עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות מענק R01DK080971 וJuvenile Diabetes Research Foundation מענק 37-2009-44. כמו כן, אנו מעריכים את התמיכה שקיבל ממרכז מחקר UCSD הילדים הסוכרת (PDRC).

1. Transfection של HEK293 Layer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום סלולרי HEK293 על ידי הוספת 500 מ&quot;ל של DMEM בקבוקים (עם 4.5 גר &#39;/ מיליליטר גלוקוז ופנול אדום וללא גלוטמין): פתרון 50 מ&quot;ל FBS, 5 מיליליטר 100X פתרון סטרפטומיצין פניצילין /, 5 מ&quot;ל 100x L-גלוטמין ו500 amphotericin μl ב &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת החוצה HEK293 תאים בצלחת 24 גם באמצעות 0.5 מ&quot;ל של HEK293 תקשורת בכל טוב. ודא כי התאים מתחלקים באופן שווה על פני החלק התחתון של הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאי HEK293 להגיע ל -100% confluency, transfect עם 0.8 מיקרוגרם של פלסמיד קידוד החלבון של עניין (שמותקן בוקטור ביטוי יונקים) ו2 μl של Lipofectamine 2000 על פי פרוטוקול Lipofectamine. יש לנו שבחרנו להשתמש עמוד השדרה 3.3 pcDNA המיועדת לביטוי בתאי יונקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, אחרי 6 שעות של דגירה, חילופי בתקשורת transfection מתוארות בפרוטוקול Lipofectamine עם HEK293 תקשורת הרגילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את הביטוי של prote transfectedב, קבוצת משנה של בארות תרבית רקמת transfected יכול לשמש לזיהוי immunofluorescent של החלבון ביטא או לניתוח כתם המערבי של ביטוי חלבונים תוך שימוש בטכניקות סטנדרטיות. </li></ol> 2. קיבוע אופציונלי של HEK293 תאים לבטא חלבון transfected HEK293 תאי transfected יכולים להיות קבועים בעדינות על מנת להקל coculture בתקשורת שעלולה להזיק לחיים HEK293 תאים (למשל צעד 3.9 להלן) או כדי לאפשר הכנה היעילה מראש של צלחות במשך כמה ניסויים בבת אחת (ראה גם דיון). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מחקרי טייס לקבוע את מהלך הזמן של הביטוי של החלבון בתאי HEK293. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר transfecting שכבת התאים HEK293, לשאוב את התקשורת מהתאים בנקודת הזמן שלאחר transfection קשורה עם הרמה הגבוהה ביותר של ביטוי. אם זה מתרחש בתוך 24 שעות הראשונה, שלא תשאף עד 24 שעות לאחר transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף HEK293 תאים בעדינות עם D-PBS לאחר מכן להוסיף 500 paraformaldehyde 4% μl (PFA) ולדגור על RT למשך 30 דקות. (כדי להפוך את פתרון PFA 4%, להתחיל עם פתרון של 16% ב1X PBS ולדלל 01:04 עם 1X PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות PBS סטרילי, לשטוף בעדינות את התאים 3 פעמים ודגירה בPBS O / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים 3 פעמים עם PBS סטרילית, ולאחר מכן להוסיף PBS ולהשאיר על 4 מעלות צלזיוס עד צורך (זמן אחסון מרבי עשוי להשתנות בהתאם לחלבון ביטא. אנו מאחסנים HEK293 תאי transfected להביע isoforms neuroligin עד 2 שבועות ללא שינויים משמעותיים בתופעות שנצפו על הפרשת אינסולין). </li></ol> 3. שיתוף culturing של INS-1 תאים בטא עם HEK293 תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן INS-1 תקשורת על ידי הוספת 500 מ&quot;ל RPMI 1640 (עם גלוקוז ופנול אדום וללא גלוטמין): 50 מ&quot;ל FBS, 5 מ&quot;ל 100X פניצילין / סטרפטומיצין, פתרון 5 מ&quot;ל 100X L-גלוטמין, 5 פירובט נתרן מ&quot;ל, 500 amphotericin μl ב &#39;, 500 בטא mercaptoethanol μl (זה כמעט זהה לMediאום משמש בדרך כלל לתרבות איון העיקרית, פרט לתוספת של בטא mercaptoethanol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בסלולרי, חשפנית (או מסיר תא אחר שאינם האנזימטית), INS-1 קציר תאים בכ 70-80% confluency את החלק התחתון של בקבוק תרבות T75. כל בקבוק יספק בערך מספיק תאים במשך 48 בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שצנח בתאי צנטריפוגות במשך 3 דקות ב -1,200 סל&quot;ד, resuspend בתמהיל של 50/50 INS-1 ומדיה HEK. לבקבוק 70-80% ומחוברות של INS-1 תאים, resuspend בכ 25 מ&quot;ל של טכניקה מעורבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתם משתמשים בHEK293 תאים שתוקנו בparaformaldehyde במקום HEK293 תאי חיים, resuspend תאי INS-1 ב 100% INS-1 תקשורת ולא בטכניקה מעורבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה 10 מ&quot;ל, לסלק את התאים מהגלולה כדי להפוך את השעיה תא הומוגנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב להסיר את המדיה על HEK293 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה P1000, בעדינות להוסיף 500 μl של אח&quot;י-1 השעיה תא על גבי שכבת תאי HEK לאורך הצדדים of כן. אחרי כל 6 בארות, השתמש פיפטה 10 מ&quot;ל לresuspend תאי INS-1 שוב כדי להבטיח השעיה תא הומוגנית. התכנית הכוללת של הגדרת coculture מתוארת באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עבור 24-48 שעות, בהתאם לפרוטוקול הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם נדרש יותר מ 48 שעות coculture תקופה, להשתמש בשלבים אופציונליים בסעיף 2 לעיל כדי לתקן את HEK293 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתם משתמשים במכרסם ניתק ראשוני או איונים אדם [ר &#39;לדוגמא פרוטוקולים קודמים ביופיטר 11-15], להבטיח שתקשורת מתאימה כגון RPMI עם 5 מיליליטר עט / סטרפטוקוקוס, 5 מיליליטר L-שפע, 0.5 מ&quot;ל amphotericin-B משמשת במקום INS-1 תקשורת. למרות שניתן להשתמש בתאי איון ניתק בצלחת גם 24, בפועל, בגלל המספר הגדול של איונים פוטנציאל הדרושים, מומלץ שהתמורה תינתן לשינוי קנה מידה למטה לצלחת גם 48 (שחייב איון תאים פחות לכל טוב). על צלחת 48 היטב, להוסיף כ -100 איים בשווי של dissociaטד תאים לכל צלחת להתחיל. בהתאם ליעילות של ניתוק ושיטה, פחות איים ייתכן שיידרשו. </li></ol> 4. גלוקוז מגורה הפרשת אינסולין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Preincubate תאים ב250 μl של גלוקוז 2.5 מ&quot;מ בKRB (חיץ יקרבונט קרבס-רינגר) למינימום של שעה 1. לpreincubate, להסיר בינונית coculture ולהחליף באופן מיידי עם KRB. מטבע זה צריך להיעשות גם אחד בכל פעם, כדי לצמצם את החשיפה של תאי INS-1 לחמצן סביבתי. לשאוב עם יד אחת בזמן pipetting KRB הנמוך גלוקוז (2.5 מ&quot;מ) עם האחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> KRB preincubation Exchange כדי μl 250 של או 2.5 מ&quot;מ או 20 מ&quot;מ גלוקוז בKRB חיץ אחד טוב בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מתאים לניסוי הספציפי, secretagogues נוסף כגון IBMX מיקרומטר 100 ניתן להוסיף כדי לייצר תגובת הפרשת אינסולין חזקה יותר מגורה. תאים בטא איון עיקריים ניתקים בפרט הם גרועים מגיבים לגדלו אלון ריכוזי גלוקוזדואר, אז הנה במיוחד תוספת של IBMX או אחר secretagogues צריך להיחשב 16,17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שעה 1 של דגירה, להעביר תקשורת לmicrofuge צינורות וספין 1,500 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 200 μl של supernatant ולהשתמש בזה לניתוח על ידי אינסולין RIA או ELISA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין lysate תא, להוסיף 100 μl של חיץ תמוגה תא Ripa (150 מ&quot;מ NaCl, 1.0% IGEPALCA-630 או Nonidet P-40, deoxycholate נתרן 0.5%, 0.1% SDS, 50 מ&quot;מ טריס, pH 8.0) עם מעכבי פרוטאז ל צלחת מייד לאחר הסרת תקשורת ודגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה lysate במשך 15 דקות ב10,000 XG ולהסיר 50 μl של supernatant לניתוח על ידי אינסולין RIA או ELISA. </li></ol>

<ol>
	<li>Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+islet+structure+and+cellular+interactions+in+the+control+of+insulin+secretion.">Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion.</a> Islets. 3, 41-47 (2011).</li><li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets.">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129, 359-370 (2007).</li><li>Jain, R., Lammert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+the+endocrine+pancreas.">Cell-cell interactions in the endocrine pancreas.</a> Diabetes Obes. Metab. 11, 159-167 (2009).</li><li>Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-secreting+cell+lines:+classification,+characteristics+and+potential+applications.">Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications.</a> Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).</li><li>Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+build+a+central+synapse:+clues+from+cell+culture.">How to build a central synapse: clues from cell culture.</a> Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).</li><li>Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin+expressed+in+nonneuronal+cells+triggers+presynaptic+development+in+contacting+axons.">Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons.</a> Cell. 101, 657-669 (2000).</li><li>Abderrahmani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+traits+are+required+for+glucose-induced+insulin+secretion.">Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion.</a> FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).</li><li>Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+secretory+granules+and+neuronal+synaptic+vesicles+have+three+integral+membrane+proteins+in+common.">Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common.</a> The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).</li><li>Suckow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+neurexin,+neuroligin,+and+their+cytoplasmic+binding+partners+in+the+pancreatic+beta-cells+and+the+involvement+of+neuroligin+in+insulin+secretion.">Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion.</a> Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).</li><li>Suckow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+neuroligin-2+interactions+enhance+insulin+secretion+and+are+integral+to+pancreatic+beta+cell+function.">Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).</li><li>Kohnert, K. D., Hehmke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+suspensions+of+pancreatic+islet+cells:+a+comparison+of+methods.">Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+I:+digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue.">Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue.</a> J. Vis. Exp. (27), e1125 (2009).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+II:+purification+and+culture+of+human+islets.">Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets.</a> J. Vis. Exp. (27), e1343 (2009).</li><li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+pancreatic+islet+isolation.">Murine pancreatic islet isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).</li><li>Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+beta-cell-to-beta-cell+interactions+are+required+for+integrated+responses+to+nutrient+stimuli:+enhanced+Ca2++and+insulin+secretory+responses+of+MIN6+pseudoislets.">Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets.</a> Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).</li><li>Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superfusion+of+dissociated+pancreatic+islet+cells+attached+to+Cytodex+beads.">Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads.</a> Diabetes. 31, 189-193 (1982).</li><li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+gene+expression+in+HEK293+cells:+peptone+addition+posttransfection+improves+recombinant+protein+synthesis.">Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).</li><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line:+a+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins.">HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).</li><li>Maurisse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transfection+of+DNA+into+primary+and+transformed+mammalian+cells+from+different+lineages.">Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages.</a> BMC Biotechnol. 10, 9 (2010).</li></ol>

יש לנו מה למסור.

שיטת coculture המתוארת כאן מספקת דרך יעילה כדי לקבוע את החשיבות הפיזיולוגית של חלבונים בטא על פני קרום תא, הטרנסממברני ספציפיים, ובמיוחד של תחומים תאיים שלהם. על ידי תאי הבטא culturing או תאי insulinoma (כגון תאי INS-1 המועסקים כאן) במגע עם תאי HEK293 מוצגות חלבון של עניין על פני התא, יכול...

אנו מתארים כאן שיטה כדי להקל על חקירות של כמה תחומים תאיים של חלבוני הטרנסממברני ספציפיים ישפיעו הפרשת אינסולין. בדיקות השיטה את ההשפעות של אינטראקציות של החלבון של עניין עם חלבונים (או אולי מולקולות אחרות) על פני התא בטא בלבלב. השיטה מאפשרת לחקירות של איך על פני קרום תא חלבונים המתבטאים על ידי תאי הבטא או על ידי תאי שכנים אחרים (למשל תאי אנדותל, נוירונים, תאי אלפא בלבלב) להשפיע על תפקוד תא בטא דרך אינטראקציות transcellular (כלומר דרך אינטראקציות עם שותפי אינטראקציה על פני צמוד תאי ביתא). קרום הפלזמה הסלולרי מכיל מערך מורכב של חלבונים מבניים ופונקציונליים המשמשים כגשרים לסביבה תאית. על ידי יצירה של קשרי transcellular או על ידי ייזום של אירועי איתות פלסטיק, אינטראקציות בין חלבונים על פני קרום התא יכולות לעזור לתאםתפקוד של תאים שכנים. תאים בטא בלבלב מקובצים יחד באיי הלבלב ולפעול באופן מתואם כדי לשמור על הומאוסטזיס 1 גלוקוז. כפי שנחשף, למשל, על ידי את החשיבות של תאי neuroligin-2 אינטראקציות ברגולציה של גלוקוז-מגורה הפרשת אינסולין EphA-ephrinA ו, זה הופך להיות יותר ויותר ברור שידע מוגבר של אינטראקציות בין חלבונים תאיים המתרחשות על פני השטח של צמוד תאי הבטא יהיו חשיבות רבה להשגת הבנה מלאה של הפרשת אינסולין, התבגרות של תאי הבטא תפקודי ותחזוקה של הומאוסטזיס הגלוקוז 1-3. המטרה של השיטה המתוארת כאן היא לאפשר חקירות של ההשפעות על תפקוד תאי הבטא של אינטראקציות transcellular מעורבות הטרנסממברני מסוים או חלבונים אחרים, על פני קרום תא, קשורים. על ידי תאי הבטא במשותף עם culturing HEK293 תאי transfected עם בונה ביטוי שונה, את ההשפעות על bתפקוד תא של ETA שונים על פני קרום תא חלבונים שעברו מוטציה או גרסותיהם יכול להיות יעיל נחקר. המטרה זו מושגת מבלי transfect התאים בטא את עצמם. הבהרת התפקידים של אינטראקציות transcellular מסוימות על ידי מחקרי מציאה, נוקאאוט או ביטוי יתר בתאים בטא בתרבית או in vivo מחייבת הפרעות הישירות של ה-mRNA תא בטא וביטוי חלבון, שעלול להשפיע על בריאות תא בטא ו / או פונקציה בדרכים שעלולות לבלבל ניתוחים של את ההשפעות של אינטראקציות תאי ספציפיות. גישות אלה גם לשנות רמות של תחומים תאיים של החלבונים והממוקדים, בהמשך, אינה מאפשר אפקטים בשל אינטראקציות בין חלבונים באו באותו התא כדי להבחין בין ההשפעות של אינטראקציות transcellular. כאן, שיטה לקביעת ההשפעה של אינטראקציות transcellular ספציפיות על יכולת הפרשת האינסולין ויכולת התגובה של תאי הביתא היא described. שיטה זו ישימה לקווי אינסולין תא בטא, כמו INS-1 תאים 4, ומכרסם עיקרי ניתק או תאי ביתא אנושיים. היא מבוססת על מודלים שפותחו על ידי coculture neurobiologists, שמצאו כי חשיפה של נוירונים בתרבית לחלבונים עצביים ספציפיים לידי ביטוי בHEK293 (או COS) שכבות תאים יכולים לזהות חלבונים שכונן היווצרות הסינפסה 5,6. בהתחשב בקבלות בין מכונות ההפרשה של סינפסות עצביות ושל תאים בטא, אנחנו סברנו כי תפקוד תא בטא והתבגרות פונקציונלית עשויים להיות מונעים על ידי אינטראקציות 7-9 דומות transcellular. כדי לחקור אינטראקציות אלה, פיתחנו את המערכת המתוארת במסמך שבו תאים בטאו cocultured על שכבה של תאי HEK293 להביע חלבון של עניין 10. מערכת זו מאפשרת הציטופלסמה התא בטא להישאר ללא שינוי ואילו אינטראקציות בין חלבונים תאיים הן מניפולציה.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA 3.3 vector/backbone</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K830001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18324012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-312</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep solution</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-652-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-808-1/30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-404</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-434</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-710-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell stripper</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45000-668</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>BD</td>
			<td>1368065</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50980487</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-130</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879-100MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R0278</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coculture analysis of extracellular protein interactions affecting insulin secretion by pancreatic beta cells

אינטראקציות בין חלבונים על פני קרום התא לעזור לתאם את התפקוד של תאים שכנים. תאים בטא בלבלב מקובצים יחד באיי לבלב ולפעול באופן מתואם כדי לשמור על הומאוסטזיס גלוקוז. זה הופך להיות יותר ויותר ברור שאינטראקציות בין חלבוני הטרנסממברני על פני השטח של תאי הבטא סמוכים הן גורמים חשובים של תפקוד תא בטא. הבהרת התפקידים של אינטראקציות transcellular מסוימות על ידי מחקרי מציאה, נוקאאוט או ביטוי יתר בתאים בטא בתרבית או in vivo מחייבת הפרעות הישירות של mRNA וביטוי חלבונים, שעלול להשפיע על בריאות ו / או בתפקוד תא בטא בדרכים שעלולות לבלבל ניתוחים של ההשפעות של אינטראקציות ספציפיות. גישות אלה גם לשנות רמות של תחומים תאיים של החלבונים הממוקדים ועשויות למנוע תופעות בשל אינטראקציות בין חלבונים בתוך אותו קרום התא להיות דיסtinguished מההשפעות של אינטראקציות transcellular. הנה שיטה לקביעת ההשפעה של אינטראקציות transcellular ספציפיות ביכולת הפרשת האינסולין ויכולת התגובה של תאי הבטא מוצגת. שיטה זו ישימה לקווי תא בטא, כמו INS-1 תאים, ותאי בטא ראשוניים ניתק. היא מבוססת על מודלים שפותחו על ידי coculture neurobiologists, שמצאו כי חשיפה של נוירונים בתרבית לחלבונים עצביים ספציפיים לידי ביטוי בHEK293 (או COS) שכבות תאי חלבונים שזוהו חשובים לנהיגת היווצרות הסינפסה. בהתחשב בקבלות בין מכונות ההפרשה של סינפסות עצביות ושל תאים בטא, אנחנו מנומקים שהבשלה פונקציונלית תא בטא עשויה להיות מונעת על ידי אינטראקציות transcellular דומות. פיתחנו מערכת שבו תאים בטא בתרבית על שכבה של תאי HEK293 להביע חלבון של עניין. במודל זה, הציטופלסמה התא בטא ללא מגע תוך interactio חלבונים תאייםNS הוא מניפולציה. למרות שאנו מתמקדים כאן בעיקר על מחקרים של גלוקוז-מגורה הפרשת אינסולין, ניתן לנתח תהליכים אחרים, לדוגמה, שינויים בביטוי גנים, כפי שנקבעו על ידי immunoblotting או qPCR.

שימוש בשיטה המתוארת כאן, יש לנו בדקנו את ההשפעה של גרסאות של neuroligin החלבון על הפרשת אינסולין שונות. זה משלים את העבודה שלנו פרסמה חוקרת את ההשפעה של neuroligin-2 על תפקוד תא בטא 10. איור 2, למשל, מתאר את התוצאות שהתקבלו מINS-1 coculturing תאים בטא עם HEK293 תאי transfected להביע א...

Watch this Scientific Journal Video about Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells at JoVE.com

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

אינטראקציות חלבון Transcellular הם גורמים חשובים של תפקוד תא בטא בלבלב. מפורט כאן היא שיטה מותאמת ממודל של coculture synaptogenesis-לחוקר כיצד חלבוני הטרנסממברני ספציפיים להשפיע הפרשת אינסולין. HEK293 תאי transfected לבטא חלבונים של עניין; תאים בטא לא צריכים להיות transfected או אחר ישירות מוטרד.

ניתוח Coculture של אינטראקציות חלבון תאיות המשפיעות על הפרשת אינסולין על ידי תאים בטא בלבלב

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

coculture-analysis-extracellular-protein-interactions-affecting

Research

JoVE Journal

Medicine

12.8K Views.  University of California, San Diego. אינטראקציות חלבון Transcellular הם גורמים חשובים של תפקוד תא בטא בלבלב. מפורט כאן היא שיטה מותאמת ממודל של coculture synaptogenesis-לחוקר כיצד חלבוני הטרנסממברני ספציפיים להשפיע הפרשת אינסולין. HEK293 תאי transfected לבטא חלבונים של עניין; תאים בטא לא צריכים להיות transfected או אחר ישירות מו?...

Video: Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Improving IV Insulin Administration in a Community Hospital

Diabetes mellitus is a major independent risk factor for increased morbidity and mortality in the hospitalized patient, and elevated blood glucose concentrations, even in non-diabetic patients, predicts poor outcomes.1-4 The 2008 consensus statement by the American Association of Clinical Endocrinologists (AACE) and the American Diabetes Association (ADA) states that "hyperglycemia in hospitalized patients, irrespective of its cause, is unequivocally associated with adverse outcomes."5 It is important to recognize that hyperglycemia occurs in patients with known or undiagnosed diabetes as well as during acute illness in those with previously normal glucose tolerance.
The Normoglycemia in Intensive Care Evaluation-Survival Using Glucose Algorithm Regulation (NICE-SUGAR) study involved over six thousand adult intensive care unit (ICU) patients who were randomized to intensive glucose control or conventional glucose control.6 Surprisingly, this trial found that intensive glucose control increased the risk of mortality by 14% (odds ratio, 1.14; p=0.02). In addition, there was an increased prevalence of severe hypoglycemia in the intensive control group compared with the conventional control group (6.8% vs. 0.5%, respectively; p&lt;0.001). From this pivotal trial and two others,7,8 Wyoming Medical Center (WMC) realized the importance of controlling hyperglycemia in the hospitalized patient while avoiding the negative impact of resultant hypoglycemia. 
Despite multiple revisions of an IV insulin paper protocol, analysis of data from usage of the paper protocol at WMC shows that in terms of achieving normoglycemia while minimizing hypoglycemia, results were suboptimal. Therefore, through a systematical implementation plan, monitoring of patient blood glucose levels was switched from using a paper IV insulin protocol to a computerized glucose management system. By comparing blood glucose levels using the paper protocol to that of the computerized system, it was determined, that overall, the computerized glucose management system resulted in more rapid and tighter glucose control than the traditional paper protocol. Specifically, a substantial increase in the time spent within the target blood glucose concentration range, as well as a decrease in the prevalence of severe hypoglycemia (BG &lt; 40 mg/dL), clinical hypoglycemia (BG &lt; 70 mg/dL), and hyperglycemia (BG &gt; 180 mg/dL), was witnessed in the first five months after implementation of the computerized glucose management system. The computerized system achieved target concentrations in greater than 75% of all readings while minimizing the risk of hypoglycemia. The prevalence of hypoglycemia (BG &lt; 70 mg/dL) with the use of the computer glucose management system was well under 1%.

When compared to the previous paper protocol, implementation of a computerized glucose management system results in a substantial increase in blood glucose concentration measurements within the target range. Using a computerized glucose management system to monitor blood glucose levels, decreases in severe hypoglycemia (&lt;40 mg/dL), clinical hypoglycemia (&lt;70 mg/dL), and hyperglycemia (&gt;180 mg/dL) also can be observed.

שיפור ניהול IV אינסולין בבית חולים קהילתי

Diabetes mellitus is a major independent risk factor for increased morbidity and mortality in the hospitalized patient, and elevated blood glucose ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in particular the role of the resident (stromal) cells. Studies in primary carcinomas demonstrate the influence of the microenvironment on metastasis, even on prognosis1,2. Especially the tumor associated macrophages (TAM) support migration, invasion and proliferation3. Interestingly, the major target sites of metastasis possess tissue-specific macrophages, such as Kupffer cells in the liver or microglia in the CNS. Moreover, the metastatic sites also possess other tissue-specific cells, like astrocytes. Recently, astrocytes were demonstrated to foster proliferation and persistence of cancer cells4,5. Therefore, functions of these tissue-specific cell types seem to be very important in the process of brain metastasis6,7.
Despite these observations, however, up to now there is no suitable in vivo/in vitro model available to directly visualize glial reactions during cerebral metastasis formation, in particular by bright field microscopy. Recent in vivo live imaging of carcinoma cells demonstrated their cerebral colonization behavior8. However, this method is very laborious, costly and technically complex. In addition, these kinds of animal experiments are restricted to small series and come with a substantial stress for the animals (by implantation of the glass plate, injection of tumor cells, repetitive anaesthesia and long-term fixation). Furthermore, in vivo imaging is thus far limited to the visualization of the carcinoma cells, whereas interactions with resident cells have not yet been illustrated. Finally, investigations of human carcinoma cells within immunocompetent animals are impossible8.
For these reasons, we established a coculture system consisting of an organotypic mouse brain slice and epithelial cells embedded in matrigel (3D cell sphere). The 3D carcinoma cell spheres were placed directly next to the brain slice edge in order to investigate the invasion of the neighboring brain tissue. This enables us to visualize morphological changes and interactions between the glial cells and carcinoma cells by fluorescence and even by bright field microscopy. After the coculture experiment, the brain tissue or the 3D cell spheroids can be collected and used for further molecular analyses (e.g. qRT-PCR, IHC, or immunoblot) as well as for investigations by confocal microscopy. This method can be applied to monitor the events within a living brain tissue for days without deleterious effects to the brain slices. The model also allows selective suppression and replacement of resident cells by cells from a donor tissue to determine the distinct impact of a given genotype. Finally, the coculture model is a practicable alternative to in vivo approaches when testing targeted pharmacological manipulations.

The organotypic brain slice coculture with carcinoma cells enables visualizing morphological changes by fluorescence as well as bright field (video) microscopy during the process of carcinoma cell invasion of brain tissue. This model system also allows for cell exchange and replenishment approaches and offers a wide variety of manipulations and analyses.

מערכת Coculture עם מוח פרוס Organotypic ו3D אליפטית של קרצינומה של תאים

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

אדם Dupuytren של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבות לחקר myofibroblasts והתאי מטריקס האינטראקציות

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Neurodegeneration in an Animal Model of Chronic Amyloid-beta Oligomer Infusion Is Counteracted by Antibody Treatment Infused with Osmotic Pumps

Decline in hippocampal-dependent explicit memory (memory for facts and events) is one of the earliest clinical symptom of Alzheimer&#39;s disease (AD). It is well established that synapse loss and ensuing neurodegeneration are the best predictors for memory impairments in AD. Latest studies have emphasized the neurotoxic role of soluble amyloid-beta oligomers (A&#946;o) that begin to accumulate in the human brain approximately 10 to 15 yr before the clinical symptoms become apparent. Many reports indicate that soluble A&#946;o correlate with memory deficits in AD models and humans. The A&#946;o-induced neurodegeneration observed in neuronal and brain slice cultures has been more challenging to reproduce in many animal models. The model of repeated A&#946;o infusions shown here overcome this issue and allow addressing two key domains for developing new disease modifying therapies: identify biological markers to diagnose early AD, and determine the molecular mechanisms underpinning A&#946;o-induced memory deficits at the onset of AD. Since soluble A&#946;o aggregate relatively fast into insoluble A&#946; fibrils that correlate poorly with the clinical state of patients, soluble A&#946;o are prepared freshly and injected once per day during six days to produce marked cell death in the hippocampus. We used cannula specially design for simultaneous infusions of A&#946;o and continuous infusion of A&#946;o antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps. This innovative in vivo method can now be used in preclinical studies to validate the efficiency of new AD therapies that might prevent the deposition and neurotoxicity of A&#946;o in pre-dementia patients.

To study the effects of A&#946;o in vivo, we developed a model based on repeated hippocampal infusions of soluble A&#946;o coupled with continuous infusion of A&#946;o antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps to counteract the neurotoxic effect of A&#946;o.

מוחיים במודל חיה של עמילואיד-ביתא כרונית oligomer העירוי נוטרלה על ידי נוגדן טיפול חדורי משאבות אוסמוטי

Decline in hippocampal-dependent explicit memory (memory for facts and events) is one of the earliest clinical symptom of Alzheimer&#39;s disease (AD). It ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of pancreatic body. With technological development, the robotic surgical system has shown its advantage in minimally invasive surgery and been increasingly applied in central pancreatectomy. However, reconstruction of the continuity of pancreas with end-to-end anastomosis after robotic central pancreatectomy has not been applied. In this study, we report surgical techniques for robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis. The pancreas is reconstructed by duct-to-duct anastomosis of the pancreatic duct with a pancreatic stent inserted in the two stumps of pancreatic duct, and by end-to-end anastomosis of the pancreatic parenchyma. Compared with traditional central pancreatectomy with pancreaticoenteric anastomosis, this approach decreases the operative injury to the patient, and also conserves the integrity and continuity of the digestive duct and pancreatic duct. The robotic surgical system integrated with multiple instruments with flexible and precise movement is particularly suitable for the dissection and reconstruction of the pancreatic duct. We found that robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis is safe and feasible, and we need more experience to evaluate its best indications and long-term outcomes.

The robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis is feasible and safe for tumor in the pancreatic neck and proximal portion of pancreatic body. The operative techniques of this operation are presented.

יישום של End-to-end השקה ב Pancreatectomy המרכזית רובוטית

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous insulin assays have existed for decades, the recent advent of homogeneous time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer (HTRF) technology has significantly simplified these measurements. This is a rapid, cost-effective, reproducible, and robust optical assay reliant upon antibodies conjugated to bright fluorophores with long lasting emission which facilitates time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer. Moreover, HTRF insulin detection is amenable for the development of high-throughput screening assays. Here we use HTRF to detect insulin secretion in INS-1E cells, a rat insulinoma-derived cell line. This allows us to estimate basal levels of insulin and their changes in response to glucose stimulation. In addition, we use this insulin detection system to confirm the role of dopamine as a negative regulator of glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). In a similar manner, other dopamine D2-like receptor agonists, quinpirole, and bromocriptine, reduce GSIS in a concentration-dependent manner. Our results highlight the utility of the HTRF insulin assay format in determining the role of numerous drugs in GSIS and their pharmacological profiles.

Homogeneous Time-resolved F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Here, we present homogeneous time resolved FRET (HTRF) as an efficient method for rapid detection of insulin secreted from cells.

פורסטר זמן לפתור הומוגנית תהודה אנרגיה מבוססת על העברת Assay גילוי של הפרשת האינסולין

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for systemic energy homeostasis. Primary hepatocytes isolated from the murine liver constitute a valuable biological tool to understand the functional properties or alterations occurring in the liver. Herein we describe a method for the isolation and culture of primary mouse hepatocytes by performing a two-step collagenase perfusion technique and discuss their utilization for investigating protein metabolism. The liver of an adult mouse is sequentially perfused with ethylene glycol-bis tetraacetic acid (EGTA) and collagenase, followed by the isolation of hepatocytes with the density gradient buffer. These isolated hepatocytes are viable on culture plates and maintain the majority of endowed characteristics of hepatocytes. These hepatocytes can be used for assessments of protein metabolism including nascent protein synthesis with non-radioactive reagents. We show that the isolated hepatocytes are readily controlled and comprise a higher quality and volume stability of protein synthesis linked to energy metabolism by utilizing the chemo-selective ligation reaction with a Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein detection method and western blotting analyses. Therefore, this method is valuable for investigating hepatic nascent protein synthesis linked to energy homeostasis. The following protocol outlines the materials and methods for the isolation of high-quality primary mouse hepatocytes and detection of nascent protein synthesis.

Here, we present a protocol for the isolation of healthy and functional primary mouse hepatocytes. Instructions for detecting hepatic nascent protein synthesis by non-radioactive labeling substrate were provided to help understand the mechanisms underlying protein synthesis in the context of energy-metabolism homeostasis in the liver.

בידוד של העכבר הראשי Hepatocytes לניתוח סינתזת חלבון Nascent בשיטה תיוג L שאינו רדיואקטיבי-azidohomoalanine

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular respiration, oxidative metabolism, signal transduction, and apoptosis. Consequently, mitochondrial dysfunction is reported to play an important role in the antifungal drug tolerance and virulence of pathogenic fungi. Recent data have also led to the recognition of the importance of the mitochondria as an important contributor to fungal pathogenesis. Despite the importance of the mitochondria in fungal biology, standardized methods to understand its function are poorly developed. Here, we present a procedure to study the basal oxygen consumption rate (OCR), a measure of mitochondrial respiration, and extracellular acidification rates (ECAR), a measure of glycolytic function in C. albicans strains. The method described herein can be applied to any Candidaspp. strains without the need to purify mitochondria from the intact fungal cells. Furthermore, this protocol can also be customized to screen for inhibitors of mitochondrial function in C. albicans strains.

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Here, we present a stepwise protocol to investigate the mitochondrial respiration and glycolytic function in Candida Albicans using an extra flux analyzer.

ביו-energetics החקירה של קנדידה אלביקנס משתמש בזמן אמת חוץ-תאית השטף ניתוח

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...