עבודה זו נתמכה על ידי החולים הכללי במסצ&#39;וסטס מחלקת קופות לרפואה פנימית (JMT, MKM, MLC, JMV), המכון הלאומי הדמיה ביו Bioengineering מענק T32EB006348 (CEC), המרכז הכללי של מסצ&#39;וסטס של החולים לקרן חישובית אינטגרטיבית פיתוח ביולוגיה AI062773 ( RJH), מענקים AI062773, DK83756 ו DK 043,351 (RJX), NSF 0,643,745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL), ואת המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) של המכון הלאומי לבריאות (NIH) AI057999 (JMV ). אנו מודים ניקולס C. Yoder לדיונים מועיל, צ&#39;רלס פלטס (RPI, Inc) לקבלת סיוע טכני.

1. תרבות תנאים של פתוגנים עבור השמנה אופטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול א fumigatus (B-5233/RGD12-8) על חצי מוצק מדיה אגר המכיל SBD (Sabouraud דקסטרוז) בשעה 30 ° C במשך 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול C. אלביקנס (SC5314) ב YPD (שמרים, Peptone דקסטרוז) תרבות נוזל המכיל 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל אמפיצילין לילה חממה שייקר ב 30 ° C. </li></ol> 2. הכנה של פתוגנים תיוג פלורסנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר כמות רצויה של פתוגנים להעביר צינור 1.5 תגובה מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 μL של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) אל צינור התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate התערובת למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בסל&quot;ד 4000 למשך 1 דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant, עוזב גלולה באין מפריע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על (2.4) ו (2.5) עוד פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב 500μL של PBS. </li></ol> 3. תיוג של פתוגנים עם צבע פלואורסצנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 1 מ&quot;ג של צבע של עניין (למשל אלקסה פלואוריד 488, Alexa פלואוריד 647) ב dimethylformamide 100 μL (DMF) (בריכוז של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 μL תערובת של צבען צינורות התגובה המכיל פתוגנים שטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיבוב או להתנער מדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מדגם PBS 3X ידי centrifuging בסל&quot;ד 4000 למשך 1 דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב 300 μL של PBS. </li></ol> 4. מסיק T-תאים מהדם כולו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג דם שלם (טרי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דם חם, PBS + 2% עוברית שור בסרום (FBS), ו histopaque לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף CD4 + RosetteSep האדם העשרה T קוקטייל נייד ב μL 50 / מ&quot;ל ​​של דם מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב מדגם דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל מדגם עם נפח שווה של PBS + 2% FBS ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבה מדוללת מדגם על גבי histopaque, מזעור ערבוב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 1200 XG בטמפרטורת החדר עם הבלם משם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים מועשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים מועשר 2x עם פתרון PBS + FBS 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse כדוריות דם אדומות למשך 2 דקות עם תא דם אדום חיץ lysing </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של PBS + 2% FBS ו lysed צנטריפוגות אדום דם תאים בסל&quot;ד 1500 למשך 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant, נזהר לא להפריע גלולה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend בתקשורת IMDM המכיל 10% בסרום שור העובר </li></ol> 5. הכנת 264.7 מקרופאגים הגלם לתוך שקופיות קאמרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן DMEM (מדיום שונה Dulbecco של הנשרים) להכיל 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ו 1% L-גלוטמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיה חמים, טריפסין, ו pbs באמבט חם 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2x צלחת עם PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS בין לשטוף כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל טריפסין לצלחת כדי לכסות את פני השטח (עבור צלחת 10 ס&quot;מ תרבות רקמות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 5 דק &#39;ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדפוק בעדינות לצד הצלחת לנתק את התאים מפני השטח צלחת. היזהר לא להתיז טריפסין מחוץ לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל או כמות זהה של התקשורת טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב תערובת לתוך צינור התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב התקשורת, נזהר לא להפריע גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב 10 מ&quot;ל של התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 400 μL של התקשורת לתא אחד של השקופית קאמרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μL ההשעיה תא לתא אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול בין לילה באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li></ol> 6. תוספת של פתוגנים לדגום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet μL 5-10 של פתוגנים שכותרתו עניין (מ צעדים 1-3) אל תוך החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב על ידי pipeting למעלה ולמטה, נזהר שלא לגעת בקרקעית של החדר להפריע מקרופאגים דבק. </li></ol> 7. טוען מדגם על ספינינג מיקרוסקופ דיסק confocal (וידאו, סריקה באמצעות רכיבים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את כל הרכיבים על ספינינג מיקרוסקופ דיסק confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר מיקרוסקופ הדמיה DIC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שקופיות קאמרית מן החממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שקף קאמרית לשלב מיוחדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת החלק העליון של השקופית קאמרית (הכרחי הדמיה DIC). </li></ol> 8. הכנה השמנה אופטי (וידאו, סריקה באמצעות רכיבים איך זה להשתלב מיקרוסקופ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תריס עבור מלכודת אופטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת IR לייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תריס פתוח (על הלייזר) מלכודת אופטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר תריס מול IR לייזר סגור על ידי סימון עם כרטיס IR. </li></ol> 9. בחירה מניפולציה של הפתוגן עם מלכודת אופטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס על מקרופאגים בשקופית דבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא פתוגנים תנודות בחופשיות פתרון הסמוכים מקרופאגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר בשלב כזה הפתוגן הוא בקרבת המלכודת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתיחת תריס להעסיק את מלכודת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר מדגם להביא מקרופאגים במגע עם המלכודת נייחped הפתוגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה עם דיסק מסתובב מיקרוסקופ confocal, לא DIC, הקרינה, או שילוב של שניהם. בדרך כלל, השמנה נעשית DIC, בזמן אמת הדמיה נעשה עם פלואורסצנטי. </li></ol> 10. נציג תוצאות: כדי להפעיל שליטה במרחב ובזמן מלא של פתוגנים וחרוזים ב in vivo ו בסביבה חוץ גופית, עיצבנו מנגנון שהותקן השמנה משולב על גבי מיקרוסקופ דיסק ספינינג confocal (סכמטי באיור. 1). במלוא העוצמה, לייזר סיפק 350 מגוואט של חשמל לאחר צימוד האור עם רכיבים אופטיים שונים במנגנון מלכודת אופטית, ~ 80 mW של כוח על המטרה TIRF, כפי שנמדד עם מד כוח, שימש בצורת מלכודת בחדר. על מנת עמדה חפץ בחדר יחסי האובייקט לכודים, בשלב הועבר תוך כדי החזקת חפץ נייח עם לכודים לייזר השמנה. בשלב הועבר במהירויות די איטי, כך כוח הגרר על החלקיקים הלכודים לא יעלה על כוח השמנה מקסימלית. אוכלוסיות נפרדות של C. albicans (גודל טיפוסי - ~ 5 מיקרומטר) תויגו עם כל אחד משלושת הצבעים (AF488, AF568, ו AF647, המתאים ירוק, כחול, אדום באיור, בהתאמה) כדי להמחיש הדמיה עם ערוצי הקרינה מרובים ובמקביל אופטית השמנה הפתוגן. יחיד ג אלביקנס נלכד ועבר בדפוס מרובע באמצעות מקבץ של שמרים אחרים, כפי שעולה חצי אפור, הוכחת את היכולת ללכוד ולתפעל את המיקום הספציפי של הפתוגן יחיד שנבחר על ידי המפעיל גם בסביבה צפופה (איור 2 א) . כדי להמחיש עוד יותר את הגמישות של מערכת זו כדי ללכוד את הצורה מורפולוגיות שונות הוצגו על ידי אורגניזמים פתוגניים, פינצטה אופטית גם היה מסוגל להחזיק למקם ג אלביקנס חלקיק עם pseudohyphae. ג אלביקנס שכותרתו עם AF647 (אדום) היה נע לאורך מסלול כפי שתואר על ידי החץ הלבן והניח ליד התאים GFP-LC3-RAW ניאון (איור 2B). החלק שמרים של C. אלביקנס נלכד כמו pseudohyphae השתרך. אנו ממוקמים גם אספרגילוס fumigatus ליד תא עכבר RAW macrophage על מנת לנתח את מסגרת הזמן המוחלט של phagocytosis עם הקו הזה תא הפתוגן מסוים (איור 3A). לאחר הפתוגן יוצר קשר עם התא, המלכודת כבוי, ואת זמן לשגות הדמיה מועסק לצפות אירועים הסלולר עוקבות (איור 3B). מלכודת אופטי שימש גם כדי ללכוד העיקרי T-תאים מבודדים מהדם וביים הסמוכים חרוזים מצופים נוגדני אנטי CD3 על מנת תא-T כדי ליצור הסינפסה האימונולוגית עם חרוז (איור 4), המופע נוספים צדדיות ישירות מלכודת מניפולציה בתאי מערכת החיסון. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. סקירה כללית סכימטי של מלכודת אופטי משולב ספינינג דיסק ההתקנה confocal מיקרוסקופ. כלי הפריסה מראה את הקורה השמנה (סגול), דרך תאורה עבור brightfield הדמיה (כתום), קרן עירור פלואורסצנטי (אדום), פליטת הקרינה (ירוק), תשלום מצמידים התקן (CCD) המצלמה, אלקטרונים הכפלת מכשיר תשלום מצמידים (EM- CCD) המצלמה, מראות dichroic (D1 ו-D2), מראות (M1 ו M2), ועדשות (L1, L2, L3, L4). כל הרכיבים האחרים של המערכת confocal מלכודת מיקרוסקופ מסומנים בתרשים. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. (א) תמונות של הקרינה לכודים מניפולציות ג אלביקנס. לכודים fluorescently שכותרתו (אלקסה פלואוריד 488 (AF488), כחול) האורגניזם בשטח של כ fluorescently שכותרתו אחרים אלביקנס (AF568, ירוק AF647, אדום). הבמה נע סביב החלקיקים הלכודים, CA כחול כפי שצוין על ידי החצים אפור. (ב) לכודים פסאודו hyphal צורה של C. אלביקנס ליד תא GFP LC3-RAW. טופס psuedohyphal שכותרתו fluorescently של CA (אדום, AF647) לכודים אופטית ועבר סמוך GFP-LC3 הביע מקרופאגים RAW. האורגניזם CA הוא נע לאורך מסלול כפי שצוין על ידי החץ הלבן. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. השמנה ומיצוב של א &#39; fumigatus ליד תא RAW phagocytic. (א) brightfield תמונות של א &#39;לכוד fumigatus, כפי שצוין על ידי החץ הלבן, עברה ואת מיקומו לאורך השביל כפי שצוין על ידי החץ האדום. הפתוגן לכודים מעט מחוץ לפוקוס בגלל המלכודת דוחפים את האורגניזם מעט מעל המטוס מוקד א. fumigatus מועבר עד ממוקמת סמוך לתא הגלם המבוקש. (ב) שפעתהדמיה של orescence phagocytosis א fumigatus על ידי תא RAW. לאחר הפתוגן לכודים ממוקם ליד תא הגלם, תהליך phagocytosis מופעל. בשעה 30 s, הממברנה של התא RAW מתחיל לשנות צורה כוס סביב החלקיקים. בשעה 60 s, כוס נוצר במלואו. מ -90 ל 150s, א &#39; fumigatus נבלע, ועל ידי 180 s, החלקיק מופנם במלואו <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. השמנה העיקרי T-cell כדי ליצור סינפסה עם אנטי CD3 חרוזים מצופים. DIC תמונות של ראשוני T-cell עבר על ידי מלכודת אופטית למיקום ליד מצופה חרוז עם נוגדן אנטי CD3. לאחר מכן התא מהווה סינפסה החיסונית, אשר לא ניתן להבחין בקלות את התמונות.

<ol>
	<li>Grakoui, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+A+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li><li>Monks, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395, 82-86 (1998).</li><li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+and+comparative+innate+immunity:+Learning+on+the+fly.">Phagocytosis and comparative innate immunity: Learning on the fly.</a> Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Ashkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping+and+manipulation+of+neutral+particles+using+lasers.">Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 94, 4853-4860 (1997).</li><li>Ashkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+and+trapping+of+particles+by+radiation+pressure.">Acceleration and trapping of particles by radiation pressure.</a> Phys Rev Lett. 24, 156-159 (1970).</li><li>Ashkin, A., Dziedzic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping+and+manipulation+of+viruses+and+bacteria+Science.">Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria Science.</a> Nature. 235, 1517-1520 (1987).</li><li>Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+M13+bacteriophage+tethering+and+stretching.">Single M13 bacteriophage tethering and stretching.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 4892-4897 (2007).</li><li>Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin's+cover-neck+bundle+folds+forward+to+generate+force.">Kinesin's cover-neck bundle folds forward to generate force.</a> Proc Natl Acad Sci USA.. 105, 19247-19252 (2008).</li><li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+tether+formation+from+outer+hair+cells+with+optical+tweezers.">Membrane tether formation from outer hair cells with optical tweezers.</a> Biophys J. , 1386-1395 (2002).</li><li>Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;&#946;+T+cell+receptor+is+an+anisotropic+mechanosensor.">The &#945;&#946; T cell receptor is an anisotropic mechanosensor.</a> J Biol Chem. 284, 31028-31028 (2009).</li><li>Mohanty, S., Mohanty, K., Gupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+interaction+of+RBC+with+optical+tweezers.">Dynamics of interaction of RBC with optical tweezers.</a> Opt. Express. 13, 4745-4751 (2005).</li><li>Tam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+and+manipulation+of+pathogens+with+an+optical+trap+for+live+cell+imaging+of+intercellular+interactions.">Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions.</a> PLoS One. 5, e15215-e15215 (2010).</li><li>Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillosis+case-fatality+rate:+Systematic+review+of+the+literature.">Aspergillosis case-fatality rate: Systematic review of the literature.</a> Clin Infect Dis.. 32, 358-366 (2001).</li><li>Wey, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hospital-acquired+candidemia+-+the+attributable+mortality+and+excess+length+of+stay.">Hospital-acquired candidemia - the attributable mortality and excess length of stay.</a> Arch. Intern. Med. 148, 2642-2645 (1988).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בעבודה זו אנו משתמשים מלכודת אופטי ללכוד פתוגנים עם ממדים בין 3 מיקרומטר - 5 מיקרומטר. אמנם פתוגנים עניין במעבדה שלנו בדרך כלל יש ממדים אלה, מערכת פינצטה אופטית המתוארת כאן היא גמישה ללכוד מגוון רחב של גדלים. ואכן מלכודות אופטיות שימשו כדי ללכוד חלקיקים הנעים בין אטומי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> א fumigatus </td><td></td><td></td><td> זן אלבינו, B-5233/RGD12-8, מתנה KJ Kwon-Chung, NIH </td></tr><tr><td> C. albicans </td><td></td><td></td><td> SSY50-B מוטציה, מתנה אלפתריוס Mylonakis, MGH; SC5314 זן, מתנה ג&#39;רלד פינק, וייטהד במכון </td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td> dimethylformamide </td><td> סיגמא </td><td> D4551 </td><td></td></tr><tr><td> דם טרי </td><td></td><td></td><td> מתנה RJW הית, MGH, HMS </td></tr><tr><td> Nikon הפוכה מיקרוסקופ </td><td> ניקון </td><td></td><td> דגם TI-E </td></tr><tr><td> לייזר השמנה, ChromaLase </td><td> מחקר Blue Sky </td><td> CLAS-106-02-STF02 </td><td></td></tr><tr><td> עירור פלואורסצנטי לייזר </td><td> קוהירנט </td><td></td><td> דגם Innova 70C </td></tr><tr><td> Breadboards עבור רכיבים השמנה </td><td> Thorlabs </td><td> MB1224, MB1218 </td><td></td></tr><tr><td> שולחן אופטי אוויר </td><td> טכני ייצור Corporation </td><td></td><td></td></tr><tr><td> תריס שליטה אלקטרונית עם דוושת </td><td> Uniblitz </td><td></td><td> שנרכשו וינסנט Associates, רוצ&#39;סטר, ניו יורק </td></tr><tr><td> Singlemode סיב אופטי </td><td> עוז אופטיקה </td><td> PMJ-3S3S-1064-6 </td><td></td></tr><tr><td> סיבים positioner </td><td> Thorlabs </td><td> PAF-X-5-C </td><td></td></tr><tr><td> סיבים collimator </td><td> עוז אופטיקה </td><td> HPUCO-23-1064-P-25AC </td><td></td></tr><tr><td> עדשות עבור טלסקופ </td><td> Thorlabs </td><td> AC254-150-B </td><td> אורך מוקד של 150 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> תרגום שלבים (x, y, z) </td><td> ניופורט </td><td> M-461-XYZ </td><td></td></tr><tr><td> IR dichroic במראה </td><td> Chroma </td><td> ET750-SP-2p8 </td><td></td></tr><tr><td> המטרה העדשה (100x) </td><td> ניקון </td><td></td><td> NA = 1.49, טבילה שמן, המטרה TIRF </td></tr><tr><td> Confocal ראש </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-XI </td><td></td></tr><tr><td> מקטב </td><td> ניקון </td><td> MEN51941 </td><td></td></tr><tr><td> וולאסטון פריזמה </td><td> ניקון </td><td> MBH76190 </td><td></td></tr><tr><td> EM-CCD המצלמה </td><td> Hamamatsu </td><td> C9100-13 </td><td></td></tr><tr><td> מצלמת CCD (ORCA ER) </td><td> Hamamatsu </td><td> C4742-80-12AG </td><td></td></tr><tr><td> סנן גלגל </td><td> Ludl </td><td> 99A353 </td><td></td></tr><tr><td> סנן גלגל </td><td> סאטר </td><td> LB10-NWE </td><td></td></tr><tr><td> החדרים coverglass </td><td> Lab-Tek/Nunc </td><td> 155409 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 111-51D </td><td> מצופה עם אנטי CD3 </td></tr><tr><td> שונה Dulbecco הנשר של המדיום (DMEM) </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 10313 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> עוברית שור סרום (HyClone) </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

use of an optical trap for study of host-pathogen interactions for dynamic live cell imaging

תא דינמי הדמיה לחיות מאפשר ראיה ישירה בזמן אמת אינטראקציות בין תאים של המערכת החיסונית 1, 2, עם זאת, חוסר שליטה במרחב ובזמן בין תא חיידק phagocytic ויש שניתנו ממוקד תצפיות לתוך אינטראקציות התגובה הראשונית של המארח פתוגנים קשה. מבחינה היסטורית, אירועים לפנות אינטר כגון phagocytosis 3 כבר צילמו על ידי ערבוב של שני סוגי התאים, ולאחר מכן ברציפות סריקת השדה של נוף למצוא קשר אינטר סרנדיפי בשלב המתאים של אינטראקציה. אופי סטוכסטיים של אירועים אלה הופך את התהליך מייגע, וקשה לצפות באירועים מוקדם או חולף על קשר תאים תאים על ידי גישה זו. שיטה זו מחייבת מציאת זוגות סלולריים, כי הם על סף מגע, והתבוננות לפנות אותם עד שהם המושלם שלהם, או לא. כדי לענות על המגבלות האלה, אנו משתמשים השמנה אופטי כשיטה, לא פולשנית ולא הרסנית, אבל מהיר ויעיל למצב התאים בתרבית. מלכודות אופטי, או פינצטה אופטית, מנוצלים ויותר המחקר הביולוגי כדי ללכוד פיסית לתפעל תאים אחרים מיקרון חלקיקים בגודל בשלושה ממדים 4. לחץ קרינה נצפתה הראשון ליישם מערכות פינצטה אופטית ב -1970 5, 6, ושימש הראשון לשלוט דגימות ביולוגיות בשנת 1987 7. מאז, פינצטה אופטית הבשילו לתוך הטכנולוגיה כדי לבחון מגוון של תופעות ביולוגיות 8-13. אנו מתארים שיטה 14 כי ההתקדמות לחיות הדמיה התא על ידי שילוב של מלכודת אופטי עם דיסק מסתובב מיקרוסקופיה confocal עם בקרת טמפרטורה ולחות כדי לספק שליטה במרחב ובזמן מעולה של אורגניזמים פתוגניים בסביבה פיזיולוגיים כדי להקל על אינטראקציות עם תאים המארח, כפי שנקבע על ידי המפעיל. Live, אורגניזמים פתוגניים כמו קנדידה אלביקנס, אספרגילוס fumigatus, אשר יכול לגרום פוטנציאל קטלני, זיהומים פולשניים בקרב אנשים immunocompromised 15, 16 (למשל איידס, כימותרפיה, השתלת איברים לחולים), היו לכודים אופטית באמצעות שאינו הרסני בעוצמות לייזר ועבר סמוך מקרופאגים, אשר יכול phagocytose את הפתוגן. רזולוציה גבוהה, המשודר בסרטים אור פלואורסצנטי מבוססי הקים את היכולת להתבונן באירועים הראשונים של phagocytosis בתאים חיים. כדי להדגים את תחולתם רחבה באימונולוגיה, העיקרי מתאי T נלכדו גם מניפולציות כדי ליצור סינפסות עם אנטי CD3 microspheres מצופה in vivo, וגם זמן לשגות הדמיה של היווצרות הסינפסה הושג גם. על ידי מתן שיטה להפעיל שליטה מרחבית קנס של פתוגנים לחיות ביחס תאים חיסוניים, אינטראקציות הסלולר יכול להיות שנתפסו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם הפרעה מינימלית תאים יכולה להניב תובנה עוצמה לתוך התגובות המוקדמות של חסינות מולדת ובעלי כושר הסתגלות.

Watch this Scientific Journal Video about Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging at JoVE.com

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

השיטה מתוארת בנפרד לבחור, לתפעל, ומזיקים התמונה לחיות באמצעות מלכודת אופטי מצמידים את מיקרוסקופ דיסק מסתובב. מלכודת אופטי מספק שליטה במרחב ובזמן של אורגניזמים ומקומות אותם סמוך לתאי המארח. מיקרוסקופ פלואורסצנטי לוכדת אינטראקציות אינטר דינמי עם הפרעה מינימלית תאים.

השימוש מלכודת אופטית לחקר מארח הפתוגן אינטראקציות עבור הדמיה דינמי תא חי

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

use-an-optical-trap-for-study-host-pathogen-interactions-for-dynamic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K Views.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. השיטה מתוארת בנפרד לבחור, לתפעל, ומזיקים התמונה לחיות באמצעות מלכודת אופטי מצמידים את מיקרוסקופ דיסק מסתובב. מלכודת אופטי מספק שליטה במרחב ובזמן של אורגניזמים ומקומות אותם סמוך לתאי המארח. מיקרוסקופ פלואורסצנטי לוכדת אינטראקציות אינטר דינמי עם הפרעה מינימלית ...

Video: Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

שימוש במודל EpiAirway לאפיון לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

חקר Phagolysosome Biogenesis בהמקרופאגים בשידור חי

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

שימוש של<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; כדי לחקור אינטראקציות Autophagy-נוגדנים

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging techniques require propagation of light through glass, but on glass macrophage fusion is a rare event. This protocol presents the fabrication of several optical-quality glass surfaces where adsorption of compounds containing long-chain hydrocarbons transforms glass into a fusogenic surface. First, preparation of clean glass surfaces as starting material for surface modification is described. Second, a method is provided for the adsorption of compounds containing long-chain hydrocarbons to convert non-fusogenic glass into a fusogenic substrate. Third, this protocol describes fabrication of surface micropatterns that promote a high degree of spatiotemporal control over MGC formation. Finally, fabricating glass bottom dishes is described. Examples of use of this in vitro cell system as a model to study macrophage fusion and MGC formation are shown.

This protocol describes the fabrication of optical-quality glass surfaces adsorbed with compounds containing long-chain hydrocarbons that can be used to monitor macrophage fusion of living specimens and enables super-resolution microscopy of fixed specimens.

בדיית משטחי זכוכית אופטית באיכות ללמוד פיוז'ן מקרופאג

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

במבחנה מבנה הכלבי נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית: דינמי וניתוח כמותי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

זיהום זחלי זברה עם נבגי אספרגילוס לניתוח אינטראקציות מארח-פתוגן

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s global proteome under varying conditions. This powerful strategy applied to the interactions of microbial pathogens with the desired host comprehensively characterizes both perspectives towards infection. Herein, the workflow describes label-free quantification (LFQ) of the infectome of Cryptococcus neoformans, a fungal facultative intracellular pathogen that is the causative agent of the deadly disease cryptococcosis, in the presence of immortalized macrophage cells. The protocol details the proper protein preparation techniques for both pathogen and mammalian cells within a single experiment, resulting in appropriate peptide submission for liquid-chromatography (LC)-MS/MS analysis. The high throughput generic nature of LFQ allows a wide dynamic range of protein identification and quantification, as well as transferability to any host-pathogen infection setting, maintaining extreme sensitivity. The method is optimized to catalogue extensive, unbiased protein abundance profiles of a pathogen within infection-mimicking conditions. Specifically, the method demonstrated here provides essential information on C. neoformans pathogenesis, such as protein production necessary for virulence and identifies critical host proteins responding to microbial invasion.

Here, we present a protocol to profile the interplay between host and pathogen during infection by mass spectrometry-based proteomics. This protocol uses label-free quantification to measure changes in protein abundance of both host (e.g., macrophages) and pathogen (e.g., Cryptococcus neoformans) in a single experiment.

זרימת עבודה פרוטאומית כמותית ללא תוויות עבור אינטראקציות מארח-פתוגן מונחות גילוי

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...