אנו מודים לד&quot;ר כריסטוף Masselon (iRTV, CEA, גרנובל) וחברים של זיהום ויראלי וקבוצה למלחמה בסרטן בתסמונת המעי הרגיז, להערכה הביקורתית שלהם של כתב היד ולדיונים מועילים. אנו מודים לסיריל דיאן על מתנת סוג של החלבון Crm1. עבודה מדעית זה התרחשה במתקן ספקטרומטריית המסה של גרנובל מרכז להורות (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UJF-EMBL). הוא נתמך כלכלית על ידי התשתיות צרפתיות ליוזמת ביולוגיה המבנית משולב (FRISBI, ANR-10-InSb-05-02), Gral (ANR-10-LABX-49-01) [בשותפות גרנובל לביולוגיה מבנית] ועל ידי המרכז הצרפתי הלאומי למחקר מדעי (CNRS).

1. לדוגמא הכנת חלבון: הצפת ערך (אופציונאלי) 5-25 μl של ריכוזי מייקרו של חלבון (1-20 מיקרומטר) הם הכרחיים. חילופי חיץ יכולים להתבצע באמצעות מכשירי אולטרה הצנטריפוגלי (למשל Vivaspin, סארטוריוס) או עמודות סינון ג&#39;ל microcentrifuge (למשל, 6 עמודות כרומטוגרפיה Bio-ספין מיקרו, Bio-Rad) 29,30. ניתן לחזור על צעדי חילופי חיץ 2-3x. תיאור מפורט של חילופי חיץ הוצג בעבר 29,30. לדוגמא, אנו מנצלים 20 טריס מ&quot;מ pH aminomethane (hydroxymethyl) (כלומר טריס) 8 כחיץ סופי. הערה: שלב זה יכול להיות מושמט במקרים רבים. צריכה להתבצע זה החוצה כאשר מדגם חלבון מכיל מולקולות או מאגרים שיכולים מאוד להפריע לגילוי טרשת נפוצה [לדוגמא: גליצרול; 4 - (2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה, HEPES]. זה גם שימושי כדי לשפר את quality של הספקטרום. 2. גיבוש מחדש של מטריצות על מנת לשפר את הטוהר שלהם (אופציונאלי) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 10 מיליליטר של 40% אתנול (EtOH) לתוך בקבוק פיירקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 600 מ&quot;ג של מטריקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש באמבט מים ותנור התנגדות, לחמם את פתרון המטריצה ​​ומערבבים אותו עד שהוא נמס לגמרי המטריצה ​​באמצעות מוט זכוכית או בוחש מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2 עד שיש לך פתרון רווי. </li></ol> הערה: שימוש בכמויות גדולות מדי של ממס או המסת המטריצה ​​הרבה מתחת לנקודת רתיחת הפתרון תגרום תשואה ירודה של גבישים או לא גבישים בכלל. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הפתרון להתקרר באיטיות. אתה יכול להשאיר אותו בטמפרטורת חדר במשך כמה שעות ולאחר מכן ב 4 ° C למשך לילה. הערה: אם לא נוצרים גבישים, התגבשות יכולה להיגרם על ידי מגרד את החלק הפנימי של הכוס (ממש מתחת לפני השטח הפתרון) באמצעות מוט בחישת זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את גבישי מטריצה ​​על ידי סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הגבישים עם כמות מינימאלית של ממס קר כקרח ותסנין אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר את הגבישים לייבוש. אתה יכול להשתמש בואקום לצעד זה. </li></ol> 3. ניקוי של MALDI נירוסטה יעד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את צלחת MALDI עם מתנול (MeOH) ולנגב בעדינות עם רקמת ניקוי שנעשתה במיוחד עבור יישומים במעבדה (למשל Kimwipe). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את היעד עם H 2 O ולנגב אותו עם רקמת ניקוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את צלחת MALDI בכוס 600 מ&quot;ל ולכסות אותו עם 50% EtOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate היעד בפתרון EtOH עבור 10 דקות באמבטיה קולי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש שאריות שנותרו על הצלחת, חזור על השלבים 1-4 שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, יש לשטוף את היעד עם MeOH (או במים, ראה הערה בהמשך), להטות אותו באופן שכל הנוזלים שנאספו ברקמות ניקוי. בואו יבש היעד בטמפרטורת חדר או באמצעות חנקןזרימת גז. </li></ol> הערה: הליך דומה תואר 15 בעבר. הערה: הממס (MeOH או מים) המשמש לשטיפה האחרונה של היעד קובע כמה תכונות יעד. אם המטרה היא שטף עם MeOH, המדגם מתפשט על המטרה הרבה יותר מאשר בעת שימוש במים. 4. פתרון שכבת α-CHCA דק: הכנה והפקדה על יעד MALDI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים α-CHCA באצטון על מנת להפוך את הפתרון רווי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביד (ללא כל פיפטה) טובל את קצה μl 10 (למשל GELoader עצה, Eppendorf) בתמיסה רוויה α-CHCA: כמות קטנה של הפתרון תזרום בקצה (בשל נימיות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגעת בקצב מהיר מאוד (1 שניות כלומר) יעד MALDI עם קצה פיפטה ולהפקיד את פתרון אצטון α-CHCA על יעד MALDI. זה יהווה השכבה דקה מטריקס, שבו החלבוןמדגם יופקד. נסה ליצור נקודה קטנה ככל האפשר שכבה דקה. </li></ol> הערה: בעת שימוש בSA כמטריצה, אנחנו מכינים את שכבה דקה באמצעות תמיסה רוויה של SA באצטון. 5. הכנה של פתרונות natrix: SA, α-CHCA, DHB ותערובת CHCA_DHB 25 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 20 מ&quot;ג / מיליליטר SA בACN, 0.1% TFA (70:30, כרך / כרך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 20 פתרון מ&quot;ג / מיליליטר α-CHCA בACN ו5% חומצה פורמית (70:30, כרך / כרך) [בשם כמו &quot;פתרון α-CHCA&quot;]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 20 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון DHB בACN ו0.1% חומצת trifluoroacetic (TFA) (70:30, כרך / כרך) [בשם כמו &quot;פתרון DHB&quot;]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את &quot;פתרון α-CHCA&quot; ו &quot;פתרון DHB&quot; ב1:1 (כרך / כרך), כדי לקבל את &quot;פתרון CHCA_DHB&quot;. </li></ol> הערה: אפשר לערבב &quot;פתרון α-CHCA&quot; ו &quot;פתרון DHB&quot; ביחסים שונים, בעת ניתוח חלבונים עם המסה פחות מ 100 kDa. לexample יחס של 40:60 בין α-CHCA וDHB (כרך / כרך) מניב ברזולוציה טובה יותר, אבל פחות רגישה (ראה דיון). 6. הפקדת לדוגמא על יעד MALDI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> μl 0.5 ההפקדה של מדגם החלבון על השכבה דקה α-CHCA שהוכנה קודם לכן. מייד לאחר מכן, להוסיף 0.5 μl של פתרון המטריצה ​​(כלומר פתרון SA או פתרון α-CHCA או &quot;תערובת CHCA_DHB&quot;). משמעות הדבר הוא ערבוב המדגם ומטריקס על המטרה. </li></ol> הערה: בדרך כלל אחד מערבב את דגימת החלבון עם מטריצת ביחס של 1:1. יחס זה הוא קריטי לאיכות טובה של ספקטרום MALDI. אם אתה רוצה לבדוק את ריכוזי מדגם שונים, אתה יכול להשתמש בפתרון ACN_formic החומצה (כמתואר לעיל) כדי לדלל את המדגם. הערה: אם אתם מעדיפים, אתם יכולים לערבב את המדגם ומטריקס בצינור ולאחר מכן להפקיד מעורב &quot;sample_matrix solution &quot;בשכבה דקה. שים לב: אנו ממליצים לך לבדוק ריכוזי מדגם שונים בגלל דילול המדגם מאפשר לך להפחית את ההתערבות של חומרים מזהמים. כדי לדלל את המדגם, אתה יכול להשתמש בפתרון ACN_formic החומצה (כמתואר לעיל) כדי לדלל את המדגם. 7. Calibrant הפקדת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקדה 0.5 μl של תקן calibrant (למשל &quot;סטנדרטי חלבון השני&quot;, ברוקר Daltonics, ברמן) ולאחר מכן להוסיף 0.5 μl של פתרון המטריצה. </li></ol> הערה: טעינת calibrant על ​​צלחת MALDI ליד כתמי חלבון המדגם (ראה דיון). 8. MALDI ספקטרה רכישת Calibrant ודגימות חלבון לאחר הדגימות וcalibrant הם מיובשים, אתה יכול לראות את &quot;כתמים&quot; תחת מיקרוסקופ. תצפית זו היא אופציונלית ועשויה להיות מעניינת בעיקר למשתמשים חדשים. כדי לרכוש את ספקטרום המדגם, הכנס היעד דואר במכשיר MALDI-TOF ולבחור את הפרמטרים המתאימים אינסטרומנטלי שהם שונים עבור כל סוג של ציוד. כדי לקבל את ההגדרה המתאימה ביותר אחד צריך לעקוב אחר המלצות יצרן. כשיקולים כלליים בעת ניתוח חלבונים שלמים, יש להשתמש במכשיר במצב ליניארי (לא במצב רפלקטור, שהוא מתאים לפפטידים מנתח). בדרך כלל אנו מנצלים המכשיר שלנו במצב חיובי יון. יתר על כן, פרמטר מרכזי הוא &quot;חילוץ יון פעם&quot; אשר משפר את הרזולוציה אינסטרומנטלי ביום 31. במילים פשוטות, &quot;חילוץ יון פעם&quot; יכול להיות מוגדר כהפסקה בין הדור של יוני המדגם והזמן שבו היונים מואצים לכיוון הגלאי. בעת ניתוח חלבונים שלמים, יש מנוצל &quot;מיצוי פעמו יון&quot; (למשל 500 NSEC) גדול יותר מאשר בעת התבוננות פפטידים (למשל 80 NSEC). בחר הטווח מ &#39;/ z המתאים, לרכוש את o הספקטרוםו calibrant, ולכייל את המכשיר. כאשר אתה רוכש את הספקטרום של הדגימות שלך, השתמש בעוצמת הלייזר המתאימה (ראה דיון).

<ol>
	<li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography : Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Cohen, S. L., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+as+a+tool+for+protein+crystallography.">Mass spectrometry as a tool for protein crystallography.</a> Annual review of biophysics and biomolecular structure. 30, 67-85 (2001).</li><li>Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry--a+useful+tool+for+the+protein+X-ray+crystallographer+and+NMR+spectroscopist.">Mass spectrometry--a useful tool for the protein X-ray crystallographer and NMR spectroscopist.</a> Structure. 2, 465-467 (1994).</li><li>Gans, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereospecific+isotopic+labeling+of+methyl+groups+for+NMR+spectroscopic+studies+of+high-molecular-weight+proteins.">Stereospecific isotopic labeling of methyl groups for NMR spectroscopic studies of high-molecular-weight proteins.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49, 1958-1962 (2010).</li><li>Wilm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+electrospray+ionization.">Principles of electrospray ionization.</a> Molecular &amp; cellular proteomics : MCP. 10, M111 009407 (2011).</li><li>Urban, P. L., Amantonico, A., Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-a-plate:+extending+the+functionality+of+MALDI-MS+and+LDI-MS+targets.">Lab-on-a-plate: extending the functionality of MALDI-MS and LDI-MS targets.</a> Mass spectrometry reviews. 30, 435-478 (2011).</li><li>De Hoffmann, E., Stroobant, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mass Spectrometry: Principles and Applications. , (2007).</li><li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+desorption+ionization+of+proteins+with+molecular+masses+exceeding+10,000+daltons.">Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.</a> Analytical chemistry. 60, 2299-2301 (1988).</li><li>Spengler, B., Cotter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry+of+proteins+above+100,000+daltons+by+pulsed+ion+extraction+time-of-flight+analysis.">Ultraviolet laser desorption/ionization mass spectrometry of proteins above 100,000 daltons by pulsed ion extraction time-of-flight analysis.</a> Analytical chemistry. 62, 793-796 (1990).</li><li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-accuracy+molecular+mass+determination+of+proteins+using+matrix-assisted+laser+desorption+mass+spectrometry.">High-accuracy molecular mass determination of proteins using matrix-assisted laser desorption mass spectrometry.</a> Analytical chemistry. 62, 1836-1840 (1990).</li><li>Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry+of+biopolymers.">Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers.</a> Analytical chemistry. 63, 1193A-1203A (1991).</li><li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+mass-spectrometry+of+proteins.">Matrix-assisted laser desorption ionization mass-spectrometry of proteins.</a> Methods in enzymology. 270, 519-551 (1996).</li><li>Xiang, F., Beavis, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+increase+contaminant+tolerance+in+protein+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+by+the+fabrication+of+thin+protein-doped+polycrystalline+films.">A method to increase contaminant tolerance in protein matrix-assisted laser desorption/ionization by the fabrication of thin protein-doped polycrystalline films.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).</li><li>Cadene, M., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust,+detergent-friendly+method+for+mass+spectrometric+analysis+of+integral+membrane+proteins.">A robust, detergent-friendly method for mass spectrometric analysis of integral membrane proteins.</a> Analytical chemistry. 72, 5655-5658 (2000).</li><li>Fenyo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+sample+preparation:+the+ultra+thin+layer+method.">MALDI sample preparation: the ultra thin layer method.</a> J. Vis. Exp.. (3), e192 (2007).</li><li>Gabant, G., Cadene, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+full-length+integral+membrane+proteins+to+define+functionally+relevant+structural+features.">Mass spectrometry of full-length integral membrane proteins to define functionally relevant structural features.</a> Methods. 46, 54-61 (2008).</li><li>Hook, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+range+allosteric+control+of+cytoplasmic+dynein+ATPase+activity+by+the+stalk+and+C-terminal+domains.">Long range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 33045-33054 (2005).</li><li>Vorm, O., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+sequence+information+derived+by+partial+acid+hydrolysis+and+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry.">Peptide sequence information derived by partial acid hydrolysis and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.</a> Biological mass spectrometry. 23, 734-740 (1994).</li><li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cinnamic+acid+derivatives+as+matrices+for+ultraviolet+laser+desorption+mass+spectrometry+of+proteins.">Cinnamic acid derivatives as matrices for ultraviolet laser desorption mass spectrometry of proteins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 3, 432-435 (1989).</li><li>Madler, S., Boeri Erba, ., E, R., Zenobi, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-ToF+Mass+Spectrometry+for+Studying+Noncovalent+Complexes+of+Biomolecules.">MALDI-ToF Mass Spectrometry for Studying Noncovalent Complexes of Biomolecules.</a> Topics in current chemistry. , (2012).</li><li>Wortmann, A., Pimenova, T., Alves, S., Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+first+shot+phenomenon+in+MALDI+mass+spectrometry+of+protein+complexes.">Investigation of the first shot phenomenon in MALDI mass spectrometry of protein complexes.</a> The Analyst. 132, 199-207 (2007).</li><li>Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic+Acid+as+a+Matrix+for+Matrix-assisted+Laser+Desorption+Mass+Spectrometry.">Alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-assisted Laser Desorption Mass Spectrometry.</a> Organic Mass Spectrometry. 27, 156-158 (1992).</li><li>Liu, Z., Schey, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+MALDI+TOF-TOF+mass+spectrometer+for+intact+protein+analysis.">Optimization of a MALDI TOF-TOF mass spectrometer for intact protein analysis.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16, 482-490 (2005).</li><li>Gorka, J., Bahr, U., Karas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphite+supported+preparation+(GSP)+of+alpha-cyano-4-hydroxycinnamic+acid+(CHCA)+for+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry+(MALDI-MS)+for+peptides+and+proteins.">Graphite supported preparation (GSP) of alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) for matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS) for peptides and proteins.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1949-1954 (2012).</li><li>Laugesen, S., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+two+matrices+results+in+improved+performance+of+MALDI+MS+for+peptide+mass+mapping+and+protein+analysis.">Combination of two matrices results in improved performance of MALDI MS for peptide mass mapping and protein analysis.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 14, 992-1002 (2003).</li><li>Sparkman, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mass Spectrometry Desk Reference. , (2000).</li><li>Kussmann, M., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+techniques+for+peptides+and+proteins+analyzed+by+MALDI-MS.">Sample preparation techniques for peptides and proteins analyzed by MALDI-MS.</a> Methods Mol Biol. 146, 405-424 (2000).</li><li>Wang, R., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-accuracy+mass+measurement+as+a+tool+for+studying+proteins.">High-accuracy mass measurement as a tool for studying proteins.</a> Current opinion in biotechnology. 5, 77-84 (1994).</li><li>Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+large+protein+complexes+by+structural+mass+spectrometry.">Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry.</a> J. Vis. Exp. (40), e1954 (2010).</li><li>Hernandez, H., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+stoichiometry+and+interactions+of+macromolecular+assemblies+from+mass+spectrometry.">Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry.</a> Nature protocols. 2, 715-726 (2007).</li><li>Vestal, M. L., Juhasz, P., Martin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+extraction+matrix-assisted+laser+desorption+time-of-flight+massspectrometry.">Delayed extraction matrix-assisted laser desorption time-of-flight massspectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 9, 1044-1050 (1995).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הצגנו פרוטוקול פרט לרכישת ספקטרום המוני באיכות גבוהה של חלבונים שלמים גדולים עם משקולות מולקולריות גדולות יותר מאשר 100 kDa, באמצעות מכשיר MALDI-TOF. מספר ההיבטים הקריטיים הנוגעים להכנת המדגם יש לשקול בזהירות על מנת לשפר את האיכות של הספקטרום ההמוני. מטריצות וממסים של טוהר גבוה הם בעלי חשיבות קריטית משום שכל המזהמים המצויים במטריצות והממיסים מרוכזים על מטרת MALDI לאחר אידוי ממס. על מנת לשפר את הטוהר של מטריצות MALDI אפשר לטהר אותם באמצעות שיטות recrystallization קלאסיות (ראה לעיל). אנו ממליצים גם להכנת פתרונות מטריצות טריות (לפחות פעם בשבוע) כדי לשפר את התגבשות המטריצה ​​וכדי למנוע השפלה מטריקס. גישת תצהיר המטריצה ​​היא קריטית מאוד לאיכות הסופית של הספקטרום. כפי שתואר לעיל, שיטת השכבה דקה היא o השיטה שלנובחירת f 12. יתר על כן, אנו מותאמים הגישה להפקדת הרובד הראשון. כאשר המטריצה ​​היא מומס באצטון כדי להשיג פתרון רווי, propanone מאפשר אידוי מהיר של הממס, אלא גם עושה את הגודל של השכבה הראשונה קשה מאוד לשלוט. אנו מציעים באמצעות קצה GELoader כמברשת קטנה שאתה טובל בפתרון matrix_acetone כדי לקבל נפח מינימאלי שבו אתה להפקיד במהירות על המטרה. גודלה של השכבה הראשונה איכשהו שולט בגודל הסופי של מקום MALDI: נקודה קטנה (כלומר 0.5-0.75 מ&quot;מ בקוטר) היא עדיפה כי במקרה זה ריכוז המדגם הוא גבוה יותר מאשר במקרה של כתם גדול. קבלת נקודה קטנה שונה מהגישה השכבה דקה במיוחד שהוצעה בעבר בוידאו יופיטר 15. בFenyo et al. פתרון השכבה הדק היא התפשטה בכל רחבי יעד MALDI באמצעות הצד של קצה פיפטה. גישה זו מחייבת בדיקת השכבה דקה שצריכה לעמוד בקריטריונים מסוימים(למשל מהירות של אידוי ממס). אם הקריטריון הוא לא נפגש, יעד MALDI יש לשטוף וצריכה להיות מוכן בשכבה דקה חדשה. זה הופך את ההכנה מייגע למדי לטירון. יתר על כן, בתצהיר של תערובת מדגם / מטריצה ​​על הצלחת דורש השאיפה של הממס העודף באמצעות קו ואקום ושלב כביסה באמצעות 15 TFA הוא הכרחי, מה שהופך Fenyo et al. הכנה קצת קשה יותר מהגישה שלנו. יחס הנפח בין מטריקס לבין המדגם הוא חשוב מאוד עבור ניתוח מוצלח של חלבונים שלמים על ידי MALDI-TOF. לאחר בדיקת יחסים שונים אנו ממליצים להשתמש ביחס של 1:1. מטריצה ​​שונה: חלקם מדגם יכול להתפשר על האיכות של הספקטרום, ככל הנראה בשל התגבשות הומוגניות. הסדר שבו מטריצה ​​ומדגם מופקדים הוא גם קריטי. לאחר הפקדת השכבה דקה מטריקס, המדגם הוא מופקד, ומייד לאחר מכן (לפני sampנקודת le הופכת יבשה) את תערובת CHCA_DHB הוא הוסיף. הליך זה כבר מוגדר &quot;שיטת כריך&quot; 27, שבו המדגם לבד מופקד בין שתי שכבות מטריצה. כחלופה, פתרון CHCA_DHB והמדגם יכולים להיות מעורב ב0.5 צינור מיליליטר ולאחר מכן הבחינו בשכבה דקה CHCA 12. זה מניב נקודה בשכבה אחידה של גבישים וכתוצאה מספקטרום באיכות גבוהה. בעת ניתוח חלבונים עם מסה נמוכה מ100 kDa, הריכוז של DHB יכול להיות מוגבר (DHB למשל 60:40: CHCA), זה יכול לייצר שיא חדים, אך עלול לסכן את רגישות המדידה (כלומר, פסגות פחות אינטנסיבית). לכיול מכשיר נכון, זה הכרחי כדי להפקיד את הסטנדרטים calibrant קרובים מאוד לכתמי מדגם, המאפשר אחד כדי להשיג דיוק מסה טוב יותר. &quot;הליך כיול פסאודו פנימי&quot; הוצע בעבר 15: לאחר הרכישה של ספקטרום מדגם, אני מקום calibrantירייה של הלייזר והאות של calibrant מתווספות לספקטרום המדגם. זה מאפשר לך באופן פנימי לכייל את ספקטרום המדגם באמצעות פסגות calibrant. אנרגיית הלייזר צריכה להיות מבוקרת בקפידה גם במהלך רכישת הספקטרום. ברוב המקרים, אנרגיה גבוהה יותר מגבירה את הרגישות, אבל מורידה את הרזולוציה. אנו ממליצים להשתמש באנרגית לייזר המינימום אפשרית מבלי להתפשר על הרגישות של הרכישה. יתר על כן, כדי לשפר את איכות רפאים, אפשר לרכוש יותר יריות על כל נקודת מדגם. בדרך כלל יריות יותר אתה רוכש (1,000-2,000 יריות), גבוה יותר את עוצמת האות. כאשר להכות את המקום עם הלייזר, צריך למצוא את המיקום הנכון (כלומר, &quot;נקודה מתוקה&quot;), שכן המדגם לא מופץ homogenously. אתה יכול לירות באותו האזור עד האות הולכת וגדל, ולאחר מכן לנסות למצוא אזור אחר המכיל את המדגם. לסיכום, טוהר גבוה של מטריצות וsolvהאנטים, שיטות המשמשות למדגם ומטריצות בתצהיר על המטרה, העמדה בסטנדרטים המשמשים לכיול, את עוצמת אנרגיית לייזר, בעת רכישה (מספר יריות / מקום) הם גורמים קריטיים שיש לקחת בחשבון בעת ניתוח חלבונים שלמים על ידי MALDI-TOF MS. מחבר תרומות LS וEBE עיצבו את הניסויים, ביצעו ניסויי ספקטרומטריית המסה, ניתחו את הנתונים, וכתבו את כתב היד.

ביולוגיה מבנית מסתמכת על הייצור של חלבונים באיכות גבוהה 1, ולכן צריכה להיות בשילוב עם טכניקות יעילים ואמינות ל2,3 ניתוח חלבון. בספקטרומטריית מסת מעבדה (MS) במכון לביולוגיה מבנית שאנחנו צריכים לאשר את הרצף ראשוני של חלבונים, להעריך את הנוכחות של מוטציות ושינויי posttranslational, הפירוק של חלבונים, את ההומוגניות המדגם, ואת האיכות של תיוג איזוטופי (למשל deuterated חלבונים ללימודי תהודה מגנטיים גרעיניים 4). מאז ביולוגים מבניים להשתמש proteolysis המוגבל להבחין תחומים מבני נוקשה מחלקים גמישים, אנחנו צריכים לאפיין באופן מהימן חלבונים קטומים כגון שימוש בטרשת נפוצה. כאשר ביומולקולות מנותחות על ידי MS, שתי גישות אפשריות מנוצלים לionise ברכות מולקולות כבדות ויציבות כזה. יינון electrospray (ESI) ionises מולקולות ישירותשלב 5 נוזלי; יינון בסיוע מטריקס desorption הלייזר (MALDI) דורש כי ביומולקולות הן שיתוף התגבש עם מולקולות סופג אולטרה סגול אורגניות (כלומר מטריצת מולקולות) 6. (TOF) MS ESI הזמן של הטיסה מצמידים כרומטוגרפיה נוזלית הפכה טכניקה שגרתית לניתוח חלבונים שלמים, משום שהיא מאפשרת קביעת מסה ברמת דיוק גבוהה (≤ 50 עמודים לדקה). עם זאת, הוא די רגיש להרכב של חיץ המדגם (בפרט למלחים וחומרי ניקוי) ומזהמים (כלומר פולימרים) שהם לפעמים קשים כדי לחסל, וגרמו לדיכוי של אות אנליטי. MALDI-TOF MS מייצג אלטרנטיבה יעילה לESI-MS כי ביצועיה מושפעים פחות רכיבי חיץ, חומרי ניקוי וחומרים מזהמים, ומאפשר קביעת מסת חלבון שלם עם דיוק מספיק (≤ 500 עמודים לדקה) לאימות רצף. לאחר protein עיכול, MALDI-TOF MS יכול להיות מנוצל גם כדי לנתח את הפפטידים שהושגו לאישור רצף העיקרי עוד יותר על ידי מה שנקרא &quot;טביעת האצבע ההמונית פפטיד&quot;. בידיים שלנו, קביעת המסה של חלבונים שלמים, שהם גדולים יותר מ100 kDa והטרוגנית (עקב שינויים או truncations), היא קלה יותר על ידי MALDI-MS מאשר על ידי ESI-MS. זאת בשל המחסור בהפצות מדינת תשלום חופפות הווה בספקטרום ESI. יתר על כן, מאז תהליך MALDI אינו תלוי בגודל אנליטי 7, הרגישות גבוהה תשואות שיטה כזו כאשר מסת biomolecule היא מעל 100 kDa. ניתוחים מופלאים של חלבונים שלמים בוצעו באמצעות מכשירים מתוצרת בית בין סוף -1980 ותחילת 1990 של 8-11. MALDI-TOF יכול לשמש גם ככלי מיון כדי להעריך את האיכות של דגימות חלבון מכיוון שהיא דורשת פחות זמן להכנת מדגם, והוא פחות רגיש לinterferenCES בשל זיהומים נפוצים (למשל מלחים). לאחר הערכה ראשונה, מהירה ידי MALDI-MS, מדגם ניתן לנתח עוד יותר על ידי ESI-TOF לקבוע המסה שלו עם דיוק גבוה יותר. יתר על כן, MALDI מייצר יונים המכילים פחות חיובים מאשר ESI ולכן רכישה ופרשנות הנתונים MALDI הוא יותר פשוט. זה מאפשר לסטודנטים לעבוד בביולוגיה מבנית לניתוח החלבונים רקומביננטיים שלהם רק לאחר הכשרה קצרה. גורמים מרכזיים שני משפיעים על איכות ספקטרום MALDI: מטריקס ואת הטכניקה המשמשת לתצהיר המטריצה ​​(אגל למשל מיובש 8 ושכבה דקה 12-16,17,18). מטריצה ​​אורגנית אחת [לדוגמא: חומצת sinapinic (SA) 19-21 או α-Cyano-4-hydroxycinnamic חומצה (α-CHCA) 14,22,23] משמש לעתים קרובות לבחינת הטרשת הנפוצה של חלבונים שלמים וקומפלקסי חלבונים צולבים . באמצעות α-CHCA, קבוצת חייט הציגה פרוטוקול מפורט עבור p בעברreparing שכבה דקה במיוחד לפני ניתוח MALDI של חלבונים מסיסים וקרום 14,15. לאחרונה, גורקה et al. מאויר ציפוי היעד מבוסס גרפיט כדי לשפר את ניתוח MALDI של פפטידים וחלבונים באמצעות α-CHCA כמטריצה ​​24. כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט לניתוח חלבונים שלמים על ידי MALDI-TOF MS, ניצול תערובת של שתי מטריצות: חומצת 2,5-dihydroxybenzoic (DHB) וα-CHCA 25. אנחנו באופן שיטתי הערכנו את הביצועים של תמהיל DHB-CHCA לעומת מטריצות SA ו α-CHCA, לבקרה של חלבונים שלמים. תערובת המטריצה ​​מאפשרת רזולוציה טובה יותר (כלומר פסגות החלבון הן הרבה יותר חדות). יתר על כן, נוכחותם של יוני חיובים מרובים אינטנסיביים (כלומר M +2 H 2 +, M +3 H 3 +, וכו &#39;) מאפשר קביעת מסה מדויקת יותר בגלל הרזולוציה של מכשירי MALDI-TOF הצירי היא גבוהה יותר במסה נמוכה יותר על פני תשלום (מ &#39;/ z) 26. התכונה זו שימושית במיוחד לקביעת המשקל המולקולרית של חלבונים גדולים יותר מאשר 100 kDa. רגישות גבוהה יותר גם הגיעה באמצעות תערובת DHB-CHCA (0.5 pmoles של חלבון הבחין ביעד MALDI). כפי שהזכרנו לעיל, גורם חשוב שיש לקחת בחשבון בעת ​​השימוש במכשיר MALDI הוא בתצהיר המטריצה. Laugesen et al. הציע את השימוש בתערובת DHB-CHCA בפעם הראשונה 25, תוך ניצול תצהיר הטיפה היבש. עם זאת, ראו תוצאות טובות יותר (לדוגמא: רגישות גבוהה בהרבה) כאשר אנו מנוצלים בשיטת השכבה דקה שבו השכבה הראשונה נוצר על ידי α-CHCA מומס באצטון. 12,27 שיטת השכבה דקות מרמז על היווצרות תשתית הומוגנית של גבישי מטריקס על יעד MALDI, שתואר בוידאו יופיטר בעבר 15. ואז, המדגם הוא שהופקד על תשתית זו, ובסופומטריצה ​​נוספת שהופקדה (ראה להלן). במאמר זה, אנחנו גם מדגימים כיצד להפקיד את המדגם על יעד MALDI, אלא גם איך לנקות היעד 15, לrecrystallize, ולהכין את המטריצות. לסיכום אנו שואפים לספק את כל המידע הדרוש לניתוח חלבונים שלמים למדענים (בפרט, ביולוגים מבניים) שצריך כדי להעריך את האיכות של חלבונים המיוצרים באופן מהיר ופשוט ושלא כל כך מכיר את MALDI-TOF MS. כפי שחזה באמצע 1990 28, MS יש לו השפעה מוגברת על מחקר ביולוגי, כמו הנגישות שלה לביולוגים גדלה. אנו מקווים כי את המידע שהעברנו יהיה שימושי כדי להפוך MALDI-TOF נגיש לביולוגים ומדענים שרוצים להתחיל להשתמש בספקטרומטריית מסה.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizima</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin 6 chromatography columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6221</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 500</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0122</td>
			<td>various molecular weight cut off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>14262</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>02860</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMTECH SCIENCE Precision Wipes Tissue Wipers</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>05511</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&alpha;-cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8982</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650501</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5-dihydroxybenzoic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>39319</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GELoader Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 001.222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>09676</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Standard II</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>207234</td>
			<td>It contains Trypsinogen, Protein A, Serum Albumin-Bovine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoglobulin G</td>
			<td>ABSciex</td>
			<td>GEN602151</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water purifier PURELAB Ultra Analytic</td>
			<td>ELGA LabWater</td>
			<td>89204-052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex MALDI-TOF instrument</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (maldi-tof) mass spectrometric analysis of intact proteins larger than 100 kda

יעילות קביעת המונים של חלבונים היא קריטית להרבה מחקרים ביולוגיים (למשל לחקירות ביולוגיה מבניות). קביעת מסה מדויקת מאפשרת לאדם להעריך את נכונות רצפים עיקריים חלבון, הנוכחות של מוטציות ו / או לאחר translational שינויים, השפלה ניתן חלבון, הומוגניות המדגם, ואת מידת שילוב איזוטופ במקרה של תיוג (תיוג C למשל 13 ). ספקטרומטריית מסת יינון electrospray (ESI) (MS) היא בשימוש נרחב לקביעת מסה של חלבונים מפוגלים, אבל היעילות שלה מושפעת מהרכבו של חיץ המדגם. בפרט, נוכחותם של מלחים, חומרי ניקוי, ומזהמים פוגעת קשה ביעילותו של ניתוח חלבון על ידי ESI-MS. MS desorption לייזר בסיוע מטריקס / יינון (MALDI) הוא חלופה אטרקטיבית, בשל סובלנות מלחה והפשטות של רכישת נתונים וinterpretation. יתר על כן, קביעת המסה של חלבונים הטרוגנית גדולים (גדול יותר מ100 KDA) היא קלה יותר על ידי MALDI-MS בשל היעדר חפיפת הפצות מדינת תשלום גבוהות אשר נמצאות בספקטרום ESI. כאן אנו מציגים גישה נגישה לניתוח חלבונים גדולים יותר מאשר 100 kDa ידי MALDI פעמי של טיסה (TOF). אנו מדגימים את היתרונות של שימוש בתערובת של שתי מטריצות (חומצה כלומר 2,5-dihydroxybenzoic וחומצת α-Cyano-4-hydroxycinnamic) ואת התועלת של שיטת השכבה דקה גישה לתצהיר מדגם. כמו כן נדונונו בתפקיד הקריטי של המטריצה ​​וטוהר ממס, של הסטנדרטים המשמשים לכיול, של אנרגיית הלייזר, וזמן הרכישה. בסך הכל, אנו מספקים מידע הכרחי למתחילים לניתוח חלבונים שלמים גדולים יותר מאשר על ידי MALDI-MS 100 kDa.

ניתחנו חלבון שלם (חלבון אזור כרומוזום תחזוקת 1, Crm1; משקל מולקולרי: 123,386 דא) באמצעות שתי מטריצות שונות, שתי שיטות בתצהיר, ואת אותו עוצמת הלייזר (איור 1). SA ותערובת CHCA_DHB נוצלו כמטריצות. התערובת הניבה ספקטרום המוני של איכות גבוהה יותר במונחים של יחס אות לרעש ורגישות (איורים 1 א &#39;וב&#39;). בפרט, אנו יכולים לזהות 0.5 pmoles של חלבון שהופקד על יעד MALDI (תרשים 1C). אותה הכמות של חלבון הייתה בקושי לזיהוי באמצעות SA (1D איור). יתר על כן, שימוש בתערובת המטריצות, שיטת בחירה של תצהיר המטריצה ​​הייתה הגישה &quot;שכבה דקה&quot; (איור 1 א). תוך שימוש בשיטת &quot;יבש טיפה&quot;, אנחנו לא מזהים כל חלבון עם מסה גבוהה יותר מאשר 100 kDa (מידע לא מוצג). ניצול תערובת CHCA_DHB (איורים 1 א ו 1 ג), מתרבים טעון יון של protein נצפו, המאפשר קביעת המסה עם דיוק גבוה יותר בגלל הרזולוציה השיא במכשירי MALDI-TOF הצירי היא ביחס הפוך למ &#39;/ z 26. אנחנו גם ניתחנו בטא galactosidase monomeric (116,300 דא) (איור 2). ספקטרום CHCA_DHB היה טוב יותר מספקטרום SA במונחים של רגישות ורזולוציה. יתרה מזאת, הנוכחות של יונים טעונים להכפיל (ז 2 +, 3 + M ו4 M +) אפשרה לנו לאשר את המסה של החלבון עם דיוק גבוה יותר (2A דמויות ו2C). שימוש בגישת השכבה דקה, השווינו את הביצועים של תערובת CHCA_DHB, SA ו α-CHCA לבד לניתוח של אימונוגלובולינים, IgG (148,500 דא) (איור 3). כאשר אנו לתאם את הנתונים השונים, אותות חלבון היו גבוהים יותר ועם רזולוציה טובה יותר בספקטרום CHCA_DHB. לסיכום, השימוש בתערובת CHCA_DHB והשיטה בתצהיר שכבה דקה<html> הפגין שיפור משמעותי באיכות של ספקטרום מסת חלבון הגדול בשלמותה רכש באמצעות מכשיר MALDI TOF. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig1.jpg" /> איור 1. ניתוח MALDI-TOF של חלבון אזור כרומוזום שלם תחזוקת 1, (Crm1), משקל מולקולרי: 123,386 דא. א) pmole 1 של Crm1 נותח באמצעות תמהיל DHB_CHCA כסכום מטריצת B):. Pmole 1; מטריקס: כמות SA ג):. 0.5 pmole; מטריקס: כמות DHB_CHCA D): 0.5 pmole; מטריצה:. SA. האות של הפסגות, המתבטאת בקנה מידת יחידת עוצמת שרירותית, הוא מנורמל לערך הנוכחי המרבי בכל ספקטרום. pg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50635/50635fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. ניתוח MALDI-TOF של בטא galactosidase שלם (116,300 דא). א) כמות: 20 pmoles; סכום DHB_CHCA המטריצה ​​B):. 20 pmoles; מטריקס: כמות SA ג):. 5 pmoles; מטריקס: כמות DHB_CHCA ד &#39;):. 5 pmoles; מטריקס: SA. <img alt="איור 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig3.jpg" /> איור 3. ניתוח MALDI-TOF של אימונוגלובולינים שלמים, IgG (148,500 דא); סכום:. 1.7 pmoles הספקטרום שהושג באמצעות תערובת CHCA_DHB היה הרבה יותר אינטנסיבי (מקסימום: 8200 יחידה שרירותית, au) מאשר ספקטרום SA (מקסימום: 1,200 au) וספקטרום α-CHCA (מקסימום: 4500 au)

Watch this Scientific Journal Video about Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa at JoVE.com

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

מדידת מסה מדויקת מייצגת צעד חשוב במהלך החקירה של חלבונים. desorption / יינון בסיוע מטריקס לייזר (MALDI) ספקטרומטריית מסה (MS) יכולה לשמש לקביעה כאמור והיתרון המרכזי שלו הוא הסובלנות למלחים, חומרי ניקוי וחומרים מזהמים. כאן אנו מדגימים גישה נגישה לניתוח חלבונים גדולים יותר מאשר על ידי MALDI-MS 100 kDa.

מטריקס בסיוע לייזר Desorption / יינון זמן של טיסה (MALDI-TOF) Mass ניתוח Spectrometric של חלבונים שלמים גדול מ100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

matrix-assisted-laser-desorptionionization-time-flight-maldi-tof-mass

Research

JoVE Journal

Chemistry

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

80.3K Views.  Université J. Fourier.  מדידת מסה מדויקת מייצגת צעד חשוב במהלך החקירה של חלבונים. desorption / יינון בסיוע מטריקס לייזר (MALDI) ספקטרומטריית מסה (MS) יכולה לשמש לקביעה כאמור והיתרון המרכזי שלו הוא הסובלנות למלחים, חומרי ניקוי וחומרים מזהמים. כאן אנו מדגימים גישה נגישה לנית?...

Video: Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune system that is protective against pathogenic microbes. Abnormal sebum production and chemical composition are also a clinical symptom of specific skin diseases. Sebum contains a complex mixture of lipids, including triacylglycerides, which is species-specific. The broad chemical properties exhibited by diverse lipid classes hinder the specific determination of sebum composition. Analytical techniques for lipids typically require chemical derivatizations that are labor-intensive and increase sample preparation costs. This paper describes how to extract lipids from mammalian integument, separate broad lipid classes by thin-layer chromatography, and profile the triacylglyceride contents using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. This robust method enables a direct determination of the triacylglyceride profiles among species and individuals, and it can be readily applied to any taxonomic group of mammals.

Mammalian integument contains solvent-extractable lipids that can provide chemical compositions characteristic of individual species. This paper presents a routine method for separating broad lipid classes isolated from integumentary tissues using thin layer chromatography and determining the triacylglyceride profile by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.

פרופיל תוכן Triacylglyceride בשומני הכסות בת על ידי כרומטוגרפיה Preparative שכבה דקה וMALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune ...

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for characterizing lyophilized formulations of protein therapeutics. Labeling followed by suitable proteolytic digestion allows the protein structure and interactions to be mapped with peptide-level resolution. Since the protein structural elements are stabilized by a network of chemical bonds from the main-chains and side-chains of amino acids, specific labeling of atoms in the amino acid residues provides insight into the structure and conformation of the protein. In contrast to routine methods used to study proteins in lyophilized solids (e.g., FTIR), ssHDX-MS and ssPL-MS provide quantitative and site-specific information. The extent of deuterium incorporation and kinetic parameters can be related to rapidly and slowly exchanging amide pools (Nfast, Nslow) and directly reflects the degree of protein folding and structure in lyophilized formulations. Stable photolytic labeling does not undergo back-exchange, an advantage over ssHDX-MS. Here, we provide detailed protocols for both ssHDX-MS and ssPL-MS, using myoglobin (Mb) as a model protein in lyophilized formulations containing either trehalose or sorbitol.

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

Mass spectrometric גישות לחקר מבנה חלבון ואינטראקציות באבקות Lyophilized

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, and that these chemical fingerprints can be used for plant species identification. The mass spectral data can be acquired rapidly and in a high throughput manner without the need for sample extraction, derivatization or pH adjustment steps. The use of this technique bypasses challenges presented by more conventional techniques including lengthy chromatography analysis times and resource intensive methods. The high throughput capabilities of the direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry protocol, coupled with multivariate statistical analysis processing of the data, provide not only class characterization of plants, but also yield species and varietal information. Here, the technique is demonstrated with two psychoactive plant products, Mitragyna speciosa (Kratom) and Datura (Jimsonweed), which were subjected to direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry followed by statistical analysis processing of the mass spectral data. The application of these tools in tandem enabled the plant materials to be rapidly identified at the level of variety and species.

A method for species identification of botanical material by direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry and multivariate statistical analysis is presented.

ראפיד תפוקה גבוהה זיהוי מינים של חומר הבוטני באמצעות ניתוח ישיר בזמן אמת רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

אנליזת נשימה בזמן אמת באמצעות Nanoelectrospray משני יינון מצמידים ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group analysis as matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). This tutorial demonstrates methods for optimization of the sample preparation, spectral acquisition, and data analysis of synthetic polymers using MALDI-TOF MS. Critical parameters during sample preparation include the selection of the matrix, identification of an appropriate cationization salt, and tuning the relative proportions of the matrix, cation, and analyte. The acquisition parameters, such as mode (linear or reflector), polarization (positive or negative), acceleration voltage, and delay time, are also important. Given some knowledge of the chemistry involved to synthesize the polymer and optimizing both the data acquisition parameters and the sample preparation conditions, spectra should be obtained with sufficient resolution and mass accuracy to enable the unambiguous determination of the end groups of most homopolymers (masses below 10,000) in addition to the repeat unit mass and the overall molecular weight distribution. Though demonstrated on a limited set of polymers, these general techniques are applicable to a much wider range of synthetic polymers for determining mass distributions, though end group determination is only possible for homopolymers with narrow dispersity.

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometry

A protocol for the matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) characterization of synthetic polymers is described including the optimization of sample preparation, spectral acquisition, and data analysis.

אפיון של פולימרים סינתטיים באמצעות מטריקס בסיוע לייזר Desorption יינון שעת הטיסה (MALDI-TOF) ספקטרומטר מסה

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group ...

An Efficient Sample Preparation Method to Enhance Carbohydrate Ion Signals in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Sample preparation is a critical process in mass spectrometry (MS) analysis of carbohydrates. Although matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) MS is the method of choice in carbohydrate analysis, poor ion signal and data reproducibility of carbohydrate samples continue to be severe problems. For quantitative analysis of carbohydrates, an effective analytical protocol providing superior data quality is necessary. This video demonstrates sample preparation protocols to improve signal intensity and minimize data variation of carbohydrates in MALDI-MS. After drying and crystallization of sample droplets, the crystal morphology is reformed by methanol before mass spectrometric analysis. The enhancement in carbohydrate signal is examined with MALDI imaging mass spectrometry (IMS). Experimental results show that crystal reformation adjusts crystalline structures and redistributes carbohydrate analytes. In comparison with the dried droplet preparation method in conventional MALDI-MS, reforming carbohydrate crystal morphologies with methanol shows significantly better signal intensity, ion image distribution, and data stability. Since the protocols demonstrated herein do not involve changes in sample composition, they are generally applicable to various carbohydrates and matrixes.

A protocol for enhancing carbohydrate ion signals in MALDI mass spectrometry by reforming crystalline structures during sample preparation processes is demonstrated.

שיטת הכנה מדגם יעיל לשיפור אותות יון פחמימות לייזר בסיוע מטריקס Desorption/יינון ספקטרומטריית

Sample preparation is a critical process in mass spectrometry (MS) analysis of carbohydrates. Although matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) ...

Imaging Corrosion at the Metal-Paint Interface Using Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS), illustrating that SIMS is a suitable technique to study the chemical distribution at a metal-paint interface. The painted Al alloy coupons are immersed in a salt solution or exposed to air only. SIMS provides chemical mapping and 2D molecular imaging of the interface, allowing direct visualization of the morphology of the corrosion products formed at the metal-paint interface and mapping of the chemical after corrosion occurs. The experimental procedure of this method is presented to provide technical details to facilitate similar research and highlight pitfalls that may be encountered during such experiments.

Time-of-flight secondary ion mass spectrometry is applied to demonstrate the chemical mapping and corrosion morphology at the metal-paint interface of an aluminum alloy after being exposed to a salt solution compared with a specimen exposed to air.

הדמיה קורוזיה בממשק צבע מתכת באמצעות המסה של זמן טיסה משני המוני ספקטרומטריה

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass ...

Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass spectrometry (MS) of complex molecules and their reactions on surfaces. DINeC is based on a beam of SO2 clusters impacting on the sample surface at low cluster energy. During cluster-surface impact, some of the surface molecules are desorbed and ionized via dissolvation in the impacting cluster; as a result of this dissolvation-mediated desorption mechanism, low cluster energy is sufficient and the desorption process is extremely soft. Both surface adsorbates and molecules of which the surface is composed of can be analyzed. Clear and fragmentation-free spectra from complex molecules such as peptides and proteins are obtained. DINeC does not require any special sample preparation, in particular no matrix has to be applied. The method yields quantitative information on the composition of the samples; molecules at a surface coverage as low as 0.1 % of a monolayer can be detected. Surface reactions such as H/D exchange or thermal decomposition can be observed in real-time and the kinetics of the reactions can be deduced. Using a pulsed nozzle for cluster beam generation, DINeC can be efficiently combined with ion trap mass spectrometry. The matrix-free and soft nature of the DINeC process in combination with the MSn capabilities of the ion trap allows for very detailed and unambiguous analysis of the chemical composition of complex organic samples and organic adsorbates on surfaces.

Neutral SO2 clusters of low kinetic energy (&#60; 0.8 eV/constituent) are used to desorb complex surface molecules such as peptides or lipids for further analysis by means of mass spectrometry using an ion trap mass spectrometer. No special sample preparation is required, and real-time observation of reactions is possible.

ניתוח של מולקולות מורכבות והתגובות שלהם על משטחים באמצעות מצבר-המושרה באמצעות אשכול/אינון המסה ספקטרומטריה

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass ...

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain using antibiotic induction, and identified by MALDI-TOF-TOF tandem mass spectrometry and top-down proteomic analysis with software developed in-house. The immunity protein of colicin E3 (Im3) and the immunity protein of bacteriocin (Im-Bac) were identified from prominent b- and/or y-type fragment ions generated by the polypeptide backbone cleavage (PBC) on the C-terminal side of aspartic acid, glutamic acid, and asparagine residues by the aspartic acid effect fragmentation mechanism. The software rapidly scans in silico protein sequences derived from the whole genome sequencing of the bacterial strain. The software also iteratively removes amino acid residues of a protein sequence in the event that the mature protein sequence is truncated. A single protein sequence possessed mass and fragment ions consistent with those detected for each immunity protein. The candidate sequence was then manually inspected to confirm that all detected fragment ions could be assigned. The N-terminal methionine of Im3 was post-translationally removed, whereas Im-Bac had the complete sequence. In addition, we found that only two or three non-complementary fragment ions formed by PBC are necessary to identify the correct protein sequence. Finally, a promoter (SOS box) was identified upstream of the antibacterial and immunity genes in a plasmid genome of the bacterial strain.

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Here we present a protocol for the rapid identification of proteins produced by genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF tandem mass spectrometry and top-down proteomic analysis with software developed in-house. Metastable protein ions fragment because of the aspartic acid effect and this specificity is exploited for protein identification.

זיהוי חלבוני חסינות אנטיבקטריאליים ב- Escherichia coli באמצעות MALDI-TOF-TOF-MS/MS וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

חילופי מימן/דיטריום מבוססי נימי אלקטרופורזה לאפיון קונפורמציה של חלבונים עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

מטריקס בסיוע לייזר Desorption / יינון זמן של טיסה (MALDI-TOF) Mass ניתוח Spectrometric של חלבונים שלמים גדול מ100 kDa

PLAYLIST