המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר סילביה B קמפוס, Bilderback וג&#39;ורג&#39; J רודוס להשלמת הליכים כירורגיים מעורבים מיקום של קווי גישה ורידים. הם גם רוצים להודות לשרה E לגמול לשמירה על מושבות מינכן-Wistar המורכבת משני זנים וFrömter סימונסן.

1. נטיה של סרום אלבומין לעכברוש כלוריד Sulfonyl 101 sulfo-Rhodamine (טקסס האדומה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 100 מ&quot;ג של עכברוש 6.667 מיליליטר סרום אלבומין (RSA) ב100 מ&quot;מ של סודיום ביקרבונט pH 9.0, ריכוז סופי 15 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בשפופרת 50 מיליליטר חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון מקום בכוס קרח / מים ומגניבים בין 0 עד 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של לפוראמיד דימתיל איכות הגבוהה נטול מים (DMF) לבקבוקון 10 מ&quot;ג של כלוריד Sulfonyl האדום טקסס (TRSC); מערבולת על מדיום במשך 15 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון RSA במערבולת בינונית ומוסיף TRSC המומס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעטוף 50 מ&quot;ל חרוטי בנייר הכסף (Parafilm יכול לשמש כדי להבטיח חותם חזק נוצר), מקום אופקי בדלי קרח w / קרח בלבד ומניח על נדנדה כדי להתסיס פתרון לאט (למנוע היווצרות של בועות), מאפשרים תגובה להמשיך ב0 עד 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 5 ליטר של תמיסת מלח 0.9%, והרטיב 50 kDa משקל מולקולרי נותק תא שיכול להיות קרום דיאליזה) עם קליפים, ב) דיצינורות alysis כמו בלצוף-lyzer, או ג) קלטת שקופית-lyzer (כל מתאים להסרת TRSC unconjugated). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת תגובת מקום בתא הדיאליזה והמקום במכל L w 5 / תמיסת מלח 0.9%, dialyze לילה בשעה 4 ° C עם תסיסה עדינה באמצעות סרגל ומערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את פתרון דיאליזה L 5 בבוקר ובשעתי אחר הצהריים מאוחרות, עד שתוצאות דגירה לילה בכמעט ללא שינוי צבע (זה בדרך כלל לוקח ~ 48 שעות עם לפחות 4 חילופים). בנוסף, עם MWCO של 50 kDa להיות כל כך קרוב למגוואט של RSA, 66kDa; זה אפשרי לא לייצר פתרון ברור, זה יהיה תלוי בהפצה בגודל הנקבובית של הקרום; 60 שעות ו -5 חילופים היא יותר ממספיק זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח מדוד ולחלק את המשקל ההתחלתי של 100 מ&quot;ג בנפח לתת ריכוז משוער של TR-RSA; בדרך כלל טווח ריכוזים 10-13 מ&quot;ג / מ&quot;ל. צבע הסופי: יחס אלבומין צריך להיות ~, 1 fluorophore 04:01 ל15,000 Daltons של MW החלבון. חנות ב 4 ° C, אף פעם לא להקפיא את פתרון TR-RSA, כתוצאת פיצול שעלול להתרחש תשנה ערכי חדירות. </li></ol> 2. מכין את הבמה מיקרוסקופ הפוכה להגדרות הדמיה / מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ~ 4-7 חתיכות של נייר חיטוי (¾ &quot;ארוך כ) נערמות אחד על השני בצורה מושלמת בתוך צלחת 50 מ&quot;מ עם תחתית coverslip 40 מ&quot;מ (צלחת תחתית coverslip). אלה צריכים להיות ממוקמים קרובים יותר לאחד הקצוות, כך ש קצה של הקלטת יהיה ליצור קשר עם הקצה של עקמומיות של הכליה, אך לא לחסום את נתיב האור האובייקטיבי (האיורים 1A ו-1B); חולדות גדולות יותר ידרשו יותר מקום בין הסרט לבין קצה הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 2 רפידות Repti-THERM הקרובים לבמה לצד המנה 50 מ&quot;מ (איור 1 א). הנח שמיכת ז&#39;קט מים התחממות מעל הבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקסם את היעילות בעת איסוף תמונות על ידי הבטחת הצריח האובייקטיבי יש אוויר O 10xR 20x (אוויר או מים טבילה) אובייקטיבי ואובייקטיבי טבילה במים מופעל גבוהה כדי לאסוף תמונות כדי לכמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדמיה את הדרך היעילה ביותר כדי להוסיף מים למטרות היא לסובב אותם לצד ומוסיף מים באמצעות מזרק 1 סמ&quot;ק עם חתיכה ארוכה של PE-200 צינורות שיכולים להגיע לפסגה של המטרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את עוצמת העירור של לייזר 10watt ל ~ 15-20% תוך שימוש במסנני הצפיפות ניטראליים על התוכנה. את photodetectors descanned שאינו זרח גליום arsenide נקבעים 750 לאסוף פליטות ירוקות, ו625 לאסוף את הפליטה אדומה. פליטה הכחולה (כגון Hoechst 33342 גרעיני הכתם) נאספות באמצעות גלאי multialkaline nondescanned סטנדרטי עם הגדרה בין 750-800. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח את האוסף הנכון של פליטות בעצימות הנמוכות בתוך החלל של באומן, לוודא את הגבולות התחתונים של הגלאים מוגדרים כדי לא לכלול את הערכים הללו. סמני אזהרה חזותיים יציינו אם הרגישותההגדרה היא נמוכה מדי וערכים אלה מקבלים ערך עוצמת אפס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מזרק 1 סמ&quot;ק עם ~ 5-8 מ&quot;ג של אלבומין פתרון הניאון מדולל עם 0.9% מלח סטרילית כדי להעלות את הנפח הכולל עד 1 סמ&quot;ק. </li></ol> 3. הדמיה חושף את הכליה בחולדת Wistar מינכן לIntravital 2-פוטון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל עם עכברוש מראש מורדם באמצעות Pentabarbitol (פתרון מ&quot;ל 50 מ&quot;ג /, 120 גר &#39;משקל גוף μl/100), Inactin (פתרון מ&quot;ל 130 מ&quot;ג /, 120 גרם במשקל μ/100 גוף), או isofluorane (5% אינדוקציה, 1.5 לרמה של 2.5% אחזקה), שורת שכינת ורידי גישה (או ורידי הצוואר או הירך), והאגף השמאלי גילח מ, ממש מתחת לבית החזה כדי בדיוק מעל הירך השמאלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החולדה שטוחה בצדו ממני, כך שצד השמאל, מגולח הוא פונה כלפי מעלה; לוודא שהוא שטוח על השולחן, עם היציבה שלו מוארכת ולא שפופה, עם רגליו קדמיות נוגעות זה בזה ומאחור כפות נוגעות זה בזה (איור 2 א). </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאוד בעדינות למשש להרגיש את הכליה כדי לקבוע היכן מניח אותו באופן טבעי בתוך retroperitoneum ולצייר קו ישר במקביל לגוף (מבית החזה לירך) באמצעות טוש (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים את העור עם זוג המלקחיים שיניים, ולצבוט את העור לאורך הקו נמשך באמצעות זוג hemostats כדי למחוץ את הרקמה ולמנוע דימום. לחתוך לאורך החתך בעזרת זוג המספריים כירורגיות. ריסוק העור החיצוני ואת שכבות שרירים לפני החיתוך יהיה להפחית באופן דרמטי ובדרך כלל למנוע דימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך עבור שכבת השריר החיצונית, שהוא רזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתך לתוך שכבת השריר הפנימית, שיחשוף את הצפק, מחדש למשש את הכליה כדי להעריך את הגודל. צבוט קו חתך קטן יותר מהכליה; מבטיח חתך הוא רק מעל הכליה. עדיף לעשות החתך הזה קטן מדי ולהפוך אותו גדול יותר במידת הצורך. אם זה נעשה גדול מדי, תפירה תידרש.החתך אחרון זו הוא קריטי; רחוקה מדי מעל לכל כיוון ישפיע על יציבות על הבמה ולגרום גם ממצא תנועה מנשימה (תרחיש מקרה הטוב ביותר) או ימתח פרפוזיה גבעול ולהפחית לרעה הכליות (תרחיש מקרה הגרוע ביותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את הכליות (כפי שמוצג באיור 2) ואחיזת השומן שמסביב באמצעות מלקחיים, פועל לקוטב התחתון של הכליה ביד אחרת יד האופנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהקוטב התחתון של הכליה הוא הגיע, משוך בעדינות את הכליה דרך החתך בעדינות רבה תוך סחיטה מתחת לכליות לexteriorize. אם החתך קטן מדי, למעוך את שכבת השריר ולחתוך להרחבתו; לחזור על התהליך לexteriorize כליות. </li></ol> 4. הצבת עכברוש Wistar מינכן בשלב הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הכליות לכיוון הקצה של צלחת coverslip עם הכליה מעט הסתובב לכיוון (בצד האחורי) הגב של העכברוש כל כך בצד הגחוני של כליותיישל יצירת קשר עם צלחת תחתית coverslip (איור 1 א). הוסף% פתרון חימם, סטרילי 09. מלח למנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסתכל דרך אובייקטיבי 10x או 20x ולבדוק לתנועה. אם הצעה הוא זוהה, לגלגל את העכבר מעל מעט כל כך את בית החזה הוא רחוקה יותר מצלחת תחתית coverslip; לוודא הכליות הן קרובה לקצה הצלחת ללא מתיחה (איור 1) pedicle כליות. </li></ol> 5. רכישת תמונות לכמת חדירות כליות של אלבומין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב חדירות גלומרולרי (מקדם Glomeruluar הסינון; GSC) של כל מקרומולקולה ידרוש לקחת תמונות רקע התייחסות של glomeruli הבודדים לפני העירוי של מולקולת הניאון. אם המיקרוסקופ שלך מצויד בבמה ממונעת מסוגלים סימון מיקומים, ולמצוא glomeruli הבודדים מרכז באמצעות העצמה נמוכה יותר אובייקטיבי ולסמן כל מיקום. מסירה כפולה העמסה / Rhodamine epifluorescence filter הוא אידיאלי להליך זה למרות שגם מסנן הפליטה יעבוד (לעומת שלב או ממקורות שאינם הקרינה אחרות של תאורה לא יעבדו). Glomeruli יופיע כמבנים עגולים ריקים מוקפים בצינוריות הפרוקסימלי יש autoflourescence הצהוב כתום גלום כאשר נצפים מבעד לעבור סינון הכפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המיקרוסקופ שלך לא חייב במה ממונעת, לסרוק הכליות בדפוס סריקה במטרה בעצמה הנמוכה ולהפוך את המפה בסיסית של הפרט שבו glomeruli נמצאים; להסתמך על ציוני דרך טבעיות כגון כלי דם שטחיים גדולים הממוקמים מעל הקפסולה הכליות או כתמי שומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את הצריח למטרת הטבילה במי החשמל הגבוהה ולקחת ערכות נתונים 3D של כל glomeruli לוודא את לולאות הנימים והמרחב של האומן גלויים לעין. שימוש בצבעי pseudocolor (משהו אחר מאשר B / W) יעזור לדמיין מבנים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התמקדות בכלי דם שטחי להחדיר לאט בtהוא זמן לוודא אלבומין ניאון הוא נתון, כדי לאפשר החלוקה מערכתית. למולקולות עם GSC הנמוך זה הכרחי כדי למקסם את ערכי עוצמה בפלזמה, אבל לא להגיע לרמות שיהיו להרוות את התמונה גלאי במיקרוסקופ. זה מגדיל detectability של מולקולות מסוננות. הערה: יש בדרך כלל 5-7 שניות בין לשגות זמן אלבומין ניאון הוא הציג בפעם שהוא מופיע על המסך (רכישת מסגרות מלאות במסגרת ~ 1 / שנייה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר כ 10 דקות כדי לאפשר לכל ברי משקל מולקולריים קטנים פוטנציאליים כדי לנקות לפני רכישת כרכי 3D במרווחים של 1 מיקרומטר כדי לשמש בחישוב GSC אלבומין. בדרך כלל, המתח של סימונסן של מינכן Wistar חולדות יש הרבה פחות שטח glomeruli, אז כל מה שיכול להיות דמיינו הם צילמו וכימות. יש מתח Frömter מספר גדול בהרבה ולכן אנחנו מגבילים את המספר לכמת ל ~ 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף המחקר את העכברוש הוא מורדמים באמצעות מנת יתר של anesthetIC בשימוש במחקר. Pneumothoracotamy כפול מבוצע כדי להבטיח המתת חסד. </li></ol> 6. חישוב GSC לפלורסנט אלבומין מכרכי 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנת עיבוד תמונת Metamorph לטעון את ערכות נתונים 3D עבור כל glomeruli, הן סט הרקע ולהגדיר נלקח לאחר עירוי של אלבומין ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהיקף המכיל אלבומין ניאון לאתר לולאת נימים שטחית עם חלל ריק מספיק מקום בין השוליים המוגדרים שלה והקצה של הקפסולה של באומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהיקף הרקע לאתר אותו מישור המוקד שאמור להכיל את כל הרמזים החזותיים של התמונה המכילה אלבומין. בחר אזור בתוך לולאת הנימים של עניין ולציין את עוצמת הקריאה הממוצעת. הבא בחרו אזור בשטח של באומן ולציין את עוצמת הקריאה הממוצעת. אלה ישמשו כערכי רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת, בחר את האזור הדומה בתוך החלל של באומן בג אלבומיןontaining תמונה. האם זה במשך לפחות שני אזורים אחרים לקחת ערך ממוצע לעצמה הממוצעת בתוך החלל של באומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את לולאת הנימים עם עוצמת הפלזמה הבהירה ולצייר אזור סביבו. הבא באמצעות פונקצית הסף, להדגיש את הערכים הבהירים בתוך הפלזמה במחזור, תוך הימנעות מפסים הכהים שהמחזור של RBC. שימו לב לערכי עוצמה הממוצעים של חלל הפלזמה שנבחר. חשוב לבחור מעדיף את האזורים הבהירים של הפלזמה בגלל גורמים בתוך הדם ישמשו אך ורק כדי לגרום ולהערכה נמוכה מדי של רמות הקרינה הפלזמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בגיליון אלקטרוני של Excel של מיקרוסופט להזין את הערכים כדי לחשב את GSC שבו: </li></ol><img alt="איור 1" fo:content-width="2.95in" fo:src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1.jpg" />

<ol>
	<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+kidney+filters+nephritic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells;+retrieval+is+disrupted+in+nephritic+states.">The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states.</a> Kidney International. 71, 504 (2007).</li><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy.">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (3), 489 (2009).</li><li>Sandoval, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+factors+influence+glomerular+albumin+permeability+in+rats.">Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 447 (2012).</li><li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique.">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263, 601 (1992).</li><li>Asgeirsson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+sieving+of+three+neutral+polysaccharides,+polyethylene+oxide+and+bikunin+in+rat:+Effects+of+molecular+size+and+conformation.">Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation.</a> Acta Physiologica. 191 (3), 237 (2007).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+endocytosis+in+vivo+using+intravital+two-photon+microscopy.">Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 389 (2008).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+imaging+of+renal+function+by+multi-photon+microscopy.">Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9 (2007).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

הצעדים המודגשים כאן מייצגים את מה שאנחנו מרגישים להיות אלה שמייצרים ערכי חדירות עקביות ומדויקים משום שהם לעקוף את המלכודות הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיזור: השימוש בfluorophores פולטות אדום מאפשר גבייה יעילה יותר של אור מאז פוטונים באורך גל ...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope</td>
 <td>Olympus America</td>
 <td></td>
 <td>Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser</td>
 <td>Spectra-Physics</td>
 <td></td>
 <td>Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gallium arsenide phosphide photodetectors</td>
 <td>Hamamatsu Corp</td>
 <td></td>
 <td>Note: Front or Side mounted configurations available.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Metamorph Image processing Software</td>
 <td>Molecular Dynamics</td>
 <td></td>
 <td>Note: Version 6.1r1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microsoft Excel</td>
 <td>Microsoft Corportation</td>
 <td></td>
 <td>2007 version</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Handling Forceps</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78266-04</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mayo Dissecting Scissors</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72962</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CA Micro scissors Model 1C300</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78180-1C3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kelly Hemostatic Forceps (straight)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72930</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water Jacket Blanket + Heating Pad</td>
 <td>Gaymar</td>
 <td></td>
 <td>T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Repti-Therm Under Tank Heater</td>
 <td>ZooMed</td>
 <td></td>
 <td>RH-4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Texas Red Sulfonyl Chloride</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>Cat# T-353</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat Serum Albumin</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# A-6272</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High Quality Anhydrous DMF</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# 270547</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Strate-Line Autoclave Tape</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>Cat# 11-889-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 70665-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in munich wistar rats

מחלות כליה הקשורות אובדן שתן של מולקולות חיוניות גדולות, כגון אלבומין, כבר מזמן חשבתי להיגרם על ידי שינויים בחדירות המחסום מורכבים מpodocytes, תאי אנדותל כלי דם, וקרום במרתף עובד בהרמוניה. נתונים מהמעבדה שלנו באמצעות מיקרוסקופ 2 הפוטונים intravital חשפו מחסום חדיר יותר גלומרולרי סינון (GFB) מאשר סברו עד כה בתנאים פיסיולוגיים, עם ליפה של אלבומין המסונן המתרחש בקבוצת משנה מוקדמת של תאים הנקרא תאי אבובית הפרוקסימלית (PTC) 1,2, 3. טכניקות קודמות שימש ללמוד סינון הכלייתי והקמה אופיינית למחסום הסינון המעורב micropuncture של לומן של המגזרים צינורי המוקדמים אלה עם דגימה של התוכן וניתוח 4 נוזל. מחקרים אלה קבעו ריכוז אלבומין בנוזל luminal להיות כמעט לא קיים; מקביל באופן הדוקלמה שבדרך כלל הוא זוהה בשתן. עם זאת, אפיון של הפולימרים dextran עם גדלים שהוגדרו על ידי טכניקה זו חשף אלה של גודל דומה לאלבומין בסרום היו רמות גבוהות יותר בלומן ושתן צינורי; מציע חדירות מוגברת 5. מסמך זה הוא תיאור מפורט של הטכניקה המשמשת כדי להמחיש באופן ישיר ולכמת חדירות אלבומין ניאון גלומרולרי in vivo. שיטה זו מאפשרת זיהוי של אלבומין מסונן על פני מחסום הסינון לתוך החלל של באומן (הקאמרית הראשוני של סינון שתן), וגם מאפשרת כימות של ספיגה חוזרת אלבומין על ידי צינוריות והדמיה של transcytosis 6 הבא אלבומין הפרוקסימלי. העדרו של ניאון אלבומין יחד מאוחרת מגזרים צינורי בדרך לשלפוחית ​​השתן מדגיש את היעילות של המסלול אחזור במגזרים אבובית הפרוקסימלי קודם לכן. יתר על כן, כאשר טכניקה זו יושמה כדי לקבוע חדירותשל dextrans בעל גודל דומה לערכי חדירות כמעט זהים אלבומין דווח 2. תצפיות אלו תומכות ישירות בצורך להרחיב את הפוקוס של מחלות כליות proteinuric רבות לשינויים שנכללו בטיוב תא אבובית הפרוקסימלי.

איור 3 מראה דוגמה של תמונה שנלקחה מglomerulus פני השטח של עכברוש Frömter Wistar מינכן ואת הצעדים שננקטו כדי לקבוע את החדירות של ניאון אלבומין. ערך GSC לאלבומין של 0.0111 נגזר לglomerulus נפילת אדם זה בטווח ראה בזן זה של חולדות מינכן Wistar כאשר במצב הפד 3. היציבות ראתה בתמונות א...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats at JoVE.com

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

טכניקת ניצול הרזולוציה הגבוהה intavital מיקרוסקופיה 2 פוטונים ישירות לדמיין ולכמת סינון gloemrular במשטח glomeruli. שיטה זו מאפשרת קביעה ישירה של מאפייני חדירות של מולקולות במצבים נורמלים ובחולים.

כימות חדירות גלומרולרי של מקרומולקולות פלורסנט באמצעות מיקרוסקופ 2-פוטון בחולדות Wistar מינכן

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

quantifying-glomerular-permeability-fluorescent-macromolecules-using

Research

JoVE Journal

Medicine

10.4K Views.  Indiana University School of Medicine. טכניקת ניצול הרזולוציה הגבוהה intavital מיקרוסקופיה 2 פוטונים ישירות לדמיין ולכמת סינון gloemrular במשטח glomeruli. שיטה זו מאפשרת קביעה ישירה של מאפייני חדירות של מולקולות במצבים נורמלים ובחולים.

Video: Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; עכבר דגם של סוכרת מסוג 2: בידוד לבלב וLive- תא 2-פוטון הדמיה של איי שלמים

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

מיקרוסקופ intravital להערכת סרטניים הקשורים לשימוש מתקדם הגבי צ'יימברס Skinfold חלון על העכברים הטרנסגניים פלורסנט

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. It has become important to measure a person's activities in daily life, and not just measure their capacity for activity in the structured environment of a clinic or laboratory. A wearable sensor that is now enabling measurement of daily movement is the accelerometer. Accelerometers are commercially-available devices resembling large wrist watches that can be worn throughout the day. Data from accelerometers can quantify how the limbs are engaged to perform activities in peoples' homes and communities. This report describes a methodology to collect accelerometry data and turn it into clinically-relevant information. First, data are collected by having the participant wear two accelerometers (one on each wrist) for 24 h or longer. The accelerometry data are then downloaded and processed to produce four different variables that describe key aspects of upper limb activity in daily life: hours of use, use ratio, magnitude ratio, and the bilateral magnitude. Density plots can be constructed that visually represent the data from the 24 h wearing period. The variables and their resultant density plots are highly consistent in neurologically-intact, community-dwelling adults. This striking consistency makes them a useful tool for determining if upper limb daily performance is different from normal. This methodology is appropriate for research studies investigating upper limb dysfunction and interventions designed to improve upper limb performance in daily life in people with stroke and other patient populations. Because of its relative simplicity, it may not be long before it is also incorporated in clinical neurorehabilitation practice.

This protocol describes a method to quantify upper limb performance in daily life using wrist-worn accelerometers.

שיטה לכימות ביצוע גפיים עליונים ב Daily Life בעזרת מדי תאוצה

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

In Vivo Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&#232;re's Disease Ears and Normal Hearing Ears

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this patient group but has yet to be confirmed. This protocol describes a method of in vivo evaluation of neural changes especially well suitable for cranial nerve analysis using magnetic resonance imaging (MRI). MD-patients and normal hearing persons were examined in a 3-T MR-scanner using a scan protocol including strongly T2-weighted 3D gradient-echo-sequence (3D-CISS). In the patient group, MD was additionally confirmed using MRI-based assessment of endolymphatic hydrops. Morphometric analysis was performed using a freeware DICOM viewer. Evaluation of cranial nerves included measurements of cross-sectional areas (CSAs) of the nerves at different levels as well as orthogonal diametric measurements.

&lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&amp;#232;re&#039;s Disease Ears and Normal Hearing Ears

To evaluate morphological changes of cranial nerves such as loss of neural structures or swelling of cranial nerves in Meni&#232;re&#39;s Disease (MD) or in healthy persons in vivo, a protocol of evaluation has been developed using magnetic resonance imaging (MRI). Additional MRI-based confirmation of MD was performed.

אין ויוו ניתוח Morphometric של עצבי האנושי באמצעות תהודה מגנטית של Menière מחלת האוזניים ואת האוזניים שמיעה רגילה

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

הערכה של תפקוד כליות במודלים של העכבר של מחלת Glomerular

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of acute kidney injury and chronic kidney disease. The measurement system consists of a miniaturized fluorescence detector that is directly attached to the skin on the back of conscious, freely moving animals, and measures the excretion kinetics of the exogenous GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin (an inulin analog). This system has been described in detail in rats. However, because of their smaller size, measurement of transcutaneous GFR in mice presents additional technical challenges. In this paper we therefore provide the first detailed practical guide to the use of transdermal GFR monitors in mice based on the combined experience of three different investigators who have been performing this assay in mice over a number of years.

Here we describe a protocol to measure glomerular filtration rate (GFR) in conscious, freely moving mice using a transdermal GFR monitor.

Transdermal מדידה של קצב הסינון Glomerular בעכברים

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the glomerulus and reabsorbed in the tubular system up until the absorption limit is reached. Early increases in pathological albumin filtration may, thus, be missed by analyzing albuminuria. Therefore, the use of tracers to test glomerular permselectivity appears advantageous. Fluorescently labeled tracer fluorescein isothiocyanate (FITC)-polysucrose (i.e., FITC-Ficoll), can be used to study glomerular permselectivity. FITC-polysucrose molecules are freely filtered by the glomerulus but not reabsorbed in the tubular system. In mice and rats, FITC-polysucrose has been investigated in models of glomerular permeability by using technically complex procedures (i.e., radioactive measurements, high-performance liquid chromatography [HPLC], gel filtration). We have modified and facilitated a FITC-polysucrose tracer-based protocol to test early and small increases in glomerular permeability to FITC-polysucrose 70 (size of albumin) in mice. This method allows repetitive urine analyses with small urine volumes (5 &#181;L). This protocol contains information on how the tracer FITC-polysucrose 70 is applied intravenously and urine is collected via a simple urinary catheter. Urine is analyzed via a fluorescence plate reader and normalized to a urine concentration marker (creatinine), thereby avoiding technically complex procedures.

Here, we present a protocol to test glomerular permeability in mice using a highly sensitive, nonradioactive tracer. This method allows repetitive urine analyses with small urine volumes.

מדידה רגישה מאוד של חדירות הפקאוליות בעכברים עם פלואורואסעין איזוטיקריאט-פוליסוכרוז 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes the atrioventricular node (AVN), to allow excitation and contraction of the whole heart. Any dysfunction of either SAN or AVN results in arrhythmias, indicating their fundamental role in electrophysiology and arrhythmogenesis. Mouse models are widely used in arrhythmia research, but the specific investigation of SAN and AVN remains challenging.
The SAN is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava and AVN is located at the apex of the triangle of Koch, formed by the orifice of the coronary sinus, the tricuspid annulus, and the tendon of Todaro. However, due to the small size, visualization by conventional histology remains challenging and it does not allow the study of SAN and AVN within their 3D environment.
Here we describe a whole-mount immunofluorescence approach that allows the local visualization of labelled mouse SAN and AVN. Whole-mount immunofluorescence staining is intended for smaller sections of tissue without the need for manual sectioning. To this purpose, the mouse heart is dissected, with unwanted tissue removed, followed by fixation, permeabilization and blocking. Cells of the conduction system within SAN and AVN are then stained with an anti-HCN4 antibody. Confocal laser scanning microscopy and image processing allow differentiation between nodal cells and working cardiomyocytes, and to clearly localize SAN and AVN. Furthermore, additional antibodies can be combined to label other cell types as well, such as nerve fibers.
Compared to conventional immunohistology, whole-mount immunofluorescence staining preserves the anatomical integrity of the cardiac conduction system, thus allowing the investigation of AVN; especially so into their anatomy and interactions with the surrounding working myocardium and non-myocyte cells.

We provide a step-by-step protocol for whole-mount immunofluorescence staining of the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) in murine hearts.

צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה, הדמיה קונפוקלית ושחזור תלת ממדי של הצומת הסינואטרולי והאטריובנטריקולרי בעכבר

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

בידוד ותרבות של מקרופאגים לבביים תושבים מהצומת הסינואטריאלית והאטריובנטריקולרית של מורין

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Analyzing Long-Term Electrocardiography Recordings to Detect Arrhythmias in Mice

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ineffective in many patients. To improve patient care, novel and innovative therapeutic concepts causally targeting arrhythmia mechanisms are needed. To study the complex pathophysiology of arrhythmias, suitable animal models are necessary, and mice have been proven to be ideal model species to evaluate the genetic impact on arrhythmias, to investigate fundamental molecular and cellular mechanisms, and to identify potential therapeutic targets.
Implantable telemetry devices are among the most powerful tools available to study electrophysiology in mice, allowing continuous ECG recording over a period of several months in freely moving, awake mice. However, due to the huge number of data points (&gt;1 million QRS complexes per day), analysis of telemetry data remains challenging. This article describes a step-by-step approach to analyze ECGs and to detect arrhythmias in long-term telemetry recordings using the software, Ponemah, with its analysis modules, ECG Pro and Data Insights, developed by Data Sciences International (DSI). To analyze basic ECG parameters, such as heart rate, P wave duration, PR interval, QRS interval, or QT duration, an automated attribute analysis was performed using Ponemah to identify P, Q, and T waves within individually adjusted windows around detected R waves. 
Results were then manually reviewed, allowing adjustment of individual annotations. The output from the attribute-based analysis and the pattern recognition analysis was then used by the Data Insights module to detect arrhythmias. This module allows an automatic screening for individually defined arrhythmias within the recording, followed by a manual review of suspected arrhythmia episodes. The article briefly discusses challenges in recording and detecting ECG signals, suggests strategies to improve data quality, and provides representative recordings of arrhythmias detected in mice using the approach described above.

Here we present a step-by-step protocol for a semiautomated approach to analyze murine long-term electrocardiography (ECG) data for basic ECG parameters and common arrhythmias. Data are obtained by implantable telemetry transmitters in living and awake mice and analyzed using Ponemah and its analysis modules.

ניתוח הקלטות אלקטרוקרדיוגרפיה ארוכות טווח לאיתור הפרעות קצב בעכברים

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ...