימוש. דגירה עם הנוגדן העיקרי בין לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הנוגדן, לשטוף את הבארות עם 400μl PBS במשך 15 דקות וחזור פעמיים. לשאוב PBS ולהוסיף 200μl חמור נגד המיוחסים-IgG מצומדות כדי rhodamine אדום (דילול צריך להיקבע באופן אמפירי), לכסות את השקופית 8 קאמרית עם רדיד אלומיניום דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבארות עם 400μl PBS (3x15 דקות כל אחד לשטוף). לשאוב PBS. רכוב עם VECTASHIELD הרכבה בינונית עם DAPI. מגלשות יבש במשך 40 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. שקופיות יכולים להישמר במשך שבוע 1 ב 4 ° C. אחסן את השקופיות בחושך. תמונה שקופיות באמצעות מיקרוסקופיה confocal. </li></ol> 4. נציג תוצאות: דוגמה לניתוח התפשטות של D2.0R רדום גרורתי D2A1 תאים סרטניים בתרבות 3D מוצג באיור 1 א. תאים D2.0R הם רדומים (שקט) דרך כל התקופה ניסיוני 14 תרבות יום ואילו גרורתי מאוד D2A1 התאים נשארים רדומים רק 4-6 ימים לאחר מכן הם מתחילים להתרבות. במהלך השלב הראשוני רדומים, תאים רבים להישאר בודד בתרבות 3-D (איור 1B, יום 4) ואילו תאים שאינם מתרבים אחרים בצורה רב הסלולר spheroids. המעבר של D2A1 תאים רדומים המדינה שגשוג בתרבות 3-D (איור 1B, יום 12) קשורה עם שינויים דרמטיים מורפולוגיה התא. לפיכך, assay זה יכול לשמש כדי לבחון מה גורם / s עלול לעורר תאים רדומים D2.0R לצאת ממצב רדום שלהם ומה גורם / ים עשוי למנוע D2A1 תאים המעבר ממצב רדום שלהם. איור 2 הוא דוגמה של סוכן מניעת D2A1 תאים רדומים המעבר למצב שגשוג. כמוצג באיור 2, טיפולים של D2A1 תאים עם מעכב ספציפי של קינאז אור שרירן רשת (ML-7) שמרו D2A1 בתאים במצב רדום. תא האיתות של תאים סרטניים בתרבית רדום מתרבים במערכת 3D ניתן ללמוד על ידי מכתים immunofluorescence עבור מולקולות התא איתות. כמוצג באיור 3 עלייה משמעותית זרחון שרשרת שרירן אור D2A1 תאים (כתמים אדומים) ואחריו ארגון מחדש של ה-F-אקטין חוטים ויוצרים מתח סיבי אקטין (כתמים ירוקים) מתרחשת במהלך המעבר שלהם תרדמת (1-4 ימים) כדי התפשטות (יום 7). עם זאת, חסימת שרשרת שרירן אור קינאז פעילות D2A1 תאים על ידי shRNA או תרופה מסוימת (ML-7) שומרת D2A1 בתאים במצב רדום תוצאות עיכוב זרחון שרשרת שרירן אור F-אקטין סיבים מתח הארגון (איור 4). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig1.jpg" /> באיור 1. במודל חוץ גופית ללמוד הגידול בודד תא רדום והמעבר לצמיחה גרורתי. א) הפצת D2.0R רדום גרורתי D2A1 ב 3-D Cultrex BME, n = 8 (ממוצע ± SE). תוצאות נציג של שלושה ניסויים (* p ≤ 0.05). ב) תמונות במיקרוסקופ אור D2.0R ו D2A1 תאים בתרבית בתוך 3-D X20 Cultrex BME ההגדלה.איור שונה מן ברקן ואח&#39; 17. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig2.jpg" /> איור 2. מניעת מעבר של D2A1 תאים רדומים (קפאון) לשגשוג במערכת התרבות 3D על ידי עיכוב קינאז אור שרירן שרשרת (MLCK). כמובן זמן של התפשטות תאים בתרבית D2A1 3-D Cultrex BME, n = 8 (ממוצע ± SE). תאים היו מטופלים (שליטה), או שטופלו מעכב ספציפי של MLCK (ML-7, 5 מיקרומטר) לתחילת 48 שעות ביום תרבות 5. איור שונה מן ברקן ואח&#39; 17. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig3.jpg" /> איור 3. זירחון שרירן שרשרת אור ואחריו ארגון מחדש F-אקטין במהלך המתג של D2A1 תאים רדומים לצמיחה שגשוג. D2A1 התאים בתרבית 3-D Cultrex BME בשקופית 8 זכוכית קאמרית. תאים קובעו ונצבעו עם DAPI (כחול) עבור לוקליזציה גרעיני, phalloidin (ירוק) עבור מטוסי F-אקטין עם נוגדן נגד בצורת פוספורילציה של שרשרת אור שרירן (MLC-p) (אדום), כפי בנקודות זמן שונות. מיזוג של אקטין-f, ו-p מכתים MLC (צהוב). הביטוי של MLC-p הוגדל במהלך המעבר של D2A1 תאים רדומים (days1-4) צמיחה שגשוג (יום 7) ואחריו היווצרות מתח סיב אקטין (חיצים). מיקרוסקופיה confocal, הגדלה x63. לבן בר שווה 20 מיקרון. איור שונה מן ברקן ואח&#39; 17. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig4.jpg" /> איור 4. . עיכוב של קינאז אור שרירן שרשרת (MLCK) סיבים בתיווך F-אקטין מתח היווצרות של תאים D2A1 D2A1 תאים היו מטופלים (שליטה), או שטופלו במעכבי עבור MLCK (ML-7, 5 מיקרומטר), על תחילת 48 שעות ביום תרבות 5, או שטופלו מקושקשות או MLCK shRNA ומוכתמת לטופס פוספורילציה של שרשרת אור שרירן (MLC-p) (אדום), F-אקטין (ירוק), גרעינים (כחול). מיזוג של אקטין-f, ו-p מכתים MLC (צהוב). מיקרוסקופיה confocal, הגדלה x63. לבן בר שווה 20 מיקרון.

<ol>
	<li>Aguirre-Ghiso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models,+mechanisms+and+clinical+evidence+for+cancer+dormancy.">Models, mechanisms and clinical evidence for cancer dormancy.</a> Nat Rev Cancer. 7, 834-846 (2007).</li><li>Pantel, K., Woelfle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micrometastasis+in+breast+cancer+and+other+solid+tumors.">Micrometastasis in breast cancer and other solid tumors.</a> J Biol Regul Homeost Agents. 18, 120-125 (2004).</li><li>Naumov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffectiveness+of+doxorubicin+treatment+on+solitary+dormant+mammary+carcinoma+cells+or+late-developing+metastases.">Ineffectiveness of doxorubicin treatment on solitary dormant mammary carcinoma cells or late-developing metastases.</a> Breast Cancer Res Treat. 82, 199-206 (2003).</li><li>Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Framework+models+of+tumor+dormancy+from+patient-derived+observations.">Framework models of tumor dormancy from patient-derived observations.</a> Curr Opin Genet Dev. , (2010).</li><li>Naumov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+solitary+mammary+carcinoma+cells+in+a+secondary+site:+a+possible+contributor+to+dormancy.">Persistence of solitary mammary carcinoma cells in a secondary site: a possible contributor to dormancy.</a> Cancer Res. 62, 2162-2168 (2002).</li><li>Townson, J. L., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dormancy+of+solitary+metastatic+cells.">Dormancy of solitary metastatic cells.</a> Cell Cycle. 5, 1744-1750 (2006).</li><li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites.">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).</li><li>Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+proliferation-associated+molecules+in+individual+micrometastatic+carcinoma+cells.">Differential expression of proliferation-associated molecules in individual micrometastatic carcinoma cells.</a> J Natl Cancer Inst. 85, 1419-1424 (1993).</li><li>Demicheli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+dormancy:+findings+and+hypotheses+from+clinical+research+on+breast+cancer.">Tumour dormancy: findings and hypotheses from clinical research on breast cancer.</a> Semin Cancer Biol. 11, 297-306 (2001).</li><li>Braun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pooled+analysis+of+bone+marrow+micrometastasis+in+breast+cancer.">A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer.</a> N Engl J Med. 353, 793-802 (2005).</li><li>Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+micrometastases.">Cancer micrometastases.</a> Nat Rev Clin Oncol. 6, 339-351 (2009).</li><li>Goss, P. E., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+tumour+dormancy+offer+a+therapeutic+target.">Does tumour dormancy offer a therapeutic target.</a> Nat Rev Cancer. 10, 871-877 (2010).</li><li>Mendoza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+biology+and+therapy+in+real+time+in+the+mouse+lung.">Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung.</a> J Clin Invest. 120, 2979-2988 (2010).</li><li>Naumov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+human+tumor+dormancy:+an+angiogenic+switch+from+the+nonangiogenic+phenotype.">A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype.</a> J Natl Cancer Inst. 98, 316-325 (2006).</li><li>Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+growth+from+dormant+cells+induced+by+a+col-I-enriched+fibrotic+environment.">Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment.</a> Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).</li><li>Barkan, D., Green, J. E., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix:+A+gatekeeper+in+the+transition+from+dormancy+to+metastatic+growth.">Extracellular matrix: A gatekeeper in the transition from dormancy to metastatic growth.</a> Eur J Cancer. , (2010).</li><li>Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+metastatic+outgrowth+from+single+dormant+tumor+cells+by+targeting+the+cytoskeleton.">Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton.</a> Cancer Res. 68, 6241-6250 (2008).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30, 256-268 (2003).</li><li>Morris, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+carcinoma+cell+lines+of+high+and+low+metastatic+potential+differ+not+in+extravasation+but+in+subsequent+migration+and+growth.">Mammary carcinoma cell lines of high and low metastatic potential differ not in extravasation but in subsequent migration and growth.</a> Clin Exp Metastasis. 12, 357-367 (1994).</li><li>Khanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane-cytoskeleton+linker+ezrin+is+necessary+for+osteosarcoma+metastasis.">The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis.</a> Nat Med. 10, 182-186 (2004).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

המנגנונים ששומרים המופץ תאים סרטניים במצב רדום או תוצאה במעבר שלהם לצמיחה גרורתי אינם ידועים ברובם. תופעה זו כבר קשה מאוד ללמוד בחולים אנושיים 4,12 ו במודלים פרה כמה פותחו כדי לטפל בבעיה זו. עם זאת, כמה in vivo לשעבר vivo מערכות מודל תרדמת הגידול היה מאופיין (הנסקר...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> DMEM גלוקוז גבוה </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM נמוך גלוקוז </td><td> Invitrogen </td><td> 11885-092 </td><td></td></tr><tr><td> עוברית שור בסרום (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 10091-148 </td><td></td></tr><tr><td> גורם צמיחה מופחת ממברנה 3-D Cultrex חלץ מרתף </td><td> Trevigen בע&quot;מ </td><td></td><td> ריכוז חלבון בין 14-15mg/ml </td></tr><tr><td> D2.0R ו D2A1 שורות תאים </td><td></td><td></td><td> 5,19 </td></tr><tr><td> K7M2 ו K7M2AS1.46 תאים </td><td></td><td></td><td> 20 </td></tr><tr><td> MCF-7 ו מד&quot;א-MB-231 תאים סרטן השד </td><td> ATCC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 8 זכוכית תא שקופיות מערכת </td><td> (Lab-TEK, Thermo Scientific) </td><td> 177402 </td><td></td></tr><tr><td> תא titer 96 מימית פתרון אחד התפשטות תאים assay ערכת </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td> VECTASHIELD הרכבה בינונית עם DAPI </td><td> וקטור מעבדות בע&quot;מ </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> רגיל חמור בדם </td><td> ג&#39;קסון ImmunoResearch </td><td> 017-000-121 </td><td></td></tr><tr><td> אליסה פלייט Reader </td><td> Bio-Tec </td><td></td><td> שיא 490nm </td></tr><tr><td> Confocal מיקרוסקופ </td><td> Zeiss, LSM-510 </td><td></td><td> הגדלה x63 </td></tr></tbody></table>

an in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth

הישנות של סרטן השד לעיתים קרובות בעקבות תקופה סמויה ארוכה שבה אין סימנים של סרטן, גרורות לא נראות לעין קלינית עד שנים רבות לאחר הסרת הגידול הראשוני כטיפול משלים. הסבר סביר לתופעה זו הוא כי תאים סרטניים יש seeded אתרים גרורתי, עמידים לטיפולים קונבנציונליים, ולהישאר רדום במשך תקופות זמן ארוכות 1-4. קיומם של תאים סרטניים רדומים באתרים משני תוארה בעבר תאים בודד שקט שלא מתרבים ולא לעבור אפופטוזיס 5-7. יתר על כן, תאים אלה בודד הוכח להפיץ מן הגידול הראשוני בשלב מוקדם של 8-10 התקדמות המחלה ואת מתגוררים צמיחה נעצר במח העצם של החולים, הדם ואת בלוטות הלימפה 1,4,11. לכן, הבנת המנגנונים המווסתים תרדמת או לעבור למדינה שגשוג קריטית על גילוי מטרות הרומן התערבויות למניעת הישנות המחלה. עם זאת, התרת מנגנוני ויסות לעבור תרדמת הגידול בצמיחה גרורתי כבר הקשו על ידי היעדר מערכות מודל זמין. in vivo לשעבר מערכות vivo במודל כדי לחקור התפתחות גרורות של תאים סרטניים תוארו בעבר 1,12-14. אולם מערכות אלה מודל לא סיפקו בזמן אמת ובאופן גבוהה התפוקה תובנות מכניסטית לתוך מה מעורר את הופעתה של תאים סרטניים בודדים רדומים להתרבות כמו מחלה גרורתית. פיתחנו לאחרונה 3D במערכת במבחנה למודל במאפייני vivo צמיחה של תאים התנהגות רדום או גרורתי (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) או שגשוג (D2A1, מד&quot;א-MB-231, K7M2) in vivo. אנחנו הראו כי תאים סרטניים כי התערוכה תרדמת in vivo באתר גרורתי להישאר שקט כאשר בתרבית תמצית 3-ממד (3D) במרתף קרום (BME), ואילו התאים גרורתי מאוד in vivo ברצון להתרבות בתרבות 3D אחרי המשתנה, אבל קצר יחסית תקופות של קפאון. חשוב לציין כי על ידי שימוש במערכת מודל 3D במבחנה הראינו לראשונה כי בהרכב ECM ממלא תפקיד חשוב בוויסות אם תאים סרטניים רדומים יעבור למצב שגשוג ו אישרו זאת במחקרים vivo 15-17. לפיכך, מערכת מודל שתוארו בדו&quot;ח זה מספק שיטה חוץ גופית כדי תרדמת הגידול מודל ולחקור את המעבר לצמיחה שגשוג המושרה על ידי microenvironment.

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth at JoVE.com

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

שונה 3-D במבחנה מערכת מוצג אשר מאפיינים הצמיחה של מספר שורות תאים סרטניים קרום במרתף מחדש לתאם עם התנהגות רדום או שגשוג של תאים סרטניים באתר משנית גרורתי<em&gt; In vivo</em&gt;.

במבחנה מערכת לחקר תרדמת גידול ואת החלף ל גידול גרורתי

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

an-vitro-system-to-study-tumor-dormancy-switch-to-metastatic

Research

JoVE Journal

Medicine

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

15.8K Views.  University of Haifa. שונה 3-D במבחנה מערכת מוצג אשר מאפיינים הצמיחה של מספר שורות תאים סרטניים קרום במרתף מחדש לתאם עם התנהגות רדום או שגשוג של תאים סרטניים באתר משנית גרורתי In vivo.

Video: An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Utilizing Transcranial Magnetic Stimulation to Study the Human Neuromuscular System

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade. While the use of TMS has expanded to the study of many systems and processes during this time, the original application and perhaps one of the most common uses of TMS involves studying the physiology, plasticity and function of the human neuromuscular system. Single pulse TMS applied to the motor cortex excites pyramidal neurons transsynaptically 2 (Figure 1) and results in a measurable electromyographic response that can be used to study and evaluate the integrity and excitability of the corticospinal tract in humans 3. Additionally, recent advances in magnetic stimulation now allows for partitioning of cortical versus spinal excitability 4,5. For example, paired-pulse TMS can be used to assess intracortical facilitatory and inhibitory properties by combining a conditioning stimulus and a test stimulus at different interstimulus intervals 3,4,6-8. In this video article we will demonstrate the methodological and technical aspects of these techniques. Specifically, we will demonstrate single-pulse and paired-pulse TMS techniques as applied to the flexor carpi radialis (FCR) muscle as well as the erector spinae (ES) musculature. Our laboratory studies the FCR muscle as it is of interest to our research on the effects of wrist-hand cast immobilization on reduced muscle performance6,9, and we study the ES muscles due to these muscles clinical relevance as it relates to low back pain8. With this stated, we should note that TMS has been used to study many muscles of the hand, arm and legs, and should iterate that our demonstrations in the FCR and ES muscle groups are only selected examples of TMS being used to study the human neuromuscular system.

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive tool to gain insight on the physiology and function of the human nervous system. Here, we present our TMS techniques to study cortical excitability of the upper limb and lumbar musculature.

ניצול גירוי מגנטי Transcranial לחקר מערכת Neuromuscular האדם

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade.  While ...

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current estimates put the prevalence of amblyopia at approximately 1-3%1-3, the majority of cases being monocular2. Amblyopia is most frequently caused by ocular misalignment (strabismus), blur induced by unequal refractive error (anisometropia), and in some cases by form deprivation.
Although amblyopia is initially caused by abnormal visual input in infancy, once established, the visual deficit often remains when normal visual input has been restored using surgery and/or refractive correction. This is because amblyopia is the result of abnormal visual cortex development rather than a problem with the amblyopic eye itself4,5 . Amblyopia is characterized by both monocular and binocular deficits6,7 which include impaired visual acuity and poor or absent stereopsis respectively. The visual dysfunction in amblyopia is often associated with a strong suppression of the inputs from the amblyopic eye under binocular viewing conditions8. Recent work has indicated that suppression may play a central role in both the monocular and binocular deficits associated with amblyopia9,10 .
Current clinical tests for suppression tend to verify the presence or absence of suppression rather than giving a quantitative measurement of the degree of suppression. Here we describe a technique for measuring amblyopic suppression with a compact, portable device11,12 . The device consists of a laptop computer connected to a pair of virtual reality goggles. The novelty of the technique lies in the way we present visual stimuli to measure suppression. Stimuli are shown to the amblyopic eye at high contrast while the contrast of the stimuli shown to the non-amblyopic eye are varied. Patients perform a simple signal/noise task that allows for a precise measurement of the strength of excitatory binocular interactions. The contrast offset at which neither eye has a performance advantage is a measure of the "balance point" and is a direct measure of suppression. This technique has been validated psychophysically both in control13,14 and patient6,9,11 populations.
In addition to measuring suppression this technique also forms the basis of a novel form of treatment to decrease suppression over time and improve binocular and often monocular function in adult patients with amblyopia12,15,16 . This new treatment approach can be deployed either on the goggle system described above or on a specially modified iPod touch device15.

Amblyopia is a developmental disorder of the visual cortex that is often accompanied by strong suppression of one eye. We present a new technique for measuring and treating interocular suppression in patients with amblyopia that can be deployed using virtual reality goggles or a portable iPod Touch device.

המדידה והטיפול בדיכוי בעין עצלה

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

רומן ברזולוציה גבוהה<em&gt; בvivo</em&gt; טכניקת הדמיה כדי לחקור את התגובה דינמית של מבנים תוך גולגולתי לצמיחה גידול וTherapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

הזרקת orthotopic של תאי סרטן השד לחלב שומן Pad של עכברים לחקר התפתחות גידול.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

הקמת מודל xenograft מיאלומה נפוצה אדם בעוף לחקר צמיחת גידול, פלישה ואנגיוגנזה

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo לשעבר vivo גישות לחקר סרטן השחלות גרורתי התיישבות של מבני ספוט החלב בהצפק שומני

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

הזרקה של תאים syngeneic Murine מלנומה מנת לקבוע את פוטנציאל גרורתי שלהם בתוך הריאות

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

באמצעות הדמיה ברשתית ללמוד דמנציה

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Surgical Labyrinthectomy of the Rat to Study the Vestibular System

To study the vestibular system or the vestibular compensation process, a number of methods have been developed to cause vestibular damage, including surgical or chemical labyrinthectomy and vestibular neurectomy. Surgical labyrinthectomy is a relatively simple, reliable, and rapid method. Here, we describe the surgical technique for rat labyrinthectomy. A postauricular incision is made under general anesthesia to expose the external auditory canal and the tympanic membrane, after which the tympanic membrane and the ossicles are removed without the stapes. The stapes artery, which is located between the stapes and the oval window, is a vulnerable structure and must be preserved to obtain a clear surgical field. A hole to fenestrate the vestibule is made with a 2.1-mm drill bur superior to the stapes. Then, 100% ethanol is injected through this hole and aspirated several times. Meticulous dissection under a microscope and careful bleeding control are essential to obtain reliable results. Symptoms of vestibular loss, such as nystagmus, head tilting, and a rolling motion, are seen immediately after surgery. The rotarod or rotation chair test can be used to objectively and quantitatively evaluate the vestibular function.

This protocol describes the surgical labyrinthectomy of a rat, which is a useful method for studying the vestibular system.

Labyrinthectomy כירורגית של העכברוש ללמוד את מערכת שיווי המשקל

To study the vestibular system or the vestibular compensation process, a number of methods have been developed to cause vestibular damage, including ...

פרוטוקול Tuina סטנדרטי עבור מודל דחיסת DRG של חולדות

Analgesic Effect of Tuina on Rat Models with Compression of the Dorsal Root Ganglion Pain

Neuropathic pain is a prevalent condition that affects 6.9%-10% of the population and results from nerve damage due to various etiologies, such as lumbar disc herniation, spinal canal stenosis, and intervertebral foramen stenosis. Although Tuina, a traditional Chinese manual therapy, has shown analgesic effects in clinical practice for the treatment of neuropathic pain, its underlying neurobiological mechanisms remain unclear. Animal models are essential for elucidating the basic principles of Tuina. In this study, we propose a standardized Tuina protocol for rats with compression of the dorsal root ganglion (DRG), which involves inducing DRG compression by inserting a stainless steel rod into the intervertebral foramen, performing Tuina manipulation with specific parameters of location, intensity, and frequency in a controlled environment, and assessing the behavioral and histopathological outcomes of Tuina treatment. This article also discusses the potential clinical implications and limitations of the study and suggests directions for future research on Tuina.

מחבר זרקור: אפקט משכך כאבים של טווינה על מודלים של חולדות עם דחיסה של כאב גנגליון שורש הגב  

This article presents a manipulation for treating chronic compression of the dorsal root ganglion in rats using Tuina therapy, along with a method for evaluating its effectiveness based on pain behavior and histopathological results.

אפקט משכך כאבים של Tuina על מודלים חולדה עם דחיסה של כאב גנגליון שורש הגב

Neuropathic pain is a prevalent condition that affects 6.9%-10% of the population and results from nerve damage due to various etiologies, such as lumbar ...