עבודה זו נתמכה על ידי ביטוח בריאות ממלכתי R01 מענק GM59690 הוענק KLV.

1. אפיון ראשוני ושיקולים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היווצרות biofilm מושפע בדרך כלל על ידי צפיפות התאים ואת קצב הצמיחה. לכן, יש צורך לקבוע את שיעור הצמיחה (גידול צפיפות אופטית (OD) לאורך זמן) תשואה (מספר התא האחרון) של זן (ים) של עניין על ידי ביצוע עקומת הצמיחה פשוט ציפוי מבחני התא. פגמים הצמיחה, או חוסר התאמה בין OD ומספר התא, יש לקחת בחשבון בעת ​​פירוש תוצאות תצפית ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלול את הפקדים חיוביות ושליליות מתאימות על אותה צלחת כאשר מעריכים הקמת המושבה מקומט, כמו וריאציה קלה הצלחת אל צלחת עשויה להשפיע על התפתחות biofilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות את התנאים הטובים ביותר לאיתור, כלומר, אלה לחשוף את הבדלים ברורים ביותר בין שליטה לבין מוטציה (ים) של עניין. לגדל זנים בתרבות נוזל בתנאים שונים, כמו מדיה או טמפרטורות שונות, לשלב אחרים של צמיחה (שלב מעריכי או נייח) לפני כתמים. במקום 10 μl של התרבות על צפיפות תאים שונים על גבי מדיה מתאים, דגירה בטמפרטורה הרצויה עד מורפולוגיות המושבה לעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay סוף נקודות כולל הערכה של הקמת המושבה מקומט בנקודת זמן קבועה מראש לאחר תצפית (כלומר, 48 שעות). הערכה זו שימושית עבור זנים (או מוצעים להציג) התערוכה פגמים חמורים במבנה biofilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay כמובן זמן מעריך הקמת המושבה מקומט על פני תקופה של זמן (כלומר, כל שעה) לאחר כתמים. Assay זה מאפשר הערכה כמותית למחצה של היווצרות biofilm בכך שהוא מאפשר לקבוע את תחילת היווצרות קמטים המושבה ופיתוח הדפוס על פני תקופה של זמן. משך הניסוי ואת מספר נקודות איסוף לקורס זמן נתון יש לקבוע בניסויים ראשוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעקוב בקלות אחר הזמן שלאחר איתור, נקבע עלimer לספור עד. </li></ol> 2. הערכה מיקרוסקופית של מורפולוגיה המושבה מקומט ב V. fischeri <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחסן ו &#39; fischeri התאים לתוך 5 מ&quot;ל של מלח-LB (LBS) בינוני 13 (1% [w / v] tryptone, 0.5% [w / v] תמצית שמרים, 2% [w / v] נתרן כלורי, 50 מ&quot;מ טריס-HCl [ pH 7.5]) המכיל את כל אנטיביוטיקה הדרושים דגירה, עם רעד, בן לילה ב 28 ° C. בבוקר, תת התאים עם דילול 1:100 לתוך 5 מ&quot;ל של מדיום LBS דגירה טרי באותם תנאים עד שהתאים הגיעו OD 600 הרצוי (למשל, OD 600 = 0.2 או 0.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1 מ&quot;ל של תרבות לתוך צינור microfuge ו צנטריפוגות בקבוצת microfuge במהירות המרבית למשך דקה אחת. הסר את supernatant ידי שאיפה. שוטפים את התאים להסיר התקשורת שיורית ורכיבים תאיים על ידי resuspending גלולה ב 1 מ&quot;ל של מי ים סטריליים מלאכותיים 70% (ASW) (35 מ&quot;מ MgSO 4-7H 2 O, 7 mM CaCl2-2H 2 O, 210 מ&quot;מ NaCl, KCl mM 7) וחזרה על צנטריפוגה. Resuspend גלולה שטוף ב 1 מ&quot;ל של ASW 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי מדגם זה מכיל את אותו מספר של תאים כפי שנאמדה ב -600 ננומטר ידי OD. בצע את ההתאמות הנדרשות על ידי דילול דגימות מרוכז יותר ASW 70% נוספים. בניסויים ראשוניים, תרבויות ספוט בבית הראשונים ערכים שונים כדי לקבוע OD OD החל האופטימלי עבור קבוצה נתונה של זנים או תנאים. התוצאות הטובות ביותר ניתנות על ידי ו &#39; fischeri כאשר נוצרות נקודות מתרבויות עם OD של כ 0.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט 10 μl של תאים שטף על גבי צלחות המכילות ק&quot;ג כל אנטיביוטיקה הדרושים. כאשר איתור תרבות לצלחת, הקפד פיפטה יציב (עם האצבע) מעל פני השטח אגר. לאתר אנכית, לא בזווית, ועל להוציא את הנוזל לאט התפלגות אחידה של המקום. בדרך כלל כל זן הוא הבחין פעם אחת בכל צלחת (עד 6 נקודות לכל צלחת), שנינותש הצלחות מרובות (2-3) בכל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח את התרבות הבחין עדיין מופץ באופן שווה, במקום לאפשר לו להתייבש לפני שעבר את הצלחת אל האינקובטור. הפוך את הצלחות דגירה אותם 28 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על המורפולוגיה של תחילת מקום גדל והולך מדי שעה בשעה 12-15 שעות לאחר חיסון. אנו משתמשים היקף לנתח (STEMI Zeiss 2000-C) עם קובץ מצורף המצלמה (הקידמה C10 PLUS) ו CapturePro הקידמה ותוכניות ImageJ תוכנה לצפות ולתעד מורפולוגיה המושבה כדי להעריך את התקדמות התחלה של היווצרות המושבה מקומט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתקנה ספציפית המצוינים בשלב 2.5, כתמים מוארים מלמטה ועד לשלב זכוכית שקוף עם מקור אור EC 1500 CL קר, בעוד תמונות נלכדים מלמעלה. התקנה זו היא אופטימלית לפיתוח המושבה הדמיה מקומט כי V. fischeri המושבות (כתמים) הם שקופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהיעדר ציוד מסוים מופיע רחובEP 2.5, מורפולוגיה צג המושבה קמטים באמצעות כל מיקרוסקופ לנתח המאפשרת צפייה במושבה מלא ויש לו מקור אור מתכווננת, באופן אידיאלי, המצלמה המצורפת. במידת הצורך, מצלמה דיגיטלית יכול גם להיות מנוצל בהעדר המצלמה המצורפת, אבל זה לא אופטימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטובה ביותר לחזות התפתחות המושבה מקומט, יש צורך להתאים גם את עוצמת התאורה והזווית של השתקפות מתחת מושבות חיידקים כאלה, מורפולוגיה תלת מימדי של biofilms מתפתחות ניתן להבחין. לקבוע את תנאי תאורה אופטימליים המספקים את הניגוד החזק בין המושבה הבחינו והרקע אגר שמסביב, כך לאדריכלות (קמטים) של המושבה הוא להבחין בבירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרים מסוימים, הצבע של המושבה הבחין חייבים גם לקחת בחשבון, כמו שינויים בצבע המושבה יכולה להתרחש במהלך היווצרות biofilm. כוון את העוצמה ואת הזווית של מקור התאורה לחשוףאלה שינויים עדינים צבע. פעם אחת את ההגדרות המתאימות מושגות, לשמור אותם במשך כל הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב כמה זמן עובר מרגע של חיסון לזמן שבו הקמת המושבה מקומט יוזם על זן אחד או מצב. להגדיר את תחילת היווצרות קמטים המושבה כנקודת הזמן שבה היווצרות דפוסים ומבנים 3D (כלומר, יוצרים פסי בקצה החיצוני או &quot;אדוות&quot; המתרחשים במרכז) ניכר 1. התאים שעברו מוטציה, עשויות להציג ירידה או עלייה הזמן להתחיל של היווצרות המושבה מקומט (למשל, איור. 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתעד את תחילת הפיתוח של היווצרות קמטים המושבה על ידי לכידת תמונות דיגיטליות המתאימים. חשוב להשתמש בהגדלה אותה בעת איסוף תמונות לאורך כל הניסוי. לעבור את הנוף העינית של המיקרוסקופ למסך המחשב באמצעות מנוף הממוקם בצד האחורי של המצלמה. בעת מעבר בין העיניתומסך צפייה המחשב, להתאים את התצוגה ולמקד בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תרבויות הדמיה מנוקדים, מכסה של צלחת פטרי מוסר בדרך כלל כדי לספק את התמונה הברורה. עם זאת, זה צעד לא חובה, כמו תרבויות מנוקדים ניתן הדמיה באמצעות המכסה באמצעות ההתקנה המפורט צעדים 2.5 ו -2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל נקודת זמן לאחר תחילת היווצרות המושבה מקומט לציין את דפוס התפתחות המושבה מקומט. ארכיטקטורת עלולים לפתח מחוץ פנימה, או מחוץ פנימה הערכה זו מספקת מנגנון להבחין בין biofilms שהוקמה על ידי זנים שונים או בתנאים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הקוטר של המושבה המתפתחת בכל נקודת זמן. ניתן לעשות זאת באופן ידני, או באופן דיגיטלי באמצעות התוכנה המשויך. אם נעשה באופן דיגיטלי, השתמש בתוכנית CapturePro הקידמה תוכנה 1 לכייל את סרגל קנה המידה כדי הגדלה המסוים של הניסוי. כלול את סרגל קנה המידה של התמונה בכל בשבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את קוטר המושבה באמצעות תוכנה ImageJ, לפתוח כל קובץ תמונה. לתקנן את סרגל קנה המידה באופן הבא: בחר את &quot;אפשרות קו ישר&quot; מסרגל הכלים. שכבת בר בקנה מידה מוטבע עם קו ישר באורך ורוחב אותו. בחר &quot;סולם הגדר&quot; מהכרטיסייה שכותרתו &quot;ניתוח&quot;. בתיבת &quot;ידוע המרחק&quot;, הכנס את אורך המתאים (כפי שנקבע משורת בהיקף המקורי, כלומר, 2 מ&quot;מ) ולחצו על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש &quot;קו ישר&quot; אפשרות להוסיף קו אופקי על פני המקום. תחת הלשונית ניתוח, בחר &quot;מדוד&quot;. בחלון התוצאות החדשות, אורך מחושב יסופק. להשיג מידה 2 על ידי הוספת קו אנכי על פני המקום. מחדש לחשב את קוטרו. רשום את הממוצע של שתי המדידות. גרף הקוטר הממוצע על כל מקום בכל נקודת זמן באמצעות תוכנה כגון Excel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של הניסוי מתרחש גם בנקודה זמן מוגדר או כאשר אין עודהפיתוח של biofilm. לאחר סוף הוא הגיע, לאחד את התמונות לתוך הדמות (ים) כדי לחזות את התפתחות הדפוס לאורך זמן באמצעות תוכנה כגון Powerpoint. </li></ol> 3. נציג תוצאות בניסויים אלה השתמשנו V. fischeri כאורגניזם מודל ללמוד היווצרות biofilm ידי הערכת התפתחות המושבות מקומט על פני אגר מוצק. Biofilm, לייצר זנים של V. fischeri מושבות טופס עם ארכיטקטורת 3D נרחב בתוך 40 שעות (איור 1) 8,9,14. כאשר בחנו במשך הזמן, מתברר כי הקמת המושבה מקומט על ידי זן פקד מפעילה מוקדם ככל כ 12 שעות לאחר חיסון (בהתאם לתנאים מסוימים) (איור 2) 9. לעומת זאת, היווצרות biofilm ידי מוטציה נציג בהשהייה של כ 4 שעות, לא יוזם עד כ 16 שעות לאחר חיסון 9. RepeaTS של ניסויים אלה הראו כי העיתוי היה עקבי יחסית, מה שהופך את הערכה זו חצי כמותית 9. המדד השני חצי כמותית של היווצרות biofilm עושה שימוש שינוי בקוטר של המושבה המתפתחת עם הזמן. כפי שמוצג באיור. 3A, זן נציג biofilm-המוסמכת מהווה מושבות העלייה המורכבות בקוטר יחסית זן נציג שאינו ליצור biofilms. מדידות קפדניות לאורך זמן של קוטר של המושבות שהוקמה על ידי שני זנים עולה כי גודל biofilm-המוסמכות מושבות עלה בשיעור גדול יותר מאשר biofilm שלילי המושבות, ובשלב שעת סיום 2 שונה בכמעט 2 - פי (איור 3 ב). כך, אם כי תמונות של זמן מאוחר נציג או &quot;סוף נקודות&quot; מורפולוגיה המושבה לעיתים קרובות מוצגים בספרות, נוספים וכמותיות הנתונים ניתן לאסוף את זה יאפשר הבנה טובה יותר של פגם biofilm.<img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig1.jpg" /> באיור 1. סוף נקודות assay. נתון זה הוא דוגמה assay סוף נקודות באמצעות נציג שאינו biofilm יוצרי (משמאל) biofilm להרכיב (מימין) זנים של V. fischeri. התמונות הללו נאספו ב 40 שעות שלאחר כתמים. תמונות אלה נוצרו עם wild-type ו &#39; fischeri המכיל בקרת וקטור (לא biofilm יוצרי) או חלק overexpressing הוב&quot;א פלסמיד (biofilm יוצרי) והיו הנתונים שנאספו להגדיר עבור מוריס et al., 2011. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig2.jpg" /> 2. איור זמן מנות assay. הפאנל העליון מכיל תמונות מייצגות של היווצרות biofilm ידי זן biofilm-המוסמכת השליטה V. fischeri במשך הזמן שבחרת. תחילת היווצרות biofilm ניכר על 12 שעות. הפאנל התחתון מכיל אני נציגהמגים של זן מוטנטי של V. fischeri שמספקת עיכוב (4 ג) ב תחילת היווצרות קמטים המושבה לאורך זמן, עם היווצרות biofilm ייזום ב 16 שעות לאחר חיסון. שים לב ב 40 שעות זנים נראים דומה בעוצמת ו דפוסים של היווצרות biofilm, בעוד הבדלים דקים בין זנים אלה הם נצפו רק בנקודות זמן קודמות. תמונות אלה נוצרו עם הוב&quot;א overexpressing wild-type ו sypE מוטציה V. תאים fischeri וחלק היו של הנתונים שנאספו להגדיר עבור מוריס et al., 2011. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig3.jpg" /> 3. איור המושבה בקוטר כניתוח חצי כמותית של היווצרות biofilm. () זמן מהלך היווצרות biofilm על ידי נציג (הפאנל התחתון) זנים biofilm יוצרי (הפאנל העליון) ולא biofilm יוצרי של V. fischeri. שים לב כי המתח biofilm יוצרי מציג עלייה גדולה יותרבקוטר לאורך זמן ביחס למתח הלא biofilm להרכיב. תמונות אלה נוצרו עם wild-type ו &#39; fischeri המכיל חלק overexpressing הוב&quot;א פלסמיד (biofilm יוצרי) או בקרת וקטור (לא biofilm יוצרי) והיו הנתונים שנאספו להגדיר עבור מוריס et al., 2011. (ב) ייצוג גרפי של גידול בקוטר של המושבה לאורך זמן על ידי שני זנים בלוח א &#39;אלה נתונים שנוצרו באמצעות התוכנה ImageJ ו-Excel כמתואר בפרוטוקול.

<ol>
	<li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+survival+mechanisms+of+clinically+relevant+microorganisms.">Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 167-167 (2002).</li><li>Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+as+complex+differentiated+communities.">Biofilms as complex differentiated communities.</a> Annu. Rev. Microbiol. 56, 187 (2002).</li><li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+the+matrix+revisited.">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20 (2005).</li><li>Branda, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis.">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11621 (2001).</li><li>Beyhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+rugosity+and+biofilm+formation+in+Vibrio+cholerae:+comparison+of+VpsT+and+VpsR+regulons+and+epistasis+analysis+of+vpsT,+vpsR,+and+hapR.">Regulation of rugosity and biofilm formation in Vibrio cholerae: comparison of VpsT and VpsR regulons and epistasis analysis of vpsT, vpsR, and hapR.</a> J. Bacteriol. 189, 388 (2007).</li><li>Enos-Berlage, J. L., Guvener, Z. T., Keenan, C. E., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+of+biofilm+development+of+opaque+and+translucent+Vibrio+parahaemolyticus.">Genetic determinants of biofilm development of opaque and translucent Vibrio parahaemolyticus.</a> Mol. Microbiol. 55, 1160 (2005).</li><li>Merritt, J. H., Brothers, K. M., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SadC+reciprocally+influences+biofilm+formation+and+swarming+motility+via+modulation+of+exopolysaccharide+production+and+flagellar+function.">SadC reciprocally influences biofilm formation and swarming motility via modulation of exopolysaccharide production and flagellar function.</a> J. Bacteriol. 189, 8154-8154 (2007).</li><li>Yip, E. S., Geszvain, K., DeLoney-Marino, C. R., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+symbiosis+regulator+rscS+controls+the+syp+gene+locus,+biofilm+formation+and+symbiotic+aggregation+by+Vibrio+fischeri.">The symbiosis regulator rscS controls the syp gene locus, biofilm formation and symbiotic aggregation by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 62, 1586-1586 (2006).</li><li>Morris, A. R., Darnell, C. L., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+a+novel+response+regulator+is+necessary+for+biofilm+formation+and+host+colonization+by+Vibrio+fischeri.">Inactivation of a novel response regulator is necessary for biofilm formation and host colonization by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 82, 114 (2011).</li><li>Nyholm, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Vibrio+fischeri+and+nonsymbiotic+bacteria+in+the+dynamics+of+mucus+secretion+during+symbiont+colonization+of+the+Euprymna+scolopes+light+organ.">Roles of Vibrio fischeri and nonsymbiotic bacteria in the dynamics of mucus secretion during symbiont colonization of the Euprymna scolopes light organ.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5113 (2002).</li><li>Yip, E. S., Grublesky, B. T., Hussa, E. A., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+conserved+cluster+of+genes+promotes+symbiotic+colonization+and+Ï&#x0192;54-dependent+biofilm+formation+by+Vibrio+fischeri.">A novel, conserved cluster of genes promotes symbiotic colonization and Ï&#x0192;54-dependent biofilm formation by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 57, 1485 (2005).</li><li>Mandel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+regulatory+gene+is+sufficient+to+alter+bacterial+host+range.">A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range.</a> Nature. 458, 215 (2009).</li><li>Graf, J., Dunlap, P. V., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+transposon-induced+motility+mutations+on+colonization+of+the+host+light+organ+by+Vibrio+fischeri.">Effect of transposon-induced motility mutations on colonization of the host light organ by Vibrio fischeri.</a> J. Bacteriol. 176, 6986 (1994).</li><li>Geszvain, K., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hybrid+sensor+kinase+RscS+integrates+positive+and+negative+signals+to+modulate+biofilm+formation+in+Vibrio+fischeri.">The hybrid sensor kinase RscS integrates positive and negative signals to modulate biofilm formation in Vibrio fischeri.</a> J. Bacteriol. 190, 4437 (2008).</li><li>Krasteva, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+VpsT+regulates+matrix+production+and+motility+by+directly+sensing+cyclic+di-GMP.">Vibrio cholerae VpsT regulates matrix production and motility by directly sensing cyclic di-GMP.</a> Science. 327, 866 (2010).</li><li>Romling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+rdar+morphotype,+a+multicellular+behaviour+in+Enterobacteriaceae.">Characterization of the rdar morphotype, a multicellular behaviour in Enterobacteriaceae.</a> Cell Mol. Life. Sci. 62, 1234 (2005).</li><li>Berleman, J. E., Chumley, T., Cheung, P., Kirby, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rippling+is+a+predatory+behavior+in+Myxococcus+xanthus.">Rippling is a predatory behavior in Myxococcus xanthus.</a> J. Bacteriol. 188, 5888 (2006).</li><li>Lee, K., Veeranagouda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicrocells+form+by+reductive+division+in+macroscopic+Pseudomonas+aerial+structures.">Ultramicrocells form by reductive division in macroscopic Pseudomonas aerial structures.</a> Environ. Microbiol. 11, 1117 (2009).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

בעבודה זו אנו מתארים שיטה חצי כמותי להערכת היווצרות biofilm באמצעות V. fischeri כאורגניזם מודל. באופן ספציפי, אנו מנצלים מיקרוסקופ לנתח עם קובץ מצורף המצלמה לעקוב אחר היווצרות biofilm ופיתוח כמו הקמת המושבה מקומט לאורך זמן על פני אגר מוצק. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שני סוגים מסוימים של שיטות שאנחנו בדרך כלל להשתמש כדי להעריך את הקמת המושבה מקומט. הראשון הוא assay סוף נקודות, אשר מאפשר לנו לבחון את הארכיטקטורה הסופית, הכוללת 3D, דפוסים, ו בקוטר של התרבות הבחין בכל נקודה שנבחר &quot;הסופי&quot; לעת. גישה זו שימושית ביותר להערכת זנים מוטנטים או תנאים שיובילו ליקויים דרמטיים במבנה biofilm. עם זאת, גישה זו אינה מבחינה בין הבדלים דקים יותר המתרחשות בנקודות זמן עד נקודת הקצה שנבחרה. יותר מקרוב אחר הקמת המושבה מקומט, אנו משתמשים כמובן זמן assay, אשר מאפשר לנו לזהות את תחילת Wrinkled הקמת המושבה ולצפות הפיתוח שלה לאורך זמן. בעקבות גישה זו, הבדלים דקים יותר ב העיתוי של הקמת המושבה מקומט, אדריכלות 3D, ניתן לזהות דפוסים. השתמשנו זה assay כמובן זמן לייצר שני וכמותיות מבחני של היווצרות biofilm. ראשית, הזמן שבו המתח מתחיל לפתח ארכיטקטורת 3D ניתן להשוות לזה של זנים שליטה. מצאנו כי עיכוב היווצרות biofilm של מוטציה מסוימת באותם תנאים הוא עקבי למדי 9. לדוגמה, הנתונים המוצגים בתרשים. 2, מוטציה באופן עקבי הוצגו על עיכוב H 4 בייזום היווצרות biofilm. המדד השני חצי כמותית של היווצרות biofilm הוא השינוי בגודל של בקוטר של המושבה מקומט (נקודה). מצאנו כי הקוטר של מושבות מקומטים בהדרגה שונה מזו של הלא biofilm המושבות, והגיע על ההבדל 2 פי בנקודת זמן סוף (איור 3 </strong&gt;) (מוריס Visick, נתונים שלא פורסמו). נכון להיום, אנחנו לא הבחינו 1 פנוטיפ בלי השני (כלומר, היווצרות biofilm ללא הגדלה של קוטר המושבה) (נתונים שלא פורסמו), אם כי אפשרי עדיין מוטציות מסוימות יתנהג בצורה שונה. אכן, כבר דווח על V. cholerae כי חלק מכך מושבות מקומט לעלייה משמעותית בקוטר המושבה בעוד שאחרים לא 15. עם זאת, להערכת שינוי בקוטר לאורך זמן יכול לסייע ואפיון של מוטנטים biofilm פוטנציאליים ו / או לספק מדד כמותי נוסף של מוטציות עם עיכובים בפיתוח. של שני מדדים של היווצרות biofilm (זמן קוטר), הקובע את תחילת היווצרות המושבה מקומט הוא רגיש יותר, אך גם סובייקטיבית יותר, מאשר לקבוע את הקוטר של המקום. למרות זאת, שני אמצעים לספק הערכה כמותית של חצי פנוטיפ כי הוא שימושי מאוד לחוקרים biofilm אך לא ניתנות בקלות quantification. בעת ביצוע מבחני בתרבית מנוקדים, חשוב להביא בחשבון את התנאים הסביבתיים בהם הבחינו זנים מתורבתים. הקמת המושבה מקומט מושפעת לעתים קרובות על ידי תנאים סביבתיים שונים, כולל זמינות הטמפרטורה מזין, ולחות. כדי להפחית את השונות בין ניסויים, כדאי לבצע סטנדרטיזציה בתנאים אלה ככל האפשר הרבה יותר (כלומר סטנדרטיזציה צלחות אגר לנפח להגדיר culturing זני מנוקדים בטמפרטורה מבוקרת). שליטה נוספת השונות בין ניסויים תצפית, חשוב לכלול את הזנים המתאימים שליטה בתוך כל קבוצה של ניסויים. לבסוף, כאשר מפרשים את נתוני מבחני אלה, יש צורך לבצע כל ניסוי 1 מספר פעמים (3 +), במיוחד כאשר הערכת הבדלים דקים הקמת המושבה מקומט (למשל, עיכוב היווצרות biofilm או הבדלים דפוסים). מספר מגבלות של פרוטוקול זה הם: 1) determining אם התאים יש פגם הצמיחה עלול להיות קשה: הצמיחה של תאים בתרבית נוזל לא יכול לשקף במדויק שיעורי צמיחה על התקשורת מוצקים, וכן קביעת מדויק של צמיחה של biofilm יוצרי תאים, אשר עשויים להישאר יחד, לא יהיה אפשרי; 2) זנים עם פגמים הצמיחה יהיה בעייתי לנתח, 3) זה לא ייתכן שניתן להבחין בהבדלים בין זנים בקוטר עם פנוטיפים biofilm עדינים; 4) עבור זנים שאינם גדלים טבעת הקונצנטרי זה לא יכול להיות אפשרי למדוד במדויק את שינויים בקוטר 5) תוך דפוסים ניתן שנצפו במהלך היווצרות biofilm, אין דרך לכמת את דפוסים של biofilm וכתוצאה מכך, ו 6) אין שום דרך למדוד את Z-מימד של biofilm עם זה ניסיוני הגדרת . למרות מגבלות אלה, פרוטוקול זה בכל זאת מספק אמצעי כדי להשיג נתונים מספריים כדי לסייע בהערכת הקמת המושבה מקומט. בפרוטוקול זה, אנו מנצלים הדמיה ספציפימערכת (כלומר, מיקרוסקופ Zeiss לנתח ואת הקידמה CapturePro הדמיה תוכנה) להתבונן ולהעריך הקמת המושבה מקומט. מערכת הדמיה המתוארת כאן היא חזקה: את היכולת לזהות את תחילת היווצרות קמטים המושבה, ובכך להעריך את התפתחות בגישה כמובן זמן, הוא משפר באמצעות מיקרוסקופ לנתח. עם זאת, אם טכנולוגיה זו אינה זמינה, פרוטוקול יכול להיות מותאם לשימוש עם ציוד אחר, כולל מצלמה דיגיטלית פשוטה עם דגש זום. בעוד פרוטוקול זה מתמקד בהערכה של התפתחות המושבה מקומט, זה יכול גם להיות שונה כדי להעריך את היווצרות קרומית, סוג של biofilm המתפתחת כאשר תאי גדלים באופן סטטי בתרבות נוזלי. פרוטוקול זה יכול גם להיות שימושי בהערכת אינדיקטורים אחרים של היווצרות biofilm, כולל שילוב של צבעים מסוימים אל המושבות הבחין במהלך ההתפתחות biofilm. אלה כוללים, אך לא רק, צבעים כגון קונגו האדום calcofluאו שיכול להיקשר צלולוזה, מרכיב נפוץ של חיידקים biofilms 16. בנוסף, על פרוטוקול זה, אם כי פיתחו לשימוש עם V. fischeri, לא רק אורגניזם זה, אבל ניתן להכליל את לימוד היווצרות biofilm באורגניזמים שונים רבים, כגון subtilis בצילוס 4, Vibrio cholerae 5, parahaemolyticus Vibrio 6, ו Pseudomonas aeruginosa 7, אשר כל היווצרות קמטים התערוכה המושבה. בסופו של דבר, זה גם יכול להיות מותאם ללמוד מורפולוגיות המושבה אחרים שיש להם דפוס התפתחותי, כגון, פוטנציאל, דפוסים המתרחשת במהלך הצמיחה של 17 Myxococcus xanthus ופיתוח מבנה אווירי Pseudomonas aeruginosa 18. פרוטוקול זה הוא, אפוא שימוש בכלל לחוקרים למיקרוביולוגיה biofilm.

<html><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם ציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Zeiss STEMI 2000-C הביתור מיקרוסקופ </td><td> Zeiss </td><td> 45505300000000000 </td><td> (שהושג באמצעות מיקרוסקופ לוקאס) </td></tr><tr><td> הקידמה C10 PLUS </td><td> JENOPTIK אופטי מערכות בע&quot;מ </td><td> 017953-602-26 </td><td> מצורף למצלמה (שהושג באמצעות מיקרוסקופ לוקאס) </td></tr><tr><td> CL 1500 EC מקור אור קר </td><td> Zeiss </td><td> 4355400000000000 </td><td> (שהושג באמצעות מיקרוסקופ לוקאס) </td></tr><tr><td> הקידמה CapturePro </td><td> JENOPTIK אופטי מערכות בע&quot;מ </td><td> תוכנה חופשית עם המצלמה רשום </td><td> המחשב תוכנית לכידת תמונה </td></tr><tr><td> תמונה J </td><td> NIH </td><td> התוכנה החופשית:ij / download.html &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html </td><td> המחשב תוכנית מדידות קוטר </td></tr></tbody></table>

a semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development

Biofilms, או משטח של תאים המחוברים קהילות הגלום מטריקס תאית, מייצגים אורח חיים משותף חיידקים רבים. בתוך biofilm, תאים חיידקיים מציגים לעיתים שינו פיזיולוגיה, כולל עמידות משופרת בפני אנטיביוטיקה ולחצים סביבתיים אחרים 1. בנוסף, biofilms יכול לשחק תפקידים חשובים מארח חיידק אינטראקציות. Biofilms להתפתח כאשר מעבר חיידקים מן הפרט, תאים planktonic כדי ליצור מורכבות, רב תאיים בקהילות 2. במעבדה, biofilms נלמדים על ידי הערכת הפיתוח של פנוטיפים biofilm ספציפיים. פנוטיפ biofilm משותפת כרוכה הקמת מושבות חיידקים מקומט או rugose על אגר מוצק התקשורת 3. הקמת המושבה מקומט מספק אמצעי פשוט ושימושי במיוחד כדי לזהות ולאפיין זני חיידקים המציגים פנוטיפים biofilm שהשתנו ולאחר לחקור תנאים סביבתיים biofilm היווצרות השפעה. WRIהקמת המושבה nkled משמש כאינדיקטור של היווצרות biofilm במגוון רחב של חיידקים, כולל שני חיידקים גראם חיוביים, כגון subtilis בצילוס 4 ו חיידקים גראם שליליים, כגון Vibrio cholerae 5, 6 parahaemolyticus Vibrio, Pseudomonas aeruginosa 7, ו Vibrio fischeri 8. חיידק ימי ו &#39; fischeri הפך מודל ליצירת biofilm בגלל התפקיד הקריטי של biofilms במהלך הקולוניזציה המארח: biofilms המיוצר על ידי ו &#39; fischeri לקדם קולוניזציה של הוואי bobtail דיונון 8-10 Euprymna scolopes. חשוב לציין, פנוטיפים biofilm שנצפתה חוץ גופית לתאם עם היכולת של V. תאים fischeri ביעילות ליישב חיות מארח: זנים לקויי ליצירת biofilm במבחנה בעלי פגם קולוניזציה 9,11, ואילו זנים מציג גדלפנוטיפים biofilm משופרים להתיישבות 8,12. V. fischeri כן מספקת המערכת מודל פשוט להעריך את המנגנונים המווסתים את היווצרות חיידקים אשר biofilm ואיך biofilms המארח קולוניזציה הפגיעה. בדו&quot;ח זה, אנו מתארים את שיטת חצי כמותי להערכת היווצרות biofilm באמצעות V. fischeri כמערכת מודל. שיטה זו כוללת איתור קפדני של תרבויות חיידקים בריכוזים ואמצעי אחסון מוגדרים על גבי מדיה אגר מוצק; התרבות הבחין הוא שם נרדף למושבה חיידקי אחד. טכניקה זו &quot;תרבות הבחינה&quot; יכול להיות מנוצל כדי להשוות פנוטיפים biofilm ברוטו ב בודדות, שצוינו זמן נקודות (נקודה בסוף מבחני), או לזהות ולאפיין פנוטיפים biofilm עדינים בזמן מנות מבחני של פיתוח biofilm מדידות של קוטר המושבה , אשר מושפעת היווצרות biofilm. לכן, שיטה זו מספקת ניתוח חצי כמותית של היווצרות biofilm, לכלmitting הערכת העיתוי ועל דפוסים של התפתחות המושבה מקומט בגודל היחסי של המבנה המתפתח, תכונות המרחיבות מעבר מורפולוגיה הכוללת פשוט.

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development at JoVE.com

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

אנו מספקים פשוט, חצי כמותית שיטה לחקור היווצרות biofilm<em&gt; במבחנה</em&gt;. שיטה זו מנצלת את STEMI Zeiss 2000-C הביתור מיקרוסקופ (עם קובץ מצורף המצלמה) כדי לפקח גם העיתוי של היווצרות דפוס biofilm, כפי שנבחנו על ידי פיתוח של מושבות מקומטים.

גישה חצי כמותי להערכת גיבוש biofilm באמצעות פיתוח המושבה מקומט

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

a-semi-quantitative-approach-to-assess-biofilm-formation-using

Research

JoVE Journal

Biology

23.2K Views.  Loyola University Medical Center. אנו מספקים פשוט, חצי כמותית שיטה לחקור היווצרות biofilm במבחנה. שיטה זו מנצלת את STEMI Zeiss 2000-C הביתור מיקרוסקופ (עם קובץ מצורף המצלמה) כדי לפקח גם העיתוי של היווצרות דפוס biofilm, כפי שנבחנו על ידי פיתוח של מושבות מקומטים.

Video: A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated through myosin-actin interactions and play an important role in our physiology.  During development, they enable cells to move from one location to the next in order to form the early structures of tissue.  Traction forces help in the healing processes.  They are necessary for the proper closure of wounds or the migration and crawling of leukocytes through our body.  These same forces can be detrimental to our health in the case of cancer metastasis or vascular growth towards a tumor.  The most common method by which to study cells in vitro has been to use a glass or polystyrene dish.  However, the rigidity of the substrates makes it impossible to physically measure cell traction forces, and there are relatively few methods to study traction forces.  Our lab has developed a technique to overcome these limitations.  The method is based on a vertical array of flexible cantilevers, the stiffness and size scale of which are such that individual cells spread across many cantilevers and deflect them in the process.  The pillars we use are 3 &mu;m in diameter, 10 &mu;m tall, and are configured in a regular array with 9 &mu;m center-to-center spacing.  But these physical dimensions can be readily varied to accommodate a variety of studies.  We start with a silicon master, but the final posts are made out of silicone rubber called poly (dimethyl siloxane), or PDMS.  We can measure the deflections under a microscope and calculate the magnitude and direction of traction forces required to produce the observed deflections.  We call these substrates microfabricated post-array-detectors, or mPADs.  Here, we will show you how we fabricate and use the mPADs to assess modulations of cellular contractility.

Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

In this video, we demonstrate how to fabricate and utilize microfabricated post array detectors (mPADs) to assess modulations of cellular contractility.

Microfabricated פוסט מערך גלאים (mPADs): גישה לבודד כוחות מכניים

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated ...

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic activity of vascular endothelial cells in vitro1-5. However, recently growing evidence has shown that this assay is not limited to test vascular behavior for endothelial cells. Instead, it also has been used to test the ability of a number of tumor cells to develop a vascular phenotype6-8. This capability was consistent with their vasculogenic behavior identified in xenotransplanted animals, a process known as vasculogenic mimicry (VM)9. There is a multitude of evidence demonstrating that tumor cell-mediated VM plays a vital role in the tumor development, independent of endothelial cell angiogenesis6, 10-13. For example, tumor cells were found to participate in the blood perfused, vascular channel formation in tissue samples from melanoma and glioblastoma patients8, 10, 11. Here, we described this tubular network assay as a useful tool in evaluation of vasculogenic activity of tumor cells. We found that some tumor cell lines such as melanoma B16F1 cells, glioblastoma U87 cells, and breast cancer MDA-MB-435 cells are able to form vascular tubules; but some do not such as colon cancer HCT116 cells. Furthermore, this vascular phenotype is dependent on cell numbers plated on the Matrigel. Therefore, this assay may serve as powerful utility to screen the vascular potential of a variety of cell types including vascular cells, tumor cells as well as other cells.

A tube formation assay is used to evaluate vascular activity of tumor cells.

Matrigel מבוסס גיבוש Tube Assay להעריך את פעילות Vasculogenic של תאים סרטניים

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

המרת ELISA ללכוד Assay Luminex Xmap באמצעות נוגדן Multiplex שיטת הקרנה

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

מעקב נייד באמצעות חלבוני Photoconvertible במהלך פיתוח דג זברה

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Explants Blastomere לבדיקת מחויבות גורל תא במהלך התפתחות עוברית

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to the histological and morphological development of vertebrate embryos. In particular, the use of chimeric embryos has established the importance of neural crest in directing the species-specific morphology of the craniofacial complex. The method described herein utilizes two avian species, duck and quail, with remarkably different craniofacial morphology. This method greatly facilitates the investigation of molecular and cellular regulation of species-specific pattern in the craniofacial complex.&#160;Experiments in quail and duck chimeric embryos have already revealed neural crest-mediated tissue interactions and cell-autonomous behaviors that regulate species-specific pattern in the craniofacial skeleton, musculature, and integument. The great diversity of neural crest derivatives suggests significant potential for future applications of the quail-duck chimeric system to understanding vertebrate development, disease, and evolution.

This article describes a method to generate chimeric embryos that are&#160;designed to test the species-specific contributions of neural crest and/or other tissues to craniofacial development.

הערכת תרומות מינים ספציפיות כדי Craniofacial פיתוח באמצעות מפלצות שליו-ברווז

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

The Soft Agar Colony Formation Assay

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft agar colony formation assay is a well-established method for characterizing this capability in vitro and is considered to be one of the most stringent tests for malignant transformation in cells. This assay also allows for semi-quantitative evaluation of this capability in response to various treatment conditions. Here, we will demonstrate the soft agar colony formation assay using a murine lung carcinoma cell line, CMT167, to demonstrate the tumor suppressive effects of two members of the Wnt signaling pathway, Wnt7A and Frizzled-9 (Fzd-9). Concurrent overexpression of Wnt7a and Fzd-9 caused an inhibition of colony formation in CMT167 cells. This shows that expression of Wnt7a ligand and its Frizzled-9 receptor is sufficient to suppress tumor growth in a murine lung carcinoma model.

The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.

Assay גיבוש רך אגר המושבה

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

גאפ junctional אינטר תקשורת: ביומרקר פונקציונלית להערכת תופעות לוואי של toxicants ורעלים, ואת היתרונות הבריאותיים של מוצרים טבעיים

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency

Transepithelial/endothelial electrical resistance (TEER) has been used since the 1980s to determine confluency and permeability of in vitro barrier model systems. In most cases, chopstick electrodes are used to determine the electric impedance between the upper and lower compartment of a cell culture filter insert system containing cellular monolayers. The filter membrane allows the cells to adhere, polarize, and interact by building tight junctions. This technique has been described with a variety of different cell lines (e.g., cells of the blood-brain barrier, blood-cerebrospinal fluid barrier, or gastrointestinal and pulmonary tract). TEER measurement devices can be readily obtained from different laboratory equipment suppliers. However, there are more cost-effective and customizable solutions imaginable if an appropriate voltammeter is self-assembled. The overall aim of this publication is to set up a reliable device with programmable output frequency that can be used with commercially available chopstick electrodes for TEER measurement.

Here, we demonstrate how to set up an inexpensive volt-amperemeter with programmable output frequency that can be used with commercially available chopstick electrodes for transepithelial/endothelial electrical resistance measurements.

גישה פשוטה לבצע מדידות הטיר באמצעות עצמית וולט-אמפר מונה עם תדר פלט ניתן לתיכנות

Transepithelial/endothelial electrical resistance (TEER) has been used since the 1980s to determine confluency and permeability of in vitro barrier model ...

Development of an Individual-Tree Basal Area Increment Model using a Linear Mixed-Effects Approach

Here, we developed an individual-tree model of 5-year basal area increments based on a dataset including 21898 Picea asperata trees from 779 sample plots located in Xinjiang Province, northwest China. To prevent high correlations among observations from the same sampling unit, we developed the model using a linear mixed-effects approach with random plot effect to account for stochastic variability. Various tree- and stand-level variables, such as indices for tree size, competition, and site condition, were included as fixed effects to explain the residual variability. In addition, heteroscedasticity and autocorrelation were described by introducing variance functions and autocorrelation structures. The optimal linear mixed-effects model was determined by several fit statistics: Akaike&#8217;s information criterion, Bayesian information criterion, logarithm likelihood, and a likelihood ratio test. The results indicated that significant variables of individual-tree basal area increment were the inverse transformation of diameter at breast height, the basal area of trees larger than the subject tree, the number of trees per hectare, and elevation. Furthermore, errors in variance structure were most successfully modeled by the exponential function, and the autocorrelation was significantly corrected by first-order autoregressive structure (AR(1)). The performance of the linear mixed-effects model was significantly improved relative to the model using ordinary least squares regression.

Mixed-effects models are flexible and useful tools for analyzing data with a hierarchical stochastic structure in forestry and could also be used to significantly improve the performance of forest growth models. Here, a protocol is presented that synthesizes information relating to linear mixed-effects models.

פיתוח מודל תוספת קבועה של אזור בזלית של עץ יחיד באמצעות גישה ליניארית של אפקטים מעורבים

Here, we developed an individual-tree model of 5-year basal area increments based on a dataset including 21898 Picea asperata trees from 779 sample plots ...