תמיכה גרנט כוללת NHLBI HL080532, NHLBI HL073449, NCRR RR16453, ו לאומי AHA גרנט, פרס סיוע (עד RVs). תודה מיוחדת מורחב עיצוב מרחק הקורס (DCDC) Consulting Group, dcdcgroup.org, על עזרתם עם ייצור וידאו של משרד החינוך האמריקני גרנט מספר כי הקים את P336C050047 DCDC.

1. Microbubble הכנה מניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת 10 MLS של PBS לערבב 200 מ&quot;ג 1,2-dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphatidylcholine ו 50 מ&quot;ג 1,2-dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphatidylethanolamine עם 1 גרם גלוקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את התערובת על אמבט מים רותחים 20-30 דקות, פיפטה ערבוב כל 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים. </li></ol> 2. Microbubble הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 250 μl של פתרון מניות הכינו את microbubble ו לדגור על 40 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון מראש חימם microbubble הוא הועבר לאחר מכן microtube 1.5 מ&quot;ל המכיל 50 μl של גליצרול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1-2 מ&quot;ג מטוהרים DNA פלסמיד קידוד ביטוי לבנות עבור הגן של עניין (מטוהרים בדוגמה זו על ידי רעלן פנימי Qiagen חינם MegaPrep הערכה, Qiagen, ג&#39;רמנטאון, MD, עם ריכוז אופטימלי של 4mg/ml). 2.4) פוספט שנאגרו מלוחים מתווסף נפח סופי של μl 500. רעלן פנימי חינם maxipreps Qiagen משמשים, כמו גם PBS סטרילי כדי להבטיח סטריליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוויר ב microtube הוא החליף אז עם גז Octafluoropropane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microtube הוא מזועזע ואז במרץ amalgamator שיניים למשך 20 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדנ&quot;א subnatant שיורית המכיל חיץ שלא מאוגדים microbubbles לאחר מכן הסיר בזהירות את השכבה microbubble נשטף שלוש פעמים עם PBS סטרילי כדי להסיר את ה-DNA פנויות, והניח על הקרח בין כל מחזור כביסה. אנחנו בדרך כלל להשיג יעילות המחייב של 30-40%. ריאגנטים כל סטרילית וטיפול עשוי למזער את הזיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמיד דנ&quot;א מחויב microbubbles ממוקמות אז על הקרח עד שעתיים עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Subnatant להסיר microtube לאחר ערבוב PBS שוטף, ניתן להשתמש כדי לקבוע את הריכוז של ה-DNA מאוגד, וכן את כמות מחויב מבוסס על ריכוז ההתחלתי ידוע, על ידי מדידת צפיפות אופטית של פתרון זה באורך גל של 260nm באמצעות ספקטרופוטומטר. </li></ol> 3. ציוד כיול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש הראשון, 1 cavitation מתמר MHz צריך להיות מכויל על מנת להבטיח מדד מכני תקין החזרה הדופק. Submergible 1, MHz מתמר 13mm, ממוקד מחובר פונקציה של 20 MHz / Waveform Generator שרירותי באמצעות מגבר כוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתמר ממוקם במיכל פלסטיק מלא מים, שכוונה ישירות אל hydrophone, אשר חובר אוסצילוסקופ 500 MHz דרך מגבר תשלום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צורת גל, תדירות, משרעת, מחזור פרץ, והגברה כוח כל יכול להיות שונה כדי להשיג את מחזור תקין מדד מכני אופטימלי למער microbubbles. לצורך ניסוי זה בפרט, יש לנו לכייל את המערכת מדד מכני שווה ~ 1.3 מגה ב 1. </li></ol> 4. משלוח microbubble &amp; UTMD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הלידה microbubble ו UTMD, עכברים C57BL / 6 היו מורדמים עם 100mg/kg xylazine קטמין ו 5mg/kg באמצעות הזרקת ה-IP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משלוח microbubble היה בהזרקה לווריד לתוך החדר השמאלי של הלב או באמצעות צנתור וריד הזנב באמצעות הזרקה ישירה. עבור זריקה הלב ישירה, בנפח של עד 100 μl של פתרון ה-DNA טעון פלסמיד microbubble מוזרק דרך מחט 30 מד מוכנס אל המקום ה 4 הקדמי צלעי תחת הדמיית אולטרא לתוך החדר השמאלי של הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בולוס פתרון microbubble הנובע הזריקה interventricular שמאל דמיינו באמצעות Visual Sonics &#39;38 MHz בתדר גבוה מתמר אולטראסאונד להציב בעמדה נייח על החזה של העכבר בתצוגת ציר זמן באמצעות VisualSonics &quot;Vevo 2100 מערכת הדמיה. כל מזרקים ומחטים הם עקרים, מבטחת את הסביבה הסטרילית ביותר האפשרי עבור זריקות אלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר ההזרקה, הרס microbubble מתבצעת עבור ~ 5 דקות באמצעות שנייה, קטנה יותר בתדירות נמוכה בגודל 1.0 מתמר MHz שנערך ישירות על האיבר הרצוי, מיקוד חורבן לאזור זה. בדוגמה זו, אולטרסאונד היה מנוהל לכבד בתדירות הדופק החזרה של 1.0 מגה הרץ, עם המקבילה מדד מכני כ 1.3-1.5, וחזרה הדופק תקופה של 100 ms לכל 20 מחזורים. לחלופין, הדופק יכול להיות מגודרת על א.ק.ג. של העכבר (לא מוצג בניסוי הזה) כדי בפרץ של 3 מסגרות של אולטרסאונד, כל 4-6 מחזורים לב. אנו להשיג יעילות רבה יותר של transfection עם פרוטוקולים המאפשרים את המיטה נימי למלא עם בועות בין פרצי אולטרסאונד. </li></ol> 5. משלוח שיטה אלטרנטיבית בחרנו להדגיש את הזריקה interventricular בשל המורכבות של ההליך, אך במקרים רבים, כגון עירוי ממושך של microbubbles, וריד הזנבjection היא השיטה המועדפת. עבור שיטה זנב הווריד המסירה microbubble, העכבר הוא הרדים באותה דרך. מזרק המכיל את פלסמיד דנ&quot;א מחויב microbubbles מחובר קטטר 27 מחט / זנב מד וריד. קטטר וריד הזנב מוכנס לתוך השלישי דיסטלי של הוורידים או לרוחב ימינה או שמאלה, כי לאורך הזנב של העכבר. מזרק המכיל את microbubbles ממוקמת משאבת אינפוזיה באופן אוטומטי מנהלת נפח מראש אחיד של הפתרון על פני תקופה מוגדרת מראש של זמן. אנחנו בדרך כלל להשרות 200-300μl בשיעור של 3ml/hour. השימוש בבעלי חיים כל החיות טופלו בהתאם לנוהגים חיה טוב כפי שהוגדר על ידי הלאומית רלוונטי ו / או הרווחה המקומיות וגופים בעלי חיים, וכל העבודה חיה אושרה על ידי הוועדה המתאימה (אוניברסיטת הוואי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש, מספר אישור 07-100 -3). הרדמה המתאים (קטמין / zylazine) שימש כאבים (Bupivicaine ואת עצירות) היו זמינים, אך לא חובה. 6. נציג תוצאות: היעילות של משלוח UTMD בתיווך ה-DNA פלסמיד ניתן להעריך באמצעות מגוון רחב של שיטות בהתאם את הגנים המקודדים לבנות, כגון, אך לא מוגבל; בלוציפראז in vivo הדמיה, B-gal מכתים לשעבר vivo, ו / או immunohistology. בפרט, בתחום ההדמיה פליטת אור vivo מאפשר לפקח על נוכחות ומשך ביטוי גנים סדרתי בעכברים transfected בקידוד פלסמיד גן הכתב bioluminescent (בלוציפראז). Xenogen in vivo Imaging System (IVIS) (Caliper מדעי החיים, Hopkinton, MA) משמש הדמיה bioluminescent. תמונות נלקחים בדרך כלל של כל העכברים היום הראשון לאחר transfection בתיווך UTMD והוא חזר כל שלושה עד ארבעה ימים עד ביטוי גנים bioluminescent כבר לא להבחין ויזואלית באמצעות המערכת (איור 1). כדי להכין עכברים הדמיה bioluminescent, עכברים first לקבל זריקה IP של הכתב בלוציפראז בדיקה D-luciferin (Caliper מדעי החיים) והם אז הרדים ~ 3 דקות מאוחר יותר. Biodistribution המצע D-luciferin מותר להמשיך עבור ~ 10 דקות לפני החיה ממוקם הדמיה IVIS קאמרית סריקה מלאה דימוי גוף הוא נלקח. במהלך הרכישה, הפוטונים הנפלטים מן בלוציפראז גחלילית / D-luciferin תגובה פוטו נמדדים. איור 1 מדגים גם דומה הדמיה IVIS bioluminescent של הכבד הבאים UTMD, ואיור 2 הוא דימוי epifluorescence (100x) של הכבד transfected באמצעות נוגדן אנטי בלוציפראז הראשי (סיגמא אולדריץ) ו AlexFluor-568 נוגדנים משני מצומדות (Invitrogen) . ברור לראות כי transfection UTMD הכבד בתיווך השפיע לא רק בתאי האנדותל, אבל hepatocyes גם כן. <img src="/files/ftp_upload/2963/2963fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1 Xenogen / IVIS הדמיה של הלב UTMD העכברים שטופלו (א) עכבר בקרה שליליות:.. פלסמיד + PBS ואחריו הלב מופנה UTMD, (ב) עכבר טיפול: פלסמיד + microbubbles ואחריו הלב מופנה UTMD, ו (ג) עכבר טיפול : microbubbles + פלסמיד ואחריו הכבד ביים UTMD. <img src="/files/ftp_upload/2963/2963fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. אימונוהיסטוכימיה של הכבד UTMD (אנטי בלוציפראז באדום). (א) פלסמיד עם UTMD לא, (ב) פלסמיד עם UTMD. תמונה Confocal (100x); גרעינים כחולות DAPI מוכתם.

<ol>
	<li>Bekeredjian, R., Chen, S., Frenkel, P. A., Grayburn, P. A., Shohet, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-targeted+microbubble+destruction+can+repeatedly+direct+highly+specific+plasmid+expression+to+the+heart.">Ultrasound-targeted microbubble destruction can repeatedly direct highly specific plasmid expression to the heart.</a> Circulation. 108, 1022-1026 (2003).</li><li>Bekeredjian, R., Katus, H. A., Kuecherer, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+use+of+ultrasound+targeted+microbubble+destruction:+a+review+of+non-cardiac+applications.">Therapeutic use of ultrasound targeted microbubble destruction: a review of non-cardiac applications.</a> Ultraschall Med. 27, 134-140 (2006).</li><li>Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+pancreatic+islets+in+vivo+by+ultrasound-targeted+gene+therapy.">Regeneration of pancreatic islets in vivo by ultrasound-targeted gene therapy.</a> Gene Ther. 17, 1411-1420 (2010).</li><li>Miao, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+enhances+gene+delivery+of+human+factor+IX+plasmid.">Ultrasound enhances gene delivery of human factor IX plasmid.</a> Hum Gene Ther. 16, 893-905 (2005).</li><li>Shimoda, M., Chen, S., Noguchi, H., Matsumoto, S., Grayburn, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+non-viral+gene+delivery+of+human+vascular+endothelial+growth+factor+improves+revascularisation+and+restoration+of+euglycaemia+after+human+islet+transplantation+into+mouse+liver.">In vivo non-viral gene delivery of human vascular endothelial growth factor improves revascularisation and restoration of euglycaemia after human islet transplantation into mouse liver.</a> Diabetologia. 53, 1669-1679 (2010).</li><li>Shohet, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Echocardiographic+destruction+of+albumin+microbubbles+directs+gene+delivery+to+the+myocardium.">Echocardiographic destruction of albumin microbubbles directs gene delivery to the myocardium.</a> Circulation. 101, 2554-2556 (2000).</li><li>Sirsi, S., Borden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+Compositions,+Properties+and+Biomedical+Applications.">Microbubble Compositions, Properties and Biomedical Applications.</a> Bubble Sci Eng Technol. 1, 3-17 (2009).</li><li>Li, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-targeted+microbubble+destruction+enhances+AAV-mediated+gene+transfection+in+human+RPE+cells+in+vitro+and+rat+retina+in+vivo.">Ultrasound-targeted microbubble destruction enhances AAV-mediated gene transfection in human RPE cells in vitro and rat retina in vivo.</a> Gene Ther. 16, 1146-1153 (2009).</li><li>Lindner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubbles+in+medical+imaging:+current+applications+and+future+directions.">Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).</li><li>Newman, C. M., Bettinger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+progress+and+prospects:+ultrasound+for+gene+transfer.">Gene therapy progress and prospects: ultrasound for gene transfer.</a> Gene Ther. 14, 465-475 (2007).</li><li>Vancraeynest, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+injury+induced+by+ultrasound-targeted+microbubble+destruction:+evidence+for+the+contribution+of+myocardial+ischemia.">Myocardial injury induced by ultrasound-targeted microbubble destruction: evidence for the contribution of myocardial ischemia.</a> Ultrasound Med Biol. 35, 672-679 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

UTMD מייצג גישה חדשנית המסירה הגן. ככל שהטכנולוגיה פלטפורמה זה יכול להיות משולב עם כל אחד אסטרטגיות רבות בטיפול פוטנציאל גנטי, כדי לספק מספר עצום של מולקולות ביו כאשר רמה גבוהה של ייחוד הרקמה הרצויה. המגבלה העיקרית הביולוגי של הטכניקה היא יעילות נמוכה של transfection. שיקול ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב / ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> 1,2-dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphatidylcholine </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P-5911 </td><td> מרכיב של הקליפה השומנים microbubble </td></tr><tr><td> 1,2-dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphatidylethanolamine </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P-3275 </td><td> מרכיב של הקליפה השומנים microbubble </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> G5400 </td><td> חשבתי לייצב את microbubbles </td></tr><tr><td> פוספט שנאגרו מלוחים </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P5368 </td><td></td></tr><tr><td> גליצרול </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> G5516 </td><td> האמינו למנוע microbubbles מ התגבשו </td></tr><tr><td> Octafluoropropane גז </td><td> Airgas </td><td> N / A </td><td> גז אינרטי המשמש יישומים קליניים </td></tr><tr><td> VialMix שיניים amalgamator </td><td> Bristol-Myers Squibb </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 1 MHz, 13 מ&quot;מ, ממוקד מתמר </td><td> אולימפוס </td><td> A303S-SU </td><td></td></tr><tr><td> 20 MHz Function / Waveform Generator שרירותי </td><td> Agilent </td><td> 33220A </td><td></td></tr><tr><td> כוח מגבר </td><td> קרון-הייט ושות </td><td> דגם 7500 </td><td></td></tr><tr><td> Hydrophone </td><td> Bruel ו Kjaer </td><td> סוג 1803 </td><td></td></tr><tr><td> טעינת מגבר </td><td> Bruel ו Kjaer </td><td> סוג 2634 </td><td></td></tr><tr><td> 500 MHz אוסצילוסקופ </td><td> LeCroy </td><td> 9354L </td><td></td></tr><tr><td> VisualSonics &quot;Vevo 2100 Imaging System עם מתמר 34 MHz </td><td> VisualSonics </td><td> 2100 </td><td></td></tr><tr><td> 27G אינץ&#39; אחד וריד הזנב צנתרים </td><td> VisualSonics </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Genie פלוס משאבת עירוי </td><td> קנט מדעי </td><td> GENIE </td><td></td></tr></tbody></table>

introduction to the ultrasound targeted microbubble destruction technique

ב, מולקולות ביו UTMD, כגון מטען שלילי וקטורים DNA פלסמיד קידוד גן של עניין, מוסיפים את הקליפות קטיוני של השומנים סוכנים בניגוד microbubble 7-9. וקטור בעכברים נושאי אלה microbubbles ניתן בהזרקה לווריד או ישירות אל החדר השמאלי של הלב. אצל בעלי חיים גדולים יותר הם יכולים גם להיות חדורים דרך קטטר intracoronary. משלוח הבאים מהמחזור כדי איבר מטרה מתרחשת על ידי cavitation אקוסטי בתדר התהודה של microbubbles. סביר להניח כי אנרגיה מכנית שנוצר על ידי תוצאות ההרס microbubble במבנה הנקבוביות חולף או בין לתאי אנדותל של microvasculature האזור ממוקד 10. כתוצאה של השפעה זו sonoporation, יעילות transfection לתוך מעבר לתאי אנדותל היא משופרת transgene קידוד וקטורים מופקדים אל הרקמות המקיפות אותם. פלסמיד דנ&quot;א שנותרו במחזור במהירות מושפל על ידי nucleases בדם, אשר מקטין עוד יותר את הסבירות של משלוח אי - sonicated רקמות מוביל transfection היעד איברים ספציפיים מאוד.

Watch this Scientific Journal Video about Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique at JoVE.com

Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

הרס ממוקד אולטראסאונד microbubble (UTMD) יכול לשמש ישירה באתר ספציפי משלוח של מולקולות ביו, כולל גנים טיפוליים, כדי למקד את האיברים נגישים אולטרסאונד, כגון הלב והכבד<sup&gt; 1-6</sup&gt;.

מבוא טכניקת ממוקד אולטראסאונד הרס microbubble

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid ...

introduction-to-ultrasound-targeted-microbubble-destruction

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.4K Views.  University of Hawaii. הרס ממוקד אולטראסאונד microbubble (UTMD) יכול לשמש ישירה באתר ספציפי משלוח של מולקולות ביו, כולל גנים טיפוליים, כדי למקד את האיברים נגישים אולטרסאונד, כגון הלב והכבד 1-6.

Video: Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

Contrast Ultrasound Targeted Treatment of Gliomas in Mice via Drug-Bearing Nanoparticle Delivery and Microvascular Ablation

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the microvasculature are controlled by varying ultrasound pulsing parameters.  Specifically, we are testing whether such approaches may be used to treat malignant brain tumors through drug delivery and microvascular ablation.  Preliminary studies have been performed to determine whether targeted drug-bearing nanoparticle delivery can be facilitated by the ultrasound mediated destruction of "composite" delivery agents comprised of 100nm poly(lactide-co-glycolide) (PLAGA) nanoparticles that are adhered to albumin shelled microbubbles. We denote these agents as microbubble-nanoparticle composite agents (MNCAs). When targeted to subcutaneous C6 gliomas with ultrasound, we observed an immediate 4.6-fold increase in nanoparticle delivery in MNCA treated tumors over tumors treated with microbubbles co-administered with nanoparticles and a 8.5 fold increase over non-treated tumors. Furthermore, in many cancer applications, we believe it may be desirable to perform targeted drug delivery in conjunction with ablation of the tumor microcirculation, which will lead to tumor hypoxia and apoptosis. To this end, we have tested the efficacy of non-theramal cavitation-induced microvascular ablation, showing that this approach elicits tumor perfusion reduction, apoptosis, significant growth inhibition, and necrosis. Taken together, these results indicate that our ultrasound-targeted approach has the potential to increase therapeutic efficiency by creating tumor necrosis through microvascular ablation and/or simultaneously enhancing the drug payload in gliomas.

Insonation of microbubbles is a promising strategy for tumor ablation at reduced time-averaged acoustic powers, as well as for the targeted delivery of therapeutics. The purpose of the present study is to develop low duty cycle ultrasound pulsing strategies and nanocarriers to maximize non-thermal microvascular ablation and payload delivery to subcutaneous C6 gliomas.

אולטראסאונד ניגודיות ממוקד טיפול gliomas של עכברים באמצעות אספקת סמים נושאות Nanoparticle ו אבלציה כלי הדם

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. HerDox is formed by non-covalent self-assembly of a tumor targeted cell penetration protein with the chemotherapy agent, doxorubicin, via a small nucleic acid linker. A combination of electrophilic, intercalation, and oligomerization interactions facilitate self-assembly into round 10-20 nm particles. HerDox exhibits stability in blood as well as in extended storage at different temperatures. Systemic delivery of HerDox in tumor-bearing mice results in tumor-cell death with no detectable adverse effects to non-tumor tissue, including the heart and liver (which undergo marked damage by untargeted doxorubicin). HER2 elevation facilitates targeting to cells expressing the human epidermal growth factor receptor, hence tumors displaying elevated HER2 levels exhibit greater accumulation of HerDox compared to cells expressing lower levels, both in vitro and in vivo. Fluorescence intensity imaging combined with in situ confocal and spectral analysis has allowed us to verify in vivo tumor targeting and tumor cell penetration of HerDox after systemic delivery. Here we detail our methods for assessing tumor targeting via multimode imaging after systemic delivery.

This article details the procedures for optical imaging analysis of the tumor-targeted nanoparticle, HerDox. In particular, detailed use of the multimode imaging device for detecting tumor targeting and assessing tumor penetration is described here.

ניתוח של חלבון נגיפי ממוקד חלקיקים מובא לHER2 + גידולים

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using sonication, mechanical agitation, microfluidic devices, or homogenization. Recently, lipid-based oxygen microbubbles (LOMs) have been designed to deliver oxygen intravenously during medical emergencies, reversing life-threatening hypoxemia, and preventing subsequent organ injury, cardiac arrest, and death. We present methods for scaled-up production of highly oxygenated microbubbles using a closed-loop high-shear homogenizer. The process can produce 2 L of concentrated LOMs (90% by volume) in 90 min. Resulting bubbles have a mean diameter of ~2 &#956;m, and a rheologic profile consistent with that of blood when diluted to 60 volume %. This technique produces LOMs in high capacity and with high oxygen purity, suggesting that this technique may be useful for translational research labs.

We describe methods for the manufacture of large volumes of lipid-based oxygen microbubbles (LOMs) designed for intravenous oxygen delivery using high-shear homogenization and serial concentration.

ייצור מרוכז, חמצן שומנים מבוסס microbubble אמולסיות ידי הגזירה גבוהה Homogenization וריכוז סידורי

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

טכניקת Microfluidic לחקור deformability הסלולרי

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

שבב microfluidic למבוא לדוגמא ICPMS

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

This protocol describes a simple preparation method for gold nanoparticle integrated photo-responsive liposomes with the commercially available materials. It also shows how to measure the microbubble cavitation process of the synthesized liposomes upon the treatment of pulsed laser.

סינתזה של משולב זהב Nanoparticle תמונה המגיבים ליפוזומים ומדידה של microbubble Cavitation שלהם על עירור לייזר דופק

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

An Experimental Protocol for Assessing the Performance of New Ultrasound Probes Based on CMUT Technology in Application to Brain Imaging

The possibility to perform an early and repeatable assessment of imaging performance is fundamental in the design and development process of new ultrasound (US) probes. Particularly, a more realistic analysis with application-specific imaging targets can be extremely valuable to assess the expected performance of US probes in their potential clinical field of application.
The experimental protocol presented in this work was purposely designed to provide an application-specific assessment procedure for newly-developed US probe prototypes based on Capacitive Micromachined Ultrasonic Transducer (CMUT) technology in relation to brain imaging.
The protocol combines the use of a bovine brain fixed in formalin as the imaging target, which ensures both realism and repeatability of the described procedures, and of neuronavigation techniques borrowed from neurosurgery. The US probe is in fact connected to a motion tracking system which acquires position data and enables the superposition of US images to reference Magnetic Resonance (MR) images of the brain. This provides a means for human experts to perform a visual qualitative assessment of the US probe imaging performance and to compare acquisitions made with different probes. Moreover, the protocol relies on the use of a complete and open research and development system for US image acquisition, i.e. the Ultrasound Advanced Open Platform (ULA-OP) scanner.
The manuscript describes in detail the instruments and procedures involved in the protocol, in particular for&#160;the calibration, image acquisition and registration of US and MR images. The obtained results prove the effectiveness of the overall protocol presented, which is entirely open (within the limits of the instrumentation involved), repeatable, and covers the entire set of acquisition and processing activities for US images.

The development of new ultrasound (US) probes based on Capacitive Micromachined Ultrasonic Transducer (CMUT) technology requires an early realistic assessment of imaging capabilities. We describe a repeatable experimental protocol for US image acquisition and comparison with magnetic resonance images, using an ex vivo bovine brain as an imaging target.

טיפול נסיוני הערכת הביצועים של הגששים סאונד חדש מבוסס על טכנולוגיית CMUT ביישום כדי הדמיה מוחית

The possibility to perform an early and repeatable assessment of imaging performance is fundamental in the design and development process of new ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

הערכה מקיפה של היעילות והבטיחות של משלוח סמים, ממוקדות השליה באמצעות שלוש שיטות משלימות

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

הכנת חלבון הפקת תאים סינתטיים באמצעות שולפת תא חינם בקטריאלי, ליפוזומים והעברת אמולסיה

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...