החוקרים להעריך את תרומתם של גרג סמית&#39;, ליסה פומרנץ, מאט ליימן, Marlies אלדריג&#39;, הלינה Staniszewska Goraczniak ואנשי המעבדה Enquist בפרוטוקול זה כיוון עדין.

1. יום ראשון: זיהום ויראלי והכנת Buffers <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מאכלים 50-10 (בקוטר 15 ס&quot;מ) של התרבות תאים ורקמות של זיהום, למשל PK-15 תאים וירוס pseudorabies (PRV) או תאים Vero עבור נגיף הרפס סימפלקס (HSV). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים 95 - ומחוברות 100%, להדביק אותם (משרד הפנים) של 5-10. כדי לעשות זאת, לחסן כל צלחת באמצעות מניות וירוס בהיקף כולל של 4 מ&quot;ל לכל צלחת, ואז דגירה הצלחות במשך שעה 1 ב 37 ° C. צלחות רוק בעדינות כל 15 דקות על מנת להבטיח כי monolayer תא נשארת מצופה באופן מלא על ידי inoculum את הנגיף. בינתיים, לחמם את המדיום לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שעה של זיהום, לשאוב inoculum ויראלי מן הלוחות, מוסיפים 15 מ&quot;ל של מדיום חם, דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 12-20 שעות חממה humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגרים LCM (ראה לוח 1) ו רוק לילה ב 4 ° C עבור ערבוב יסודי. הכן TNE עבור resuspension של ה-DNA הנגיפי (ראה טבלה 2). </li></ol> 2. היום השני, שלב 1: תמוגה תא ultracentrifugation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראייה מאשרים כי זיהום של תאים גרמה השפעה cytopathic אחיד (CPE). אפשר זיהום להתקדם עד התאים כולם אספו, אבל לא הרים את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרדו את התאים הנגועים לתוך המדיום, ולשלב תאים בינוניים לתוך צינורות חרוטי 50 מ&quot;ל. מספר צינורות חרוטי הדרושים צעד זה יהיה תלוי במספר כלים המשמשים זיהום שלב 1.2 לעיל, כגון: one 50 מ&quot;ל צינור חרוטי ניתן להשתמש גלולה מקסימלית של 3 מנות של 15 מ&quot;ל כל אחד בינוני אופציונלי:. שטפו את צלחות עם 10 מ&quot;ל PBS ולשלב עם התאים ובינוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים צנטריפוגה בינוני למשך 10 דקות לעבר כוח 2000 centifugal יחסית (RCF) בטמפרטורת החדר, ואז לשאוב supernatant ו resuspend כל גלולה ב 10 מ&quot;ל של PBS. אם גלולה מדלקת נגיפית התפשט לתוך צינורות חרוטי מרובים שלב 2.2, אלה יכולים להיות recombined לתוך הגליל האחד חרוט על שלב זה. חזור צנטריפוגה והשאיפה אופציונלי:. גלולה זה עשוי להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס פרוטוקול המשיכה במועד מאוחר יותר. </li></ol> 3. יום שני, שלב 2: ultracentrifugation שמרו על תא גלולה ואת מאגרים LCM על הקרח ככל האפשר במהלך השלבים הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף β-mercaptoethanol כדי גליצרול 0% - חיץ LCM. בגין קירור ultracentrifuge (לצעד 3.9 להלן) על ידי הגדרת אותו 4 ° C ו הפעלת הוואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 5 מ&quot;ל של גליצרול 0% - חיץ LCM עד שהוא כבר לא גבשושית. אם יש צורך, מערבולת הצינור כדי לשבור את כל תא שלא נמס גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ על ידי הוספת 1.5 מ&quot;ל פריאון (1,1,2-trichloro-1-,2,2 trifluoroethane) ו vortexing במרץ. מיד צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 2000 RCF בטמפרטורה של 4 ° C. אסוף את השכבה העליונה עם קצה פיפטה רחב נשא (הימנעות ממשק) ומעבירים צינור חדש אופציונלי:. גלולה אם הוא מוצק דביקות, אתה יכול במהירות לשפוך את השכבה העליונה לתוך צינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על מיצוי פריאון ו צנטריפוגות שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את השכבה העליונה (~ 5 מ&quot;ל) ולהעביר צינור polyallomer חדש ultracentrifuge. הוסף β-mercaptoethanol כדי גליצרול השניים הנותרים - מאגרים LCM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שיפוע בצינור צנטריפוגות polyallomer ידי underlaying תמצית פריאון (השכבה העליונה) עם 3 מ&quot;ל של גליצרול 5% - LCM (השכבה האמצעית), ולאחר מכן underlaying שוב עם 2.5 מ&quot;ל של גליצרול 45% - LCM (השכבה התחתונה). השתמש פיפטה דקה כדי למנוע גלישה של תוכן הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, להכין צינור איזון המקבילה באמצעות אותן הפרופורציות של מאגרים LCM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת צינורות לסלים ultracentrifuge. מאזן סלים אל תוך 0.1 גרם אחד של השני, על ידי הוספת בעדינות גליצרול 0% תוספת - חיץ LCM אל השכבה העליונה (~ 50-100 μl בכל פעם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש ultracentrifuge קר עם דלי הרוטור אופקי או נדנוד, לסובב את דגימות מאוזנת במשך שעה 1 ב 77,000 RCF (למשל 25,000 סל&quot;ד עבור רוטור SW41Ti) בטמפרטורה של 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך ultracentrifugation, להפוך וו זכוכית ללכוד DNA צף בשלב אתנול משקעים (4.6 להלן). החזק את שני הקצוות של pipet כוס פסטר להשעות את החלק האמצעי מעל להבה. כאשר קטע של זכוכית מותכת כמעט, למשוך בעדינות למתוח את הכוס, לכופף אותו בעדינות כדי ליצור וו זווית בחוזקה (&lt;90 מעלות), ולמשוך בחדות לאטום את הסוף. אם קצה הקרס זכוכית פתוח, להחזיק את קצה מעל להבה, כך זכוכית נמס מספיק כדי לסגור אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ultracentrifugation, אתה צריך לראות דק אטום גלולה עם נקודה כהה באמצע. בזהירות לשאוב את הנוזל מתוך הצינור, כולל טפטופים לאורך הצדדים, אך הימנעות גלולה בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל TNE בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו גלולה לשבת לפחות 10 דקות כדי לאפשר הידרציה של גלולה. Optional: גלולה עשוי גם resuspend ב TNE לילה, אם שמרו על 4 ° C. </li></ol> 4. יום שלישי: &quot;Ghost&quot; DNA רטיבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את גלולה ידי pipetting עם קצה פיפטה בקוטר קטן (למשל טיפ פיפטה p200). אל תדאג הגז בשלב זה, כי ה-DNA הנגיפי נכלל עדיין capsids בשלב זה. מוסיפים את ריאגנטים הבא שפופרת המכילה את גלולה ויראלי, בטמפרטורת החדר, כדי להרוס capsids: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4.25 מ&quot;ל TNE </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.25 מ&quot;ל 10% SDS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 מ&quot;ג proteinase K </li></ul> לערבב בעדינות רוק ריאגנטים אלה. לא צריך להיות עלייה קלה צמיגות. </li></ol> היזהרו הגז מכאן ואילך, כמו למשל להשתמש בקוטר גדול pipettes ואינם המערבולת חומר ויראלי <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית חלבונים נגיפיים על ידי הוספת 5 מ&quot;ל של פנול, כלורופורם ומיד מתחילים היפוך או vortexing לשמור על אמולסיה. מערבבים במשך 10 שניות, ואז בצנטריפוגה אמולסיה במשך 5 דקות ב RCF 2000 בטמפרטורת החדר. אסוף את השכבה העליונה עם קצה פיפטה רחב לשעמם, הימנעות ממשק, ולהעביר צינור חדש אופציונלי:. השתמש נעילת שלב ג&#39;ל (PLG) הצינורות בשלב זה, כדי למנוע זיהום מממשק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על מיצוי פנול, כלורופורם צנטריפוגות שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר החילוץ פנול, כלורופורם השני, לאסוף את השכבה העליונה לתוך שפופרת 30 מ&quot;ל קורקס זכוכית ומקררים את הצינור ב -20 מעלות במשך 10-15 דקות, לדאוג שזה לא להקפיא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של אתנול קרים כקרח, לכסות את הצינור (למשל על ידי מתיחת חתיכת Parafilm M מעל), וכן להפוך לערבב מיד. Watch עבור ה-DNA של &quot;רוח רפאים&quot; להופיע, אשר מורכב לזרז חבלי דק. הפוך את הצינור בעדינות לתערובת נוספת לגרום DNA דביק משקעים לאשכול יחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש וו זכוכית כדי ללכוד את רוח ה-DNA (S). בזהירות למחוק את ה-DNA כדי להסיר את נוזל עודף, ואז למקם את הקרס (טיפ למטה) לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל ולאפשר לו להתייבש. הוסף 0.25-0.5 מ&quot;ל של TE לפזר את רוח ה-DNA. אפשר resuspension של ה-DNA כדי להמשיך לפחות שעה אחת. חנות ה-DNA ב 4 ° C. אופציונלי: כדי למקסם את התשואה ה-DNA, לנתק את הקרס זכוכית לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל, כך resuspension את שברי זכוכית יכול להמשיך לאורך זמן. </li></ol> 5. נציג תוצאות עם גבוה מספיק משרד הפנים, התאים צריכים להשיג CPE מלא בתוך זיהום ~ 18 שעות שלאחר (HPI) עבור wild-type זנים PRV, ו ~ 24 HPI עבור wild-type HSV-1 זנים (איור 1). לאחר התא הנגוע גלולה שנקטפו, השלבים פרוטוקול הנותרים ניתן להשלים ביום אחד ארוך או ביצעו במשך יומיים (איור 2). כאשר מכינים קרסים זכוכית כדי ללכוד את רוח ה-DNA, חשוב להפוך את זווית וו להיות פחות מ 90 מעלות, כדי שאחר כך הוא יכול להשתלב בבסיס צינור 1.5 מ&quot;ל (איור 3). איטום קצה הקרס הזה מונע אובדן DNA בתוך pipet. רוחות DNA טופס במהלך השלב המשקעים יופיע, חוטים לבנים חבלי (איור 4). אלה המצרפי להיצמד זו לזו ו / או את הקרס זכוכית להשתמש כדי ללכוד את הדנ&quot;א. לפיכך הקרס זכוכית אותו ניתן לאסוף את הנושאים מרובות דנ&quot;א מתוך הפתרון משקעים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> בחר בעמודה בהתבסס על נפח הרצויה: </td><td> 10 מ&quot;ל </td><td> 15 מ&quot;ל </td><td> 20 מ&quot;ל </td><td> 40 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> KCl 1M </td><td> 1.3 מ&quot;ל </td><td> 1.9 מ&quot;ל </td><td> 2.5 מ&quot;ל </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 1M טריס (pH 7.4) </td><td> 300 μl </td><td> 450 μl </td><td> 600 μl </td><td> 1.2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 50 μl </td><td> 75 μl </td><td> 100 μl </td><td> 200 μl </td></tr><tr><td> 0.5 EDTA </td><td> 10 μl </td><td> 15 μl </td><td> 20 μl </td><td> 40 μl </td></tr><tr><td> NP40/IGEPAL </td><td> 50 μl </td><td> 75 μl </td><td> 100 μl </td><td> 200 μl </td></tr><tr><td> β-mercaptoethanol (להוסיף מיד לפני השימוש) </td><td> 4.3 μl </td><td> 6.5 μl </td><td> 8.6 μl </td><td> 17.2 μl </td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td colspan="5"> השתמש הפרופורציות של גליצרול אחוז הרצוי (0, 5 או 45%) </td></tr><tr><td> 0% גליצרול </td><td> אף אחד </td><td> אף אחד </td><td> אף אחד </td><td> אף אחד </td></tr><tr><td> מים </td><td> 8.3 מ&quot;ל </td><td> 12.5 מ&quot;ל </td><td> 16.7 מ&quot;ל </td><td> 33.4 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 5% גליצרול </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td><td> 0.8 מ&quot;ל </td><td> 1.0 מ&quot;ל </td><td> 2.0 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מים </td><td> 7.8 מ&quot;ל </td><td> 11.7 מ&quot;ל </td><td> 15.7 מ&quot;ל </td><td> 31.4 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 45% glycerol </td><td> 4.5 מ&quot;ל </td><td> 6.8 מ&quot;ל </td><td> 9.0 מ&quot;ל </td><td> 18.0 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מים </td><td> 3.8 מ&quot;ל </td><td> 5.7 מ&quot;ל </td><td> 7.7 מ&quot;ל </td><td> 15.4 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> טבלה 1. מתכונים להכנת מאגרים LCM <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לקבלת נפח 50 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 5 מ&quot;ל NaCl 1M </td></tr><tr><td> 2.5 מ&quot;ל 1M טריס, pH 7.5 </td></tr><tr><td> 1 מ&quot;ל EDTA 0.5 </td></tr><tr><td> 41.5 מ&quot;ל H 2 O </td></tr></tbody></table> טבלה 2. הכנת TNE (0.1 M NaCl, 50 מ&quot;מ טריס, pH 7.5, 10 mM EDTA) <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לקבלת נפח 1 ליטר </td></tr><tr><td> 0.2 גרם KCl </td></tr><tr><td> 0.2 גרם KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 8 גרם NaCl </td></tr><tr><td> 1.15g Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> H 2 O עד 1 ליטר </td></tr></tbody></table> לוח 3. הכנה של PBS (2.7 mM KCl; 1.5 מ&quot;מ KH 2 PO 4; 137 mM NaCl, 8.1 mM Na 2 HPO 4; pH 7.0) <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig1.jpg" /> באיור 1. PK15 תאים (א) לפני ההדבקה, (ב) באמצע דרך זיהומים, (ג) את ההשפעה cytopathic (CPE), לאחר ריבוי גבוה של זיהום. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig2.jpg" /> איור 2. סקירה כללית של פרוטוקול. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig3.jpg" /> איור 3. שלוש דוגמאות מייצגות של זכוכית ווים לאיסוף רוחות ה-DNA הנגיפי. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig4.jpg" /> איור 4. למשל נציג של &quot;רוח רפאים&quot; בנוי היטב ורב DNA.

<ol>
	<li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations.">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li><li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins:+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications.">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li><li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes.">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li><li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector.">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li><li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus,+an+alphaherpesvirus.">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li><li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of virology. , (2008).</li><li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pseudorabies+virus:+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine.">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li><li>Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology. , 2381-2397 (2001).</li><li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus.">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li><li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus.">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li><li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus.">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

חלקים של פרוטוקול זה פותחו במקור עבור בידוד הדנ&quot;א הוויראלי BSL4 התנאים, אבל זה מתאים באותה מידה שאינם BSL תנאים. 4 אנו בדרך כלל להשתמש בפרוטוקול זה על מנת לבודד דנ&quot;א של אלפא herpesviruses PRV ו HSV-1, אשר יש הגנום דנ&quot;א מוקף proteinaceous capsid ומוקף במעטפה השומנים. 7,8 אולם ס?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> פריאון (1,1,2-trichloro-1-,2,2 trifluoroethane) </td><td> דיג </td><td> T178-4 </td><td> בדוק עם המוסד שלך לקבלת הנחיות לסילוק המתאים פריאון המכילים פסולת, או לראות מנדז et al. חלופות פריאון פוטנציאליים. 9 </td></tr><tr><td> ג&#39;ל שלב הנעילה צינורות, קיבולת 15 מ&quot;ל כבד </td><td> 5 PRIME </td><td> 2302850 </td><td> אופציונלי </td></tr><tr><td> Polyallomer צינורות ultracentrifuge </td><td> Beckman * </td><td> 331372 * </td><td> * צינורות בחר מתאים ultracentrifuge שלך, אלה כלולים כדוגמה בלבד </td></tr><tr><td> NP-40 / IGEPAL </td><td> סיגמא </td><td> I-3021 </td><td></td></tr><tr><td> PK-15 תאים </td><td> ATCC </td><td> CCL-33 </td><td></td></tr><tr><td> Vero תאים </td><td> ATCC </td><td> CCL-81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> HyClone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of viral dna from nucleocapsids

וירוסים הם טפילים הסלולר מחייבות, ולכן המחקר של ה-DNA שלהם מחייב לבודד חומר ויראלי מן התא המארח מזהמים ו-DNA. יישומים במורד כמה דורשים כמויות גדולות של DNA ויראלי טהור, הניתן על ידי פרוטוקול זה. יישומים אלה כוללים רצף הגנום הויראלי, שם את הסרת DNA המארח הוא חיוני כדי לייעל את התפוקה נתונים עבור רצפים ויראלי, ואת הייצור של זנים חדשים רקומביננטי ויראלי, שבה שותף transfection מטוהרים של ה-DNA הנגיפי פלסמיד ו ליניארי מאפשר רקומבינציה. 1,2, 3 תהליך זה מנצל שילוב של עקירות וצפיפות מבוססי צנטריפוגה כדי לבודד מטוהרים DNA ההרפס ליניארי nucleocapsid מן התאים הנגועים. 4,5 השלבים טיהור ראשוני במטרה לבודד capsids ויראלי מטוהרים, המכילים ולהגן על ה-DNA הנגיפי במהלך עקירות צעדים צנטריפוגה כי להסיר חלבונים ו-DNA התאי. תמוגה של nucleocapsids אז משחרר ה-DNA הנגיפי, ושני האחרונים פנול, כלורופורם צעדים להסיר החלבונים הנותרים. ה-DNA הסופי שנתפסו מפתרון מרוכז מאוד טהור, עם OD 260/280 ממוצע של 1.90. בהתאם לכמות של תאים נגועים בשימוש, טווח התשואות של ה-DNA הנגיפי של 150-800 מיקרוגרם או יותר. טוהר DNA זה עושה את זה יציב במהלך האחסון לטווח ארוך ב 4C. זהו ה-DNA ובכך אידיאלי עבור סידור תפוקה גבוהה, איכות גבוהה התגובות PCR, ו transfections. לפני תחילת הפרוטוקול, חשוב לדעת את המספר הממוצע של התאים לכל תבשיל (למשל ממוצע של 8 x 10 6 PK-15 תאים בצלחת ומחוברות 15 ס&quot;מ), ואת titer של המניה ויראלי לשמש ( למשל, 1 x 10 8 פלאק יוצרי יחידות מ&quot;ל). אלה נחוצים כדי לחשב את הריבוי המתאים של זיהום (משרד הפנים) עבור הפרוטוקול. 6 למשל, להדביק one 15 ס&quot;מ צלחת של PK-15 תאים עם המניה ויראלי לעיל, משרד הפנים של 5, תשתמש 400 μl של מניות ויראלי לדלל את זה עם 3.6 מ&quot;ל של מדיום (נפח חיסון הכולל של 4 מ&quot;ל עבור one צלחת 15 ס&quot;מ). הכנות מרובות דנ&quot;א ויראלי ניתן להכין בו זמנית. מספר הכנות סימולטני מוגבל רק על ידי מספר צינורות בידי הרוטור ultracentrifuge (אחד לכל וירוס, ראה שלב 3.9 להלן). כאן אנו מתארים את התהליך כאילו נעשה על וירוס אחד.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids at JoVE.com

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

אנו מתארים את תהליך של בידוד הטוהר גבוהה ההרפס DNA nucleocapsid מן התאים הנגועים. ה-DNA הסופי שנתפסו מן הפתרון של ריכוז הטוהר גבוהה, מה שהופך אותו אידיאלי עבור סידור תפוקה גבוהה, איכות גבוהה התגובות PCR, ו transfections לייצר recombinants ויראלי חדש.

ההכנה של ה-DNA ויראלי של Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

preparation-of-viral-dna-from-nucleocapsids

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.9K Views.  Princeton University. אנו מתארים את תהליך של בידוד הטוהר גבוהה ההרפס DNA nucleocapsid מן התאים הנגועים. ה-DNA הסופי שנתפסו מן הפתרון של ריכוז הטוהר גבוהה, מה שהופך אותו אידיאלי עבור סידור תפוקה גבוהה, איכות גבוהה התגובות PCR, ו transfections לייצר recombinants ויראלי חדש.

Video: Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

באמצעות assay הפאן ויראלי microarray (Virochip) אל מסך דוגמאות קליניות עבור פתוגנים ויראליים

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

בידוד של פידליטי גרסאות של וירוסים RNA ו אפיון תדירות המוטציה וירוס

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering (si)RNAs to inhibit the expression of complementary RNA transcripts is being exploited as a new class of therapeutics for a variety of diseases including HIV. Many previous reports have shown that novel RNAi-based anti-HIV/AIDS therapeutic strategies have considerable promise; however, a key obstacle to the successful therapeutic application and clinical translation of siRNAs is efficient delivery. Particularly, considering the safety and efficacy of RNAi-based therapeutics, it is highly desirable to develop a targeted intracellular siRNA delivery approach to specific cell populations or tissues. The HIV-1 gp120 protein, a glycoprotein envelope on the surface of HIV-1, plays an important role in viral entry into CD4 cells. The interaction of gp120 and CD4 that triggers HIV-1 entry and initiates cell fusion has been validated as a clinically relevant anti-viral strategy for drug discovery. 
Herein, we firstly discuss the selection and identification of 2'-F modified anti-HIV gp120 RNA aptamers. Using a conventional nitrocellulose filter SELEX method, several new aptamers with nanomolar affinity were isolated from a 50 random nt RNA library. In order to successfully obtain bound species with higher affinity, the selection stringency is carefully controlled by adjusting the conditions. The selected aptamers can specifically bind and be rapidly internalized into cells expressing the HIV-1 envelope protein. Additionally, the aptamers alone can neutralize HIV-1 infectivity. Based upon the best aptamer A-1, we also create a novel dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera in which both the aptamer and the siRNA portions have potent anti-HIV activities. Further, we utilize the gp120 aptamer-siRNA chimeras for cell-type specific delivery of the siRNA into HIV-1 infected cells. This dual function chimera shows considerable potential for combining various nucleic acid therapeutic agents (aptamer and siRNA) in suppressing HIV-1 infection, making the aptamer-siRNA chimeras attractive therapeutic candidates for patients failing highly active antiretroviral therapy (HAART).

Several 2&#x2019;-Fluoro RNA aptamers against HIV-1Ba-L gp120 with nanomole affinity are isolated from a RNA library by in vitro SELEX procedure. A new dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera is created and shows considerable promise for systemic anti-HIV therapy.

פיתוח נייד מסוג ספציפי נגד HIV gp120 aptamers למסירה siRNA

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2. Viruses modulate host cell abundance and diversity, contribute to the cycling of nutrients, alter host cell phenotype, and influence the evolution of both host cell and viral communities through the lateral transfer of genes 3. Numerous studies have highlighted the staggering genetic diversity of viruses and their functional potential in a variety of natural environments. 
Metagenomic techniques have been used to study the taxonomic diversity and functional potential of complex viral assemblages whose members contain single-stranded DNA (ssDNA), double-stranded DNA (dsDNA) and RNA genotypes 4-9. Current library construction protocols used to study environmental DNA-containing or RNA-containing viruses require an initial nuclease treatment in order to remove nontargeted templates 10. However, a comprehensive understanding of the collective gene complement of the virus community and virus diversity requires knowledge of all members regardless of genome composition. Fractionation of purified nucleic acid subtypes provides an effective mechanism by which to study viral assemblages without sacrificing a subset of the community&#x2019;s genetic signature. 
Hydroxyapatite, a crystalline form of calcium phosphate, has been employed in the separation of nucleic acids, as well as proteins and microbes, since the 1960s11. By exploiting the charge interaction between the positively-charged Ca2+ ions of the hydroxyapatite and the negatively charged phosphate backbone of the nucleic acid subtypes, it is possible to preferentially elute each nucleic acid subtype independent of the others. We recently employed this strategy to independently fractionate the genomes of ssDNA, dsDNA and RNA-containing viruses in preparation of DNA sequencing 12. Here, we present a method for the fractionation and recovery of ssDNA, dsDNA and RNA viral nucleic acids from mixed viral assemblages using hydroxyapatite chromotography.

We describe an efficient method to separate single-stranded DNA, double-stranded DNA and RNA molecules from environmental viral communities. Nucleic acids are fractionated using hydroxyapatite chromatography with increasing concentrations of phosphate-containing buffers. This method permits the isolation of all viral nucleic acid types from environmental samples.

ההפרדה של ה-DNA חד גדילי, פעמיים תקועים DNA ו-RNA מהקהילה ויראלי הסביבה באמצעות כרומטוגרפיה hydroxyapatite

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

פשוט פרוטוקול Chelex למיצוי DNA מ<em&gt; אנופלס</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

הקמתה של<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת ללמוד את התנהגות תאית של<em&gt; קנדידה glabrata</em&gt; בהמקרופאגים THP-1 אדם

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these glycoprotein &#8216;spikes&#8217; is often technically challenging but important for understanding viral pathogenesis and in drug design. Here, a protocol is presented for viral spike structure determination through computational averaging of electron cryo-tomography data. Electron cryo-tomography is a technique in electron microscopy used to derive three-dimensional tomographic volume reconstructions, or tomograms, of pleomorphic biological specimens such as membrane viruses in a near-native, frozen-hydrated state. These tomograms reveal structures of interest in three dimensions, albeit at low resolution. Computational averaging of sub-volumes, or sub-tomograms, is necessary to obtain higher resolution detail of repeating structural motifs, such as viral glycoprotein spikes. A detailed computational approach for aligning and averaging sub-tomograms using the Jsubtomo software package is outlined. This approach enables visualization of the structure of viral glycoprotein spikes to a resolution in the range of 20-40 &#197; and study of the study of higher order spike-to-spike interactions on the virion membrane. Typical results are presented for Bunyamwera virus, an enveloped virus from the family Bunyaviridae. This family is a structurally diverse group of pathogens posing a threat to human and animal health.

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

ממוצע של ויראלי מעטפת גליקופרוטאין Spikes מאלקטרוני Cryotomography שחזור באמצעות Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

בידוד של שברים תת-גרעיניים מועשרים-תא ויראלי שכפול מתאים נורמלים אדם נגוע Adenovirus

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

התפתחות Lyophilized Loop בתיווך ריאגנטים הגברה איזו תרמים לצורך זיהוי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

ההכנה של ה-DNA ויראלי של Nucleocapsids

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video