אנו מודים FortéBio למתן גרפיקה המשמשת באיור 1. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH GM083088 לTMD

<html> 1. תכנות המכשיר לAssay BLI הפעל את המכשיר לפחות שעה אחת מראש כדי לאפשר את המנורה כדי להתחמם, זה הכרחי כדי למזער את הרעש ולהיסחף באותות אופטיים במהלך הניסוי. הגדר את הטמפרטורה הרצויה באמצעות כרטיסיית המכשיר לprewarm מדגם בעל הצלחת. ואז להגדיר את עיצוב הניסיון בתוכנת רכישת נתונים. בחר &quot;ניסוי החדש קינטיקס&quot; בכרטיסייה אשף הניסוי. זה מציג תפריט עם לשוניות עם כל הצעדים שחייבים להיות מוגדר. 1.1. הגדרת פלייט הגדר את העמודות כדי לשמש על צלחת מדגם 96 היטב. הקצאת עמודות להכיל חיץ, חלבון משותק או שותף מחייב. לכל עמותה גם, הזן את הריכוז מחייב שותף לשמש. הערה: יש לו את הגדרת הצלחת שמוצגת באיור 2 אפשרויות למבחנים שונים. 1.2. הגדרת assay ontent &quot;&gt; הגדר את כל נחוצים עבור assay הצעדים. אלה כוללים Baseline (ט) (מספר), (ii) טוען, (iii) התאחדות וכן (iv) דיסוציאציה מחייב שותף. ואז, כפי שיתואר להלן, לקשר צעדי assay פרט עם עמודות של בארות על צלחת המדגם על ידי בחירת צעד assay ולאחר מכן לחיצה כפולה על העמודה המתאימה. תוכניות זה החיישנים שעברו מטור אחד של בארות למשנהו במהלך assay. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Baseline להתחיל בצעד קצר בסיסי (≥ 60 שניות), עם חיישנים במאגר assay (איור 2, טור 1), להקים אותות BLI ראשוניים בצלחת 96 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוען (לשתק את חלבון biotinylated על החיישנים) הקצאת חיישנים לבארות שיכילו חלבון biotinylated (איור 2, עמודת 2). השתמש בפונקצית הסף כדי להשיג רמה קבועה מראש של מחייב (ראה מבוא). הגדר את אפשרות הסף, כך שכל החיישנים יהיו מהלךד לטור הבא של בארות, כאשר כל אחד מהחיישנים מגיע לסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Baseline כולל צעד בסיסי אחר במאגר (איור 2, טור 3, בדרך כלל&gt; 5 דקות) כדי לשטוף חלבוני biotinylated nonimmobilized מהחיישנים ולהקים אותות בסיס חדשים, יציבים. עבור מבחני מחייב / ניתוק בסיסיים בלבד (כמו באיור 3), כולל צעד נוסף בסיסי (60 שניות) עם חיישנים בבארות חדשות של חיץ (איור 2, טור 4) לפני השלב האגודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האגודה (של השותף מחייב את החלבון המשותק) עבור assay בסיסי מחייב / דיסוציאציה (כמו באיור 3), בחר טווח ריכוזים של שותף מחייב לשמש לחיישנים / בארות שונות (איור 2, בטור 5). התאם את זמן צעד, כך שלפחות ריכוז להרוות של שותף המחייב צריך גישת שיווי משקל מחייב אות. עבורassay כדי לבדוק את השפעות allosteric של ligands הקטן על ניתוק של מתחם חלבונים (כמו באיור 5), בחר ריכוז אחד גבוה של שותף מחייב (~ פי 10 מעל המוערך K D) לשימוש בכל בארות העמותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיסוציאציה (של שותף המחייב) עבור assay בסיסי מחייב / ניתוק בלבד (כמו באיור 3), לייעד את החיישנים כדי לחזור לעמודת 4 (איור 2), אותו בארות המאגר כמשמש לבסיס הנוסף לפני האגודה. עבור assay כדי לבחון השפעות allosteric של ligands הקטן, במקום לייעד חיישנים כדי לעבור לעמודה 6 (איור 2), שבו כל אחד גם יכול להכיל חיץ בתוספת ligands allosteric שונה. </li></ol> 1.3. הקצאת חיישן לציין את מיקומם במגש החיישן שיכיל חיישני prewetted עבור assay. זהה את כל עמדות ריקות מאז הניסוי FAIl אם אין חיישנים נאספים. 1.4. ניסוי ביקורת דמיינו את כל הצעדים המתוכננים כדי לבדוק טעויות ולחזור כדי לתקן אותם. 1.5. הפעל ניסוי הזן את פרטים דרושים, ובכלל זה מיקום של קבצי הנתונים. הזן את הטמפרטורה הרצויה לצורך הניסוי. אם חיישנים עדיין דורשים prewetting, בחר את האפשרות לדחות את תחילת הניסוי. לבסוף, לאחר כל הכנת המדגם היא מלאה (שלב 2) והן את צלחת המדגם ומגש חיישן נטענות במכשיר, לחץ על כפתור Go כדי להפעיל את assay. 2. לדוגמא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ assay מתאים. המאגר משמש לניסויים מוצגים באיורים 3 ו -5: 20 מ&quot;מ מגבים (3 - חומצה (N-morpholino) propanesulfonic), טריס (טריס (hydroxymethyl) אמינו מתאן) (הוסיפו לכדי להתאים את pH 8.0), 50 מ&quot;מ KCl. כולל ארגון ה-BSA (אלבומין בסרום שור, חומצות שומן חופשי, 0.5מ&quot;ג / מיליליטר סופי) במאגר עבור כל שלבי assay ולתמיד דילולים של חלבון biotinylated או השותף מחייב למזער ספציפי מחייב של חלבונים לחיישנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את חלבון biotinylated (ε) במאגר assay לריכוז מתאים (ראה מבוא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילולים של שותף המחייב (F 1 (-ε)) במאגר assay (ראה דיון לטווח של ריכוזים להשתמש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prewet חיישני streptavidin המצופה לפחות 10 דקות כדי להסיר ציפוי סוכרוז המגן שלהם. הסר את המדף המכיל חיישן ממגש החיישן ולהכניס את צלחת 96 היטב בחלקו התחתון של המגש, הזזה פינה אחת של הצלחת לתוך החריץ המכוון על המגש. לטור של חיישנים כדי לשמש, להוסיף 200 μl של חיץ assay לכל טוב באותה עמודה של צלחת 96 היטב. להחזיר את המתלה של חיישנים למגש בכיוון הנכון (עם כרטיסיות בחריצים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שהוקצה במהלך תכנות בשלב 1, למלא בארות oו צלחת המדגם עם חיץ assay או דילולים החלבון המתאימים, כמו באיור 2. למנוע החדרת בועות, כפי שהם יכולים לגרום לרעש באותות אופטיים. כולל בארות התייחסות אחת או יותר שמשמיטות או חלבון (i) biotinylated או (ii) שותף מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הדלת של המכשיר והכנס את מגש החיישן על הבמה (משמאל), עם הכרטיסיות של המגש מוכנסות לתוך החריצים של הבמה. הכנס את צלחת המדגם לבעל הצלחת (מימין); לוודא כי הצלחת יושבת שטוחה ובכיוון הנכון, כפי שמצוין על בעל הצלחת. סגור את הדלת ולהתחיל assay מתכנית רכישת נתונים (שלב 1.5). </li></ol> 3. עיבוד נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר assay יש לרוץ, לפתוח את תוכנת ניתוח נתונים ולטעון את התיקייה המכילה את הנתונים. לחץ על הלשונית &quot;עיבוד&quot; כדי לראות תפריט צעד חכם עיבוד (בצד השמאל) ואת הנתונים הקינטית הגלם, עם כל חיישן (AH) שהוקצה בצבע שונה (ראהאיור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &quot;נתונים לבחירה&quot;, לחץ על הכפתור &quot;חיישן לבחירה&quot;. על &quot;מפת פלייט לדוגמא&quot;, לייעד את הבארות לחיישני 1 או 2 שליטה (G, H בassay של איור 3) כמו בארות התייחסות. בתפריט העיבוד, סמן את תיבת &quot;חיסור&quot; ובחר באפשרות &quot;הפניה ולס&quot; להחסיר אות ייחוס (בודדת או בממוצע) מהאותות של כל חיישן אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את כל העקבות לY = 0 על ידי שימוש בצעד &quot;יישור Y הציר&quot;. בחר &quot;Baseline&quot; כצעד היישור (זה להיות הבסיס האחרון לפני השלב האגודה). עבור &quot;טווח זמן&quot;, הזן שעברה 10 שניות של בסיס ש( כלומר 50-60 שניות לתחילת מחקר 60-sec, כמו באיור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את תיבת &quot;Inter-צעד תיקון&quot; כדי למזער משמרות אות בין צעדי האיגוד ודיסוציאציה. בחר ליישר קו בסיס או דיסוציאציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פונקצית סינון Savitzky-Golay ברוב המקרים ולחץ על &quot;נתונים בתהליך!&quot; כדי להמשיך. ראייה לבדוקעיבודים הסופיים (פנל ימני תחתון). עם מבחני המיועדים לניתוח נתונים הגלובלי (כמו באיור 4), אם עקבות אות מראות שינוי משמעותי בין האיגוד וצעדי דיסוציאציה, לשנות את הבחירה של דיסוציאציה או Baseline ל&quot; תיקון אינטר הצעד &quot;ולעבד מחדש את הנתונים לפני שתמשיך לנתונים ניתוח. </li></ol> 4. ניתוח נתונים לחץ על הלשונית &quot;ניתוח&quot; בניתוח נתונים כדי להתחיל. הערה: בדוגמא על השלבים להלן לניתוח הגלובלי של עקומות מחייב / ניתוק מרובים (כמו באיור 3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל&quot; צעד כדי לנתח &quot;, בחר איגוד ודיסוציאציה. עבור &quot;דגם&quot;, בחר 1:1. הערה: אפשרויות מוגבלות אחרות זמינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל&quot; התאמה &quot;, לבחור גלובלי (מלא). עבור &quot;קיבוץ לפי&quot; בחר צבע (כמו בגרף). בחר &quot;מקסימום R לא צמוד על ידי חיישן&quot; כדי לאפשר התאמה עצמאית של מקסימום R (תגובת אות מקסימלי על להרוות מחייב של הנקובtner לחלבון המשותק). הערה: אנחנו עושים את זה עבור רוב מבחני, כמו חיישנים להשתנות מעט בכמות החלבון המשותקת (ראה איור 3, טוען). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטבלה המוצגת, ודא שיש כל עקבות החיישן להיות מנותחים באותו צבע, ולכן הם ינותחו כמערכת גלובלית. במידת צורך, בחר חיישן אחד או יותר עקבות להשמיט ממדידה העולמית: תחת העמודה &quot;כלול&quot;, לחץ לחיצה ימנית על מיקום החיישן הרצוי ובחר &quot;תכלול ולס&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;Curves Fit!&quot; כדי להתחיל את ניתוח רגרסיה ליניארית. לבחון את התוצאות מתאימות, הכוללות כיסוי (i) של עקומות רגרסיה עם עקבות נתוני חיישן (כמו באיור 4), (ii) מגרשים של שאריות הולמת, וכן (iii) טבלה עם ערכי פרמטרים שנקבעו (קבועי קצב, R מקסימום, K D) ונתונים סטטיסטיים (סטיות התקן עבור פרמטרים, צ&#39;י בריבוע, R 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &quot;יצוא נתונים&quot;, לשמור את התוצאות מתאימות על ידי לחיצה על &quot;יצוא טבלה ל. קובץ CSV&quot;. לgrapהינג או ניתוח נוסף של הנתונים / עקומות מצוידות בתוכנה אחרת, לחץ על &quot;התאמת תוצאות יצוא&quot; כדי לשמור את הנתונים של כל חיישן ועקומה מצויד בקובץ טקסט. </li></ol>

<ol>
	<li>Nirschl, M., Reuter, F., Voros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+Transducer+Principles+for+Label-Free+Biomolecular+Interaction+Analysis.">Review of Transducer Principles for Label-Free Biomolecular Interaction Analysis.</a> Biosensors. 1, 70-92 (2011).</li><li>Homola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+and+future+of+surface+plasmon+resonance+biosensors.">Present and future of surface plasmon resonance biosensors.</a> Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).</li><li>Piehler, J., Brecht, A., Gauglitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+Detection+of+Low+Molecular+Weight+Analytes.">Affinity Detection of Low Molecular Weight Analytes.</a> Anal. Chem. 68, 139-143 (1996).</li><li>Duncan, T. M., Hackney, D. D., Tamanoi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Enzymes.">The Enzymes.</a> Energy Coupling and Molecular Motors Vol. XXIII, 203-275 (2004).</li><li>Feniouk, B. A., Suzuki, T., Yoshida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+subunit+&#949;+in+the+catalysis+and+regulation+of+FOF1-ATP+synthase.">The role of subunit &#949; in the catalysis and regulation of FOF1-ATP synthase.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1757, 326-338 (2006).</li><li>Cingolani, G., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+ATP+synthase+catalytic+complex+(F1)+from+Escherichia+coli+in+an+autoinhibited+conformation.">Structure of the ATP synthase catalytic complex (F1) from Escherichia coli in an autoinhibited conformation.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 18, 701-707 (2011).</li><li>Mirsaeidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After+40+years,+new+medicine+for+combating+TB.">After 40 years, new medicine for combating TB.</a> Int. J. Mycobacteriol. 2, 1-2 (2013).</li><li>Shah, N. B., Hutcheon, M. L., Haarer, B. K., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F1-ATPase+of+Escherichia+coli:+The+&#1013;-inhibited+state+forms+after+ATP+hydrolysis,+is+distinct+from+the+ADP-inhibited+state,+and+responds+dynamically+to+catalytic+site+ligands.">F1-ATPase of Escherichia coli: The &#1013;-inhibited state forms after ATP hydrolysis, is distinct from the ADP-inhibited state, and responds dynamically to catalytic site ligands.</a> J. Biol. Chem. 288, 9383-9395 (2013).</li><li>Burgess, T. L., Ross, S. L., Qian, Y. -. x., Brankow, D., Hu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthetic+Processing+of+neu+Differentiation+Factor:+glycosylation,+trafficking,+and+regulated+cleavage+from+the+cell+surface.">Biosynthetic Processing of neu Differentiation Factor: glycosylation, trafficking, and regulated cleavage from the cell surface.</a> J. Biol. Chem. 270, 19188-19196 (1995).</li><li>Loo, T. W., Clarke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Topology+of+a+Cysteine-less+Mutant+of+Human+P-glycoprotein.">Membrane Topology of a Cysteine-less Mutant of Human P-glycoprotein.</a> J. Biol. Chem. 270, 843-848 (1995).</li><li>Tsao, K. -. L., DeBarbieri, B., Michel, H., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+plasmid+expression+vector+for+the+production+of+biotinylated+proteins+by+site-specific,+enzymatic+modification+in+Escherichia+coli.">A versatile plasmid expression vector for the production of biotinylated proteins by site-specific, enzymatic modification in Escherichia coli.</a> Gene. 169, 59-64 (1996).</li><li>Dayne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioLayer+Interferometry+(BLI)+-+How+Does+it+Work?.">BioLayer Interferometry (BLI) - How Does it Work?.</a> Fort&#233;Bio newsletter In Interactions. 5, 8-9 (2012).</li><li>Wartchow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry.">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669-676 (2011).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377, 209-217 (2008).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

מכשירים זמינים כעת עבור BLI לאפשר תפוקה משמעותית וגמישות במבחנים לאינטראקציות biomolecular. דגימות פתרון שונות הם ויתרו בבארות של צלחת microtiter שחורה, ומערכת של חיישני BLI מקבילים מתוכנתות לנוע קדימה ואחורה בין העמודים של בארות על הצלחת. הדגימות הם עוררו על ידי טלטול מסלולית לאורך assay. יש המערכת המשמשת כאן 8 חיישנים ומשתמשת בצלחת דגימת 96 היטב, אבל מערכת אחרת משתמשת 16 חיישנים וצלחת מדגם 384 גם. כך, אינטראקציה בין biomolecule משותק חיישן ושותף המחייב שלה בפתרון, ניתן לבדוק בתנאים שונים עם חיישנים מרובים במקביל. לדוגמא, בassay הראשון שהוצג כאן עם מקטע ε המעכב המשותק, אינטראקציות נמדדו עם שישה ריכוזים שונים של האנזים (שותף מחייב) במקביל (איורים 3 ו -4). זה אפשר ניתוח גלובלי לdetermine זוג אחד של קבועי קצב (k ד יא,) לנטו מחייב ודיסוציאציה, וכך קבוע דיסוציאציה שיווי המשקל (K D = k ד / יא), שמסכים באופן הדוק עם קבוע המעכב (K אני) נקבע מ מבחני פתרון של עיכוב אנזים על ידי ε 8. סוג שני של ניסוי (איור 5) הוכיח כי BLI יכול גם לעקוב אחר השפעות allosteric של ligands הקטן על יחסי הגומלין בין שני חלבונים; ההשפעות של ligands שונה הושוו במקביל. ישנן מגבלות לאיתור תופעות של ligands allosteric, שכן אות BLI תלויה במסה של המולקולה המחייבת, ובאופן ישיר יכולה לזהות מחייב של תרכובות קטנות בתנאים מותאמים 13. עם זאת, בassay של איור 5, שותף המחייב, 1 F, היה גדול ומורכב חלבון (~ 347 KDA), ולכן אות BLI ל/ ניתוק המחייב שלה לא הושפעה באופן משמעותי על ידי מודעהditional מחייב של ligands הקטן כגון ה-ATP (~ 500 דא) למתחם F 1. זו אושרה במבחנים שבי ligands אלה לא השפיע על אות BLI עבור F 1 חייב צורה קטועה של ε חסר CTD המעכב 8. לפיכך, מבחני של אפקטי allosteric חייבים לשקול את המסה של קרוב המשפחה יגנד allosteric להמונים של חלבוני האינטראקציה, ורצוי לכלול בקרות לבדיקת תגובות BLI ישירות על הכריכה של ליגנד. שים לב שצעדים מסוימים ושינויים בפרוטוקול הניסוי יכולים להיות קריטיים להשגת תוצאות וניתוח מדויק יותר יותר טובים. לדוגמא, כמו בפרוטוקול המתואר כאן (ראה צעדים 1.2.3, 1.2.5), assay המיועד לניתוח הגלובלי של מחייב וקבועים שיעור דיסוציאציה צריך לכלול צעד נוסף בסיסי (ראה שלב 1.2.3) בטור חדש בארות חיץ (איור 2, טור 4) לפני שלב האיגוד, והחיישנים צריכים להיות returned לאותה עמודה של בארות חיץ לצעד דיסוציאציה (ראה צעד 1.2.5). לאחר כל חיישן באותו גם (עם אותו התכונות אופטיות) לפני ואחרי צעד האיגוד יכול לשפר את התיקון בין הצעד (צעד 3.4) לצעדי האגודה / דיסוציאציה, וזה מאפשר התאמה הקינטית הגלובלית של עקבות נתונים מרובות (כמו ב איור 4). כמו כן, למבחנים, כי הם יותר מאשר ראשוניים שמוצגים כאן, יש לו את תכנית אופציה לקצר או להאריך את הזמן של כל שלב במהלך assay (בזמן שהוא השלב הפעיל). זה שימושי, למשל, אם אות הטעינה האופטימלית אינה ידועה כבר, או אם הוא זקוק לזמן נוסף כדי לאפשר מספיק דיסוציאציה כדי להשיג בכושר טוב לשיעור דיסוציאציה. לא ספציפי מחייב של השותף מחייב את משטח החיישן יכול להיות בעיה לשיטות ללא תווית כגון SPR וBLI. במבחנים שלנו, זה היה ממוזער ביעילות על ידי ארגון ה-BSA, כולל במאגר assay. כמו בimmunoblotפרוטוקולי טינג, יכולים לשמש חלבונים אחרים מאשר ארגון ה-BSA, וריכוזים נמוכים של חומר ניקוי עשויים גם לצמצם ספציפי מחייב (Tween20 משמש בקינטיקה חיץ מהספק). אפילו עם כריכה ספציפי מינימאלית, רוב מבחני צריכים לכלול חיישן שלט אחד לפחות ללא חלבון משותק, אך עם הריכוז הגבוה ביותר של שותף מחייב בשלב האגודה (ראה איור 3, H חיישן); חיסור של ספציפי שיורי מחייבים (והריקבון שלה במהלך צעד דיסוציאציה) יכול לשפר באופן משמעותי הקינטית מנתח עבור הנלמד מחייב / ניתוק מסוים. מצד השני, ברגע שמבחנים ראשוניים מאשרים כי חלבון biotinylated נשאר כבול ביציבות לאחר שלב הטעינה (ראה איור 3, G חיישן), שליטה שיכולה להיות מושמטת והחיישן שניתן להשתמש בם למצב מדגם. לקביעה חזקה של קבועי עמותה ודיסוציאציה שיעור באמצעות BLI, ריכוזים שונים של bיש להשתמש שותף inding וכל עקבות הנתונים צריכים להיות בכושר על ידי ניתוח הגלובלי, במידת האפשר (כמו באיורים 3 ו -4). באופן אידיאלי, בטווח של ריכוזים צריך לכלול ~ מעל פי 10 ומתחת D K המשוער. במקרה שלנו, עם אינטראקציה גבוהה זיקה (K D = 0.25 ננומטר), רעש אות להיה עני לכריכת קינטיקה עם ריכוזי D תת-K. לכן, ריכוזים של מחייב שותף מעל K D שימשו כך ששינויים משמעותיים בשיעורים ורמות של הכריכה נצפו התקבלו (ראה איור 3). כמו כן, צעד ניתוק ארוך שימש כדי לשפר את הביטחון בהתאמת שיעור הניתוק האיטי. עם אינטראקציות זיקה גבוהות, אפשר גם שניתוק איטי מוגזם על ידי rebinding במהלך שלב הניתוק, שכן מבחני BLI נעשים במדגם עורר ולא זרימה המשיכה על החיישן, כמו עבור SPR. חפץ פוטנציאל זה ניתן לבדוק עם כאומר שבחיץ הניתוק מכיל &#39;כיור&#39; של חלבון התחרותי העודף שנקשר שותף מחייב ניתק ומונע ממנו rebinding לחלבון משותק חיישן 14. במערכת שלנו, זה נעשה על ידי השוואת תוצאות עם ובלי (&gt; פי 10 מעל K D) nonbiotinylated בדיסוציאציה היטב, ואנחנו אישרו rebinding שלא הייתה בעיה משמעותית 8. לבסוף, אם סטים של תוצאות הקינטית לא מתאימים היטב על ידי ניתוח הגלובלי (1:1 או 2:01 דגמים זמינים), יש אפשרויות ניתוח אחרות לפתרון בעיות. לדוגמא, במקום לבחור &quot;גלובל (מלא)&quot; (בשלב 4.2), ניתן לבחור &quot;מקומי&quot; כדי שיתאימו לכל עקבות חיישן באופן עצמאי. אם מחייב כדלקמן מודל פשוט 1:1, זומם שיעורים שנצפו המחייבים (תצפיות k) לעומת הריכוזים של מחייב שותף צריך להראות תלות ליניארית, עם השיפוע שווה מסדר השנייה, השיעור מחייב הפנימי. כרטיסיית ניתוח של התוכנה יש &quot;XY&quot;חלון גרף שמאפשר הדמיה מהירה של מערכת יחסים זו. מגבלה אחת של המכשיר שבו השתמש היא טווח הטמפרטורות זמין. עם טווח של 2 מעלות צלזיוס מעל טמפרטורת סביבה ל40 º C, ניתן להשתמש רק מולקולות שאינן יציבים בטווח זה. יתר על כן, ניתוח תרמודינמי הוא מוגבל על ידי טווח הטמפרטורות הצר. מגבלה נוספת כללית היא שזמן assay המרבי הוא ~ 4 שעות, אחרי זה, חפצים לפתח בשל התאדות של דגימות מצלחת microtiter הפתוחה. BLI כרוך הסדר פשוט יחסית בהשוואה לSPR. החיישנים מועברים בין העמודות של בארות עם כמויות קבועות, ולא זרם בלתי פוסק של מדגם על פני החיישן. למרות שלא רגיש כמו SPR, BLI הוא פחות מושפע משינויים במקדם שביר עקב שינויים בהרכב מדגם. בסך הכל, בקלות יחסית זה של שימוש וגמישות של המכשיר בהסטה בין תנאי assay, BLI לספקsa כלי תכליתי למבחני חוץ גופייה של אינטראקציות biomolecular.

אינטראקציות בין חלבונים חשובות לתהליכים ביולוגיים רבים, ושיטות אופטיות ללא תווית כמו Surface Plasmon תהודה (SPR) היו בשימוש במבחנה ללמוד קינטיקה של מחייב ודיסוציאציה 1. רוב השיטות ללא תווית לשתק biomolecule אחד על משטח חיישן ולהשתמש אות אופטי לאיתור שותף מחייב מפתרון כפי שהוא מקשר עם biomolecule המשותק 1. בעוד SPR הוא שיטה רגישה מאוד, הוא נוטה להפרעות כתוצאה משינויים במדד השבירה של הפתרון זורם על החיישן 2. למרות שלא רגיש כמו SPR, Bio-שכבת Interferometry (BLI) הוא פחות מושפע משינויים בהרכב מדגם 1,3. BLI משתמש biosensors סיבים האופטיים שיש להם ציפוי ביולוגית קניינית בקצה. המערכת משמשת כאן (שמינייה-RED96) מכילה שמונה הספקטרופוטומטרים. אור לבן מוזרם לשורה של בדיקות שתעבורנה על זרוע רובוטית. חיישנים אופטיים סיבי arדואר נאסף על ידי החלליות ועבר לצלחת 96 היטב המכילה דגימות. אחת ממולקולות המטרה הוא משותק על פני השטח biosensor. אז חיישנים מועברים לבארות המכילות שותף המחייב בתמיסה. BLI עוקב אחר קשר של השותף מחייב עם המולקולה המשותקת, ולאחר מכן עוקב אחר ניתוק לאחר שעבר את החיישנים לפתרון ללא שותף המחייב. הכריכה של מולקולות על פני השטח biosensor מובילה לשינויים בהפרעות אופטיות בין גלי אור המשקפים חזרה להספקטרופוטומטרים ממשטח פנימי ומתוך הממשק החיצוני בין החיישן ופתרון. שינויים אלה בהתערבות ניתן לכמת ומשמשים לקביעת שיעורים הקינטית של כריכה, דיסוציאציה, כפי שסוכם באנימציה של איור 1. יש לנו ליישם BLI למדוד אינטראקציות בין המתחם הקטליטית של ה-ATP synthase חיידקים ומקטע ε שלה, אשר יכול אוטומטית מעכב את האנזים. סאי ה-ATPnthase הוא nanomotor סיבובי מוטבע קרום שמזרז סינתזה והידרוליזה של 4-ATP. קומפלקס קטליטי (F 1) יכול להיות מבודד בצורה מסיסה שעובדת כATPase. יש ε המקטע שני תחומים: תחום N-המסוף (NTD) הוא דרוש להרכבה נכונה וצימוד תפקודי של האנזים, אך לא במגע ישיר עם יחידות משנה קטליטי; תחום בטרמינל C-(CTD) יכול לעכב את האנזים על ידי אינטראקציה עם יחידות משנה קטליטי מספר 5,6. רגולציה בתיווך ε זה היא ספציפית לsynthases ה-ATP בקטריאלי ואינו נצפתה בhomologue המיטוכונדריה. ה-ATP synthase התפתחה כמטרה לתרופות אנטיבקטריאליות, כפי שמוצג על ידי אישור ה-FDA לאחרונה bedaquiline לטיפול שבחפת עמידה לתרופות 7. לכן, מיקוד התפקיד המעכב של ε לגילוי סמים יכולים להניב antibacterials שלא לעכב את ה-ATP synthase המיטוכונדריה. עם המתחם המבודד קטליטי (F 1), εהופך למקטע קשור זה. עם זאת, עם ε חייב 1 F, εCTD יכול לעבור שינוי קונפורמציה דרמטי, החדרה באופן חלקי לתוך החלל המרכזי של האנזים ולהרכיב מדינה מעכבת שלא סביר לנתק ישירות 6,8. אנו משתמשים BLI למדוד קינטיקה של F 1 / ε מחייב ודיסוציאציה, ובעקיפין, על מנת לבחון אפקטי allosteric של קטליטי אתר ligands על קונפורמציה של ε. במערכת שלנו, ε נבחר לקיבוע על משטח החיישן מאז אות BLI (כמו SPR) הוא רגיש למסה של המולקולות מחייבות על פני השטח. מקטע ε הוא (~ 15 KDA) קטן יחסית למתחם העיקרי F 1 (~ 347 KDA). לפיכך, אות BLI גדולה יותר תגרום מכריכה של 1 F לε המשותק. על מנת לפקח דיסוציאציה F 1, אשר יכול להיות מאוד איטי, ε חייב להיות חזק משותק. לכן בחרנו biotinylate; ולשתק אותו על biosensors streptavidin מצופה. ניתן biotinylated חלבונים על ידי שינוי (i) אקראי של lysines פני השטח 9, (ii) תגובה של ציסטאין ילידים מהונדס או ייחודי עם מגיב ביוטין-maleimide 10 או (iii) גנטי הוספת הפפטיד יוטין-acceptor ספציפי שbiotinylated אנזימים במהלך בביטוי vivo של החלבון מתויג 11. במערכת שלנו, ε הוא biotinylated באמצעות שיטה (iii) 8. ברגע שε-מתויג ביוטין הוא משותק על חיישני streptavidin, BLI יכול למדוד את הכריכה וניתוק של 1 F כי כבר מדולדל של ε למקטע (F 1 (-ε)). לניסויים שתוארו כאן, מבחני ראשוניים שנעשו כדי לקבוע כמויות סבירות של חלבון biotinylated כדי לשתק בחיישנים. זה יכול להשתנות, בהתאם למשקל המולקולרי של החלבון ושותף המחייב שלה, אבל המטרה היא לקבוע כמות מזערית של חלבון לא משותקיםכובע מספק (i) מקובל אות לרעש לכריכת קינטיקה עם ריכוז נמוך של שותף המחייב (להלן K D) וכן (ii) עיוות מינימאלית של כריכת קינטיקה עם ריכוז להרוות-קרוב של שותף המחייב. כמו כן, הרכב של biotinylation עשוי להשתנות (אך להימנע&gt; ביוטין / חלבון mol mol 1), ולכן חלק assay הראשוני עשוי להיות נחוץ לכל מנה חדשה של חלבון biotinylated כדי לאשר שאות BLI עקבית יכולה להיות מושגת בחוסר התנועה בstreptavidin מצופה חיישנים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Octet-RED96</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">30-5048</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A6003-10G</td>
			<td>Fatty Acid free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biosensor/Streptavidin</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">18-5019</td>
			<td>Tray of 96 sensors</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">655209</td>
			<td>Black, Polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Acquisition software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Analysis software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects

אנו מתארים את השימוש בInterferometry Bio-השכבה ללמוד אינטראקציות מעכבות של ε למקטע עם מורכב הקטליטית של ה-ATP synthase Escherichia coli. ה-ATP synthase F-סוג חיידקים הוא היעד של אנטיביוטיקה חדשה, שאושרה על ידי ה-FDA כדי להילחם שבחפת עמידה לתרופות. הבנת חיידקים ספציפיים אוטומטי עיכוב של ה-ATP synthase ידי תחום בטרמינל C-של ε למקטע יכול לספק אמצעי חדש כדי למקד את האנזים לגילוי של תרופות אנטי בקטריאליים. תחום בטרמינל C-של ε עובר שינוי קונפורמציה דרמטי כאשר מעברי האנזים בין המדינות פעילות ולא פעילים, וligands קטליטי האתר יכולים להשפיע על איזה מהתצורות של ε הוא דומיננטי. צעדי assay קינטיקה של מחייב / הניתוק של ε עם מורכב קטליטי, ובעקיפין מאהsures המשמרת של ε בכריכת האנזים ומקונפורמציה המעכבת nondissociable כנראה. אות Interferometry Bio-השכבה אינה רגישה יתר על המידה להרכב פתרון, כך גם ניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר השפעות allosteric של ligands קטליטי האתר על שינויי קונפורמציה של ε.

זמן אמת מחייב וקינטיקה BLI הניתוק מוצגות באיור 3. ניסוי זה נעשה עם חיץ assay בעמותה ודיסוציאציה. ניסוי זה החל בצעד בסיסי 10 דקות מאז החיישנים היו prewet רק לזמן קצר. בשלב בא, ε biotinylated הועמס על החיישנים. אין ניתוק לגילוי של ε התרחש לאורך כל השלבים הנותרים כפי שניתן לראות מעקומת ההתייחסות (G) שלא הייתה לו שותף מחייב הוסיף. חיישן התייחסות שני (H) היה נטול חלבון משותק והראה ספציפי מחייב נמוך של שותף המחייב. ריכוזים שונים של F 1 (-ε) שימשו בשלב העמותה לחיישנים AF על מנת להתאים את התוצאות בעולם ולקבל את הערכים הטובים ביותר עבור k, ד יא, ו-K D. תוצאות עובדו כמו בפרוטוקול, מניב עקבות נתונים (הכחול) באיור 4. במקרה זה, H עקבות חיישן ההתייחסות הופחת מTR המדגםאסים כדי לתקן ספציפי מחייב של סחיפת השותף ואות המערכת המחייבת. בשלב ניתוח הנתונים, את כל העקומות היו בעולם כושר עם מודל 1:1 (אחד יא, ד יא היחיד); &quot;גלובל (מלא)&quot; בכושר מניח ניתוק של שותף המחייב שלם (אות תחזור לאפס באינסוף זמן) (איור 4, אדום). שימו לב, לשני הריכוזים הגבוהים ביותר של F 1 (-ε), יש סטיות קטנות אך משמעותיות של נתונים מהמודל הגלובלי, 1:1. רמות נמוכה של ליגנד המשותק (למקטע &quot;ε&quot; biotinylated) שימשו, והכושר לא השתפר על ידי הכללת גורם המוני תחבורה במודל (לא מוצג). עם זאת, F 1 (- &quot;ε&quot;) הוא מורכב (~ 350 KDA) גדול, וניסויים אחרים (לא מוצגים) מראים כי סטיות אלה בשל נגישות מחייבת מופחתת של שבריר של ליגנד המשותק, כלומר 1 F חייב &quot;Ε&quot; אפשר sterically לעכב גישה לbiotinylated אחר&quot;Ε&quot; מחויב באותו tetramer streptavidin. איור 5 מראה ניסוי שונה בהם את האנזים היה קשור לחיישן משותק ε בנוכחות 1 מ&quot;מ ATP / EDTA, זה לתשומת ביותר F 1 מתחמים &quot;ε&quot; / להניח קונפורמציה noninhibitory, אשר מנתק בקלות 8. חיישנים אז הועברו לניתוק בארות המכילות חיץ assay עם ligands שונה. זה מדגים את ההשפעות של ligands שונה בקונפורמציה של ε. לדוגמא, חשיפה לMgADP / פיי האטה דרמטית דיסוציאציה נטו, המציין כי ε עבר קונפורמציה למדינה בחוזקה-הכפות, מעכבות. קינטיקה דיסוציאציה מורכבת נצפתה מאז ligands שונה הנגרם על משמרות שונות בכל החלק של 1 F. מתחמי ε עם ε בתצורות הפעילים (קשורות זה) או מעכבות (nondissociable). ייתכן גם ששינויי קונפורמציה משמעותיים של חלבונים קשוריםלתרום ישירות לשינויים באות BLI אבל, במחקרים שלנו, זה נראה זניח בהשוואה לאות לכריכה / ניתוק של המתחם F 1 הגדול (ראה שאה ואח&#39; 8, איור 5D;. מעבר לעקומות 3 ו 6 תכנית התנהגות דומה מאוד, אם כי התנאים שלהם לטובת תצורות שונות של F כבול 1). תוכנת ניתוח נתונים שאינה מיועדת לקינטיקה דיסוציאציה מורכבת כאלה. לפיכך, אנו לייצא את הנתונים לקבצי טקסט לניתוח רגרסיה ליניארית עם תוכנות אחרות. <a alt="Figure 1" href="/files/ftp_upload/51383/Fig1.mov">איור 1.</a> עקרונות Interferometry Bio-השכבה. אנימציה מסכמת את הפיזיקה שבבסיס לאיתור האינטראקציה biomolecular ידי BLI. אור עובר דרך הבדיקות באו לידי ביטוי בחזרה להספקטרופוטומטרים (i) מהמשטח הפנימי של החיישן וכן (ii) מהחיצוני בterface של החיישן עם הפתרון לדוגמא. התוצאה בתבנית התאבכות. כריכה של מולקולות על פני השטח החיישן משנה את תבנית ההתאבכות. ניתן להתוות כמשמרת ננומטר של עוצמה היחסית לעומת אורך גל. ניטור משמרת ננומטר זה לאורך הזמן מספק קינטיקה מחייבת ודיסוציאציה. גרפיקה מותאמת באישור 12 FortéBio. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51383/51383fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51383/51383fig2.jpg" /> איור 2. הסדר סכמטי של דגימות בצלחת דגימת 96 היטב. החיישנים יועברו במקביל מעמודה לעמודה וניתן להעביר או שמאלה או ימינה כפי שהוגדרו בפרוטוקול assay מסוים. ולס עם צבע אפור מייצג חיץ assay ואילו אדום, כחול וירוק מייצג חלבון משותק, מחייב השותף וligands, בהתאמה. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51383/51383fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51383/51383fig3.jpg" /> איור 3. לכידת מסך המציגה נתונים גולמיים מassay BLI. קווים אדומים אנכיים מצביעות על תנועה של חיישנים בין שלבי assay של הפרוטוקול. סוגי שלב מסומנים בתמונה. מיקומים של חיץ ודגימות כפי שמוצגים באיור 2. כפי שצוין על ידי מספרים לאורך החלק העליון של הגרף, חיישני streptavidin מצופה הועברו בין עמודות השונות של צלחת המדגם לפי הסדר הבא: 123,454. האגדה מתחת לגרף מציינת את הצבע לעקבות נתונים של כל חיישן. בשלב הטעינה, כל חיישן למעט H הודגר עם 50 ננומטר למקטע &quot;ε&quot; biotinylated. בצעד האיגוד, חיישנים הודגרו עם ריכוזי ננומטר של מדולדל F &quot;ε&quot; 1: 30 (, H), 20 (, 15 (C), 10 (ד &#39;), 5 (ה), 2.5 (F) B), 0 ננומטר (G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51383/51383fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51383/51383fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51383/51383fig4.jpg" /> איור 4. לכידת מסך של הנתונים נותחו מassay BLI של איור 3. הנתונים הייתה מעובד ומצויד כפי שמתוארת בטקסט. רק צעדי איגוד ודיסוציאציה מוצגים, מחולקים על ידי קו אדום אנכי. עקומות העיבודים הן כחולות; רגרסיה ליניארית מתאימה מ1:01 ניתוח הגלובלי מוצגות באדום. תוצאות הולמת גלובל 8: k = 2 x 10 5 מ -1 s -1 (± 0.1%), ד k = 4.8 x 10 -5 s -1 (&quot;±&quot; 0.1%), מניב K D = 0.24 ננומטר. טיב ההתאמה: R2 = .999054. הפרמטר המקסימאלי המחייב (מקסימום R) היה בכושר בנפרד לכל חיישן, עם ערך ממוצע = 0.813 ננומטר (&quot;±&quot; .0803). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51383/51383fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51383/51383fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51383/51383fig5.jpg" /> איור 5. תוצאות מassay BLI שהראה השפעות allosteric של ligands בקונפורמציה של ε. F 1 (-ε) היה קשור לחיישן משותק ε בנוכחות 1 מ&quot;מ ATP / EDTA. סיום שלב ההתאגדות וחלק של שלב הניתוק מוצג. במהלך שלב דיסוציאציה, ligands הברור עבור F 1 אתרי קטליטי (רשומים לכל זכר) נכללו להתבונן השפעות allosteric על ניתוק של 1 F </תת&gt; מε מאוגד חיישן.

Watch this Scientific Journal Video about Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects at JoVE.com

Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

הפרוטוקולים כאן לתאר מבחני הקינטית של חלבונים אינטראקציות עם Interferometry Bio-השכבה. ה-ATP synthase F-הסוג, שהוא מעורב בחילוף חומרים של אנרגיה בתאים, יכול להיות מעוכב על ידי מקטע ε בחיידקים. יש לנו להתאים Interferometry Bio-שכבה כדי לחקור אינטראקציות של קומפלקס קטליטי עם התחום בטרמינל C-המעכב של ε.

Interferometry Bio-שכבה למדידת קינטיקה של חלבונים אינטראקציות והשפעות יגנד allosteric

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

bio-layer-interferometry-for-measuring-kinetics-protein-protein

Google

Research

JoVE Journal

Chemistry

28.8K Views.  SUNY Upstate Medical University.  הפרוטוקולים כאן לתאר מבחני הקינטית של חלבונים אינטראקציות עם Interferometry Bio-השכבה. ה-ATP synthase F-הסוג, שהוא מעורב בחילוף חומרים של אנרגיה בתאים, יכול להיות מעוכב על ידי מקטע ε בחיידקים. יש לנו להתאים Interferometry Bio-שכבה כד...

Video: Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal fermentation processes and screening for new oil-rich strains requires a fast and reliable protocol for determination of intracellular lipid content. Current practices rely largely on gravimetric methods to determine oil content, techniques developed decades ago that are time consuming and require large sample volumes. In this paper, Nile Red, a fluorescent dye that has been used to identify the presence of lipid bodies in numerous types of organisms, is incorporated into a simple, fast, and reliable protocol for measuring the neutral lipid content of Auxenochlorella protothecoides, a green alga. The method uses ethanol, a relatively mild solvent, to permeabilize the cell membrane before staining and a 96 well micro-plate to increase sample capacity during fluorescence intensity measurements. It has been designed with the specific application of monitoring bioprocess performance. Previously dried samples or live samples from a growing culture can be used in the assay.

A simple protocol to determine the neutral lipid content of algal cells using a Nile Red staining procedure is described. This time-saving technique offers an alternative to traditional gravimetric-based lipid quantification protocols. It has been designed for the specific application of monitoring bioprocess performance.

פשוט ומהיר פרוטוקול למדידת שומנים ניטרלי בתאי אצות באמצעות הקרינה

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

בחינה כמותית ואיכותי של אינטראקציות חלקיקי חלקיקים באמצעות קולואיד Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.

The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.

מבוסס ELISA כריכה ותחרות שיטה במהירות לקבוע אינטראקציות ליגנד לרצפטור

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and ...

Synthesis of Ligand-free CdS Nanoparticles within a Sulfur Copolymer Matrix

Aliphatic ligands are typically used during the synthesis of nanoparticles to help mediate their growth in addition to operating as high-temperature solvents. These coordinating ligands help solubilize and stabilize the nanoparticles while in solution, and can influence the resulting size and reactivity of the nanoparticles during their formation. Despite the ubiquity of using ligands during synthesis, the presence of aliphatic ligands on the nanoparticle surface can result in a number of problems during the end use of the nanoparticles, necessitating further ligand stripping or ligand exchange procedures. We have developed a way to synthesize cadmium sulfide (CdS) nanoparticles using a unique sulfur copolymer. This sulfur copolymer is primarily composed of elemental sulfur, which is a cheap and abundant material. The sulfur copolymer has the advantages of operating both as a high temperature solvent and as a sulfur source, which can react with a cadmium precursor during nanoparticle synthesis, resulting in the generation of ligand free CdS. During the reaction, only some of the copolymer is consumed to produce CdS, while the rest remains in the polymeric state, thereby producing a nanocomposite material. Once the reaction is finished, the copolymer stabilizes the nanoparticles within a solid polymeric matrix. The copolymer can then be removed before the nanoparticles are used, which produces nanoparticles that do not have organic coordinating ligands. This nascent synthesis technique presents a method to produce metal-sulfide nanoparticles for a wide variety of applications where the presence of organic ligands is not desired.

Herein we present a method to synthesize ligand-free cadmium sulfide (CdS) nanoparticles based on a unique sulfur copolymer. The sulfur copolymer operates as a high temperature solvent and a sulfur source during the nanoparticle synthesis and stabilizes the nanoparticles after the reaction.

סינתזה של חלקיקים CDS-חינם ליגנד בתוך מטריקס קופולימר גופרית

Aliphatic ligands are typically used during the synthesis of nanoparticles to help mediate their growth in addition to operating as high-temperature ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.

This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.

תיוג ספין בימוי אתר ולימודי ספקטרוסקופיות EPR של pentameric ליגנד מגודרת יון ערוצים

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Sulfate Separation by Selective Crystallization with a Bis-iminoguanidinium Ligand

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, 1,4-benzene-bis(iminoguanidinium) (BBIG), is demonstrated. The ligand is synthesized as the chloride salt (BBIG-Cl) by in situ imine condensation of terephthalaldehyde with aminoguanidinium chloride in water, followed by crystallization as the sulfate salt (BBIG-SO4). Alternatively, BBIG-Cl is synthesized ex situ in larger scale from ethanol. The sulfate separation ability of the BBIG ligand is demonstrated by selective and quantitative crystallization of sulfate from seawater. The ligand can be recycled by neutralization of BBIG-SO4 with aqueous NaOH and crystallization of the neutral bis-iminoguanidine, which can be converted back into BBIG-Cl with aqueous HCl and reused in another separation cycle. Finally, 35S-labeled sulfate and &#946; liquid scintillation counting are employed for monitoring the sulfate concentration in solution. Overall, this protocol will instruct the user in the necessary skills to synthesize a ligand, employ it in the selective crystallization of sulfate from aqueous solutions, and quantify the separation efficiency.

A protocol for in situ aqueous synthesis of a bis(iminoguanidinium) ligand and its utilization in selective separation of sulfate is presented.

ההפרדה סולפט ידי סלקטיבי התגבשות עם ליגנד Bis-iminoguanidinium

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

תובנה לתוך האינטראקציות של חומצות אמינו פפטידים עם חומרים אורגניים באמצעות ספקטרוסקופיית חיל מולקולה בודדת

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Accessing Valuable Ligand Supports for Transition Metals: A Modified, Intermediate Scale Preparation of 1,2,3,4,5-Pentamethylcyclopentadiene

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that derive from initial 2-bromo-2-butene lithiation followed by acid mediated dienol cyclization. The revised synthesis and purification of the ligand avoids the use of mechanical stirring while still permitting access to significant quantities (39 g) of Cp*H in good yield (58%). The procedure offers other additional benefits, including a more controlled quench of excess lithium during the production of the intermediate heptadienols and a simplified isolation of Cp*H of sufficient purity for metallation with transition metals. The ligand was subsequently used to synthesize [Cp*MCl2]2 complexes of both iridium and ruthenium to demonstrate the utility of the Cp*H prepared and purified by our method. The procedure outlined herein affords substantial quantities of a ubiquitous ancillary ligand support used in organometallic chemistry while minimizing the need for specialized laboratory equipment, thus providing a simpler and more accessible entry point into the chemistry of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene.

Reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented. The revised protocol for the synthesis and purification of the ligand minimizes the need for specialized laboratory equipment while simplifying reaction workups and product purification. Use of Cp*H in the synthesis of [Cp*MCl2]2 complexes (M = Ru, Ir) is also described.

גישה וליובל ליגנד עומדי מתכות מעבר: הכנת סולם שונה, ביניים של 1,2,3,4,5-Pentamethylcyclopentadiene

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution of capping ligands during the synthesis reaction, their role in regulating the nucleation and growth rates of colloidal nanoparticles is not well understood. In this work, we demonstrate a mechanistic investigation of the role of trioctylphosphine (TOP) in Pd nanoparticles in different solvents (toluene and pyridine) using in situ SAXS and ligand-based kinetic modeling. Our results under different synthetic conditions reveal the overlap of nucleation and growth of Pd nanoparticles during the reaction, which contradicts the LaMer-type nucleation and growth model. The model accounts for the kinetics of Pd-TOP binding for both, the precursor and the particle surface, which is essential to capture the size evolution as well as the concentration of particles in situ. In addition, we illustrate the predictive power of our ligand-based model through designing the synthetic conditions to obtain nanoparticles with desired sizes. The proposed methodology can be applied to other synthesis systems and therefore serves as an effective strategy for predictive synthesis of colloidal nanoparticles.

The main goal of this work is to elucidate the role of capping agents in regulating the size of palladium nanoparticles by combining in situ small angle x-ray scattering (SAXS) and ligand-based kinetic modeling.

התגרענות בתיווך ליגנד והצמיחה של חלקיקי מתכת פלדיום

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.