We thank Alberto Reinders for his work in optimizing the CCMS conditions for P. aeruginosa. We also thank Pablo Manfredifor the annotation of the P. aeruginosa proteins. This work was supported by the Swiss National Science Foundation (SNF) Sinergia grant CRSII3_127433.

1. הכנת lysate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול P. תאי aeruginosa בLB לOD הרצוי. הערה: לקבלת הדרכה: להשתמש ≈ 100 מיליליטר תרבות / מדגם לתרבויות שלב נייחים ו -500 ≈ cultur מיליליטר / מדגם לתרבויות שלב יומן (600nm OD = 0.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה ידי צנטריפוגה למשך 20 דקות ב 5000 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ז Resuspend 0.5-1 של גלולה במאגר תמוגה 1 מיליליטר (6.7 מ&quot;מ MES, 6.7 מ&quot;מ HEPES, 200 מ&quot;מ NaCl, 6.7 מ&quot;מ כץ, 1 DDT מ&quot;מ, pH 7.5) ולהוסיף מעכבי פרוטאז (מיני מלא, ללא EDTA) וכן כDNaseI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse את התאים על ידי 3 מעברים דרך תא לחץ צרפתי, ב -20,000 psi (ראה חומרי רשימה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultra-צנטריפוגה lysate התא בg x 100,000 עבור שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את supernatant (עבור לשלב 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הכדור עם 1 מיליליטר 1x חיץ תמוגה על ידי pipetting מעלה ומטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultracentrifuge בg x 100,000 עבור שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Flash-להקפיא את גלולה בחנקן נוזלי ולאחסן ב -20 ° C עד משמשים ללכידתו של חלבונים בממברנה (ראה שלב 3). </li></ol> 2. ההסרה של נוקלאוטידים חינם ג-di-GMP ואחרים (שבר מסיס בלבד) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף טור desalting PD10 (חומרים לראות רשימה) עם 10 מיליליטר של חיץ תמוגה הקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את supernatant (≈ 1 מיליליטר) על PD10 על מנת להסיר נוקלאוטידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute עם 4 מיליליטר חיץ תמוגה הקרה (500 צעדי μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את השברים מרוכזים ביותר, כפי שנקבע על ידי assay ברדפורד, וברכתם. </li></ol> 3. גלולה Resuspension וsolubilization (שבר ממברנה בלבד) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב500 עד 1,000 μl של חיץ לכידת 1x (ללא חומר ניקוי) (ראה טבלה 1). הערה: גלולה קשה resuspend. מומלץ פיפטה עד ראשונה ומטה עם טפטפת לכ resuspend גלולה, אז להשתמש במזרק 27 G לhomogenize הפתרון טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1% (w / v) n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 4 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות (או O / N) על גלגל מסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultracentrifuge בg x 100,000 עבור שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר supernatant. </li></ol> מדידת ריכוז חלבון 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את ריכוז החלבון על ידי assay ברדפורד (על ידי assay BCA לשבריר הקרום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ריכוז החלבון הכולל עד 10 מ&quot;ג / מיליליטר. </li></ol> 5. לכידה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 300 מיקרוגרם של חלבון עם 1 מ&quot;מ מהתמ&quot;ג, GTP, ATP, CTP, ו -20 μl של חיץ לכידת 5x (100 מ&quot;מ HEPES, 250 מ&quot;מ כץ, 50 מ&quot;מ MgAc, גליצרול 5%, pH 7.5) (טבלת 1). התאם את נפח התגובה ל -100 μl עם H 2 O. הערה: הנפח הכולל כולל את הנפח של CDG-CC וג-di-GMP במקרה של שליטת התחרות (ראה שלב 5.3 וטבלה 2). הערה: כל הניסויים בוצעו בשנת 200 ורצועות l 12-צינור PCR (Thermo Scientific); # 181. הערה: לשבריר הקרום, לוודא תמיד לשמור על ריכוז DDM מעל ריכוז micelle הקריטי (0.01% w / v) עד שלב solubilization החלבון ב 8 M אוריאה (שלב 7.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על גלגל מסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיקרומטר CDG-CC (ריכוז סופי). הערה: כוללת שליטה ללא CDG-CC (המכונה בשם &quot;שליטת חרוז&quot;), ושליטה בתוספת 1 ​​מ&quot;מ ג-di-GMP (&quot;שליטת תחרות&quot;) (ראה טבלה 2). הערה: ריכוז CDG-CC יכול להיות מותאם 1-10 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 4 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות (O / N לשבריר הקרום) על גלגל מסתובב, בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סיבוב קצר, קישור צולב על ידי הפעלה של מחצית התגובה של CDG-CC עם אור UV למשך 4 דקות, באמצעות CaproBox (ראה חומרי רשימה, λ = 310 nm, irradiance ≥10 mW / cm², מרחק מהמקור = 2 סנטימטר). הערה: להסיר את המכסה של הרצועות cross-linking לפני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μl 5x חיץ לשטוף (5 M NaCl, 250 מ&quot;מ טריס, pH 7.5) ו -50 μl של חרוזים מגנטיים streptavidin גם מושעים, בעדינות homogenize. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 על גלגל מסתובב. </li></ol> 6. שלבי כביסה הערה: (מגנט: ראה חומרי רשימה). התחל עם לכידתו של חרוזים המגנטיים במכסה רצועת PCR, עם המגנט. לאחר מכן להחליף את רצועת PCR על ידי אחד חדש המכיל את פתרון הכביסה הבא. הסר את המגנט וresuspend את החרוזים, דגירה 2 דקות. ספין למטה ולהחליף את המכסה על ידי מכסה טרי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעדי כביסה (חלק מסיס בלבד) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 6 פעמים ב 200 חיץ הכביסה μl 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעם אחת בכיתת ח HPLC 200 μl 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 6 פעמים ב 200 אצטוניטריל 80% μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2 פעמים בH הכיתה HPLC 200 μl 2 O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעדי כביסה (membraחלק ne בלבד) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 5 פעמים ב 200 חיץ הכביסה 1x μl DDM + 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2 פעמים ב 200 חיץ הכביסה 1x μl DDM + 0.05%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי פעם ב -200 כביסה חיץ 1x μl DDM + 0.025%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי פעם ב -200 כביסה חיץ 1x μl DDM + .0125%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים ב200 μl 100 מ&quot;מ ABC (אמוניום ביקרבונט, NH 4 CO 3) + 2 M אוריאה. </li></ol></li></ol> 7. הכנת מדגם MS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend חרוזים (ישירות במכסה) ב -20 μl 100 מ&quot;מ ABC (100 מ&quot;מ ABC + 8 M אוריאה לשבריר הקרום) ולהעביר לתוך צינורות 1.5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלק קרום רק: לדגור על 60 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, רועד ב 500 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 μl 200 מ&quot;מ TCEP (טריס (2-carboxyethyl) phosphine) ולדגור על 60 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, רועד ב 500 סל&quot;ד. להתקרר עד 25 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 μl של מוכנים טרי 400 מ&quot;מ iodoacetamide ולדגור על 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, רועדt 500 סל&quot;ד ובחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 μl 0.5 -acetyl-ציסטאין M N ולדגור על 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, רועד ב500 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלק קרום רק: להוסיף μl 1 ליס-C ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיקרוגרם טריפסין ודגירת O / N ב 37 מעלות צלזיוס, רועדת ב 500 סל&quot;ד (לעטוף בParafilm כדי למנוע התייבשות). הערה: ניתן לאחסן הדגימות ב -20 ° C בשלב זה. הערה: חלק קרום רק: להוסיף 100 מ&quot;מ ABC כדי להתאים את ריכוז האוריאה ל&lt; 2 M לפני תוספת של טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה ספין למטה הצינורות ולאסוף החרוזים עם המגנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את supernatant לתוך צינור 1.5 מיליליטר חדש (חזור על שלב זה אם חרוזים הם עזבו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl 5% TFA (חומצת trifluoroacetic) + 1 μl 2 M HCl (15 μl 5% TFA + 5 μl 2 M HCl לשבריר הקרום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמודות המצב C18 MicroSpin (קבוצת קן, מסצ&#39;וסטס, ארה&quot;ב) 150 עם μl אצטוניטריל (ספין 20 שניות ב2,400 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוהlibrate עמודות C18 2 פעמים 150 עם μl 0.1% TFA (ספין 20 שניות, 2,400 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מדגם ספין 2 דקות, 2,000 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רענן הזרימה דרך על הטור ולחזור על שלב ספינינג (2 דקות, 2,000 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים 150 עם μl 0.1% TFA, 5 אצטוניטריל% (20 שניות, 2,400 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח צינור חדש וelute פעמיים עם 150 0.1% TFA μl, אצטוניטריל 50% (2 דקות, 2,000 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את פפטידים במהירות-VAC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב -40 μl 98% 2 O, אצטוניטריל 2%, 0.15% חומצה פורמית H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 שניות Sonicate (מחזור דופק 0.5, 100% משרעת; ראה חומרי רשימה) וספין למטה 5 שניות, 12,000 סל&quot;ד (צנטריפוגות benchtop). מערבולת 10 שניות, וספין למטה 5 שניות, 12,000 סל&quot;ד. העבר בבקבוקון HPLC לניתוח LC-MS / MS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא ב -20 ° C. הערה: ניתן לאחסן הדגימות ב -20 ° C בשלב זה. </li></ol> 8. LC-MS / MS ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> equipp לרוץ ננו-LC (מערכות ננו-LC)ed עם טור RP-HPLC (75 מיקרומטר x 37 סנטימטרים) ארוז עם שרף C18 (Magic C18 AQ 3 מיקרומטר) באמצעות שיפוע ליניארית מ -95% (0.15% חומצה פורמית, אצטוניטריל 2%) ממס ו -5% B ממס ( אצטוניטריל 98%, 0.15% חומצה פורמית) עד 35% B ממס על 60 דקות בקצב זרימה של 0.2 μl / min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את פפטידים באמצעות LC-MS / MS (ספקטרומטר מסת לחץ כפול LTQ-Orbitrap ולוס, מחובר למקור יון electrospray). הערה: מצב רכישת נתונים הוקם כדי להשיג רזולוציה גבוהה אחד MS לסרוק בחלק FT של ספקטרומטר המסה ברזולוציה של 60,000 FWHM אחריו סריקות MS / MS במלכודת היון ליניארי של 20 יונים אינטנסיביים ביותר. כדי להגביר את היעילות של ניסיונות MS / MS, מודוס הקרנת המדינה הטעון התאפשר להוציא שלא הוקצה וביחידים גובה יונים. ניתוק מושרה קנוניה היה מופעל כאשר המבשר עלה 100 ספירת יון. משך ההדרה הדינמי נקבע ל -30 שניות. זמן הצטברות היון נקבע ל -300 אלפיות שניים (MS) ו -50msec (MS / MS). </li></ol> חיפוש 9. Database <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד את P. aeruginosa צמח השדה-מסד נתונים באמצעות דף הבית של צמח השדה <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/">(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיר את ספקטרום MS הגלם לתוך קבצים גנריים קמע (MGF) באמצעות כלי MassMatrix ההמרה <a href="http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py">(http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py).</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חפש קובץ MGF זה באמצעות גרסת 2.3 קמע נגד פ aeruginosa צמח השדה-מסד נתונים המכילים קדימה וערכי חלבון הפוך דמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בעיכול טריפסין סיליקון ואחרי ליזין וארגינין (אלא אם כן אחריו פרולין) לסבול שתי החמיצו שסעים בפפטידים tryptic באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הפרמטרים חיפוש באתר על מנת לאפשר methionines המושחר (15.99491 Da) כשינויים וcarboxyamidomethylation (57.021464 Da) של שאריות ציסטאין כשינוי קבוע משתנים. לקמע חיפושינוing סריקות ברזולוציה גבוהה, להגדיר את הסובלנות ההמונית מבשר על 15 עמודים לדקה ולהגדיר את הסובלנות ההמונית הבר 0.6 Da. לבסוף, קבע את החלבון FDR עד 1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבא את חיפושי הקמע של פ ניסויי aeruginosa CCMS לפיגום (Proteomesoftware, גרסה 3), להגדיר את הפרמטרים להשגה קרוב FDR חלבון ל -1%, ולחלץ כוללת ספירת הרפאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת תוצאות הנציג שהוצגו במאמר זה, השתמשנו במבחן T לזווג להשוות את הניסוי עם שליטת התחרות, ונחשבו ללהיטים עם ערך p להלן 0.1, ויחס ספירת רפאים מעל 2 (להתנסות ספירת רפאים / רפאים שליטת תחרות רק ספירה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנתונים ניתן לייצא בכל תוכנת גיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף. </li></ol> 10. כימות ללא תווית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבא את הקבצים הגולמיים לתוכנת Progenesis LC-MS (קוי Dynamics, גרסת 4.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע יישור LC-MS וזיהוי תכונה בsetti ברירת המחדלמהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הנתונים בפורמט MGF מProgenesis LC-MS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חפש את ספקטרום MS / MS באמצעות הקמע נגד פ צמח השדה מסד נתוני aeruginosa מכילים קדימה וערכי חלבון הפוך דמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבא את תוצאות החיפוש באתר לProgenesis LC-MS ולמפות את הזדהויות פפטידים לתכונות MS1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להערכת נתונים (חישוב רמות משמעות, יחסים לקפל-שינוי) את תסריט ProteinSQAnalysis של SafeQuant שימש (סף: ערך q להלן 0.1, יחס ספירת רפאים מעל 2). </li></ol>

<ol>
	<li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins.">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).</li><li>Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+c-di-GMP+signalling+in+bacteria.">Principles of c-di-GMP signalling in bacteria.</a> Nature reviews. Microbiology. 7, 263-273 (2009).</li><li>Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=You've+come+a+long+way:+c-di-GMP+signaling.">You've come a long way: c-di-GMP signaling.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).</li><li>Schirmer, T., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+mechanistic+determinants+of+c-di-GMP+signalling.">Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling.</a> Nature reviews. Microbiology. 7, 724-735 (2009).</li><li>Furukawa, S., Kuchma, S., O'Toole, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+their+options+open:+acute+versus+persistent+infections.">Keeping their options open: acute versus persistent infections.</a> J. Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).</li><li>Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+cyclic+di-GMP-specific+phosphodiesterase+and+its+allosteric+control+by+GTP.">Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP.</a> J. Biol. Chem. 280, 30829-30837 (2005).</li><li>Ryan, R. P., Fouhy, Y., Lucey, J. F., Dow, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-GMP+signaling+in+bacteria:+recent+advances+and+new+puzzles.">Cyclic di-GMP signaling in bacteria: recent advances and new puzzles.</a> J. Bacteriol. 188, 8327-8334 (2006).</li><li>Habazettl, J., Allan, M. G., Jenal, U., Grzesiek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+the+PilZ+domain+protein+PA4608+complex+with+cyclic+di-GMP+identifies+charge+clustering+as+molecular+readout.">Solution structure of the PilZ domain protein PA4608 complex with cyclic di-GMP identifies charge clustering as molecular readout.</a> J. Biol. Chem. 286, 14304-14314 (2011).</li><li>Fazli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRP/FNR+family+protein+Bcam1349+is+a+c-di-GMP+effector+that+regulates+biofilm+formation+in+the+respiratory+pathogen+Burkholderia+cenocepacia.">The CRP/FNR family protein Bcam1349 is a c-di-GMP effector that regulates biofilm formation in the respiratory pathogen Burkholderia cenocepacia.</a> Molecular Microbiology. 82, 327-341 (2011).</li><li>Hickman, J. W., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FleQ+from+Pseudomonas+aeruginosa+as+a+c-di-GMP-responsive+transcription+factor.">Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor.</a> Molecular Microbiology. 69, 376-389 (2008).</li><li>Sudarsan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riboswitches+in+eubacteria+sense+the+second+messenger+cyclic+di-GMP.">Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP.</a> Science. 321, 411-413 (2008).</li><li>Lenz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+methyltransferases+and+other+S-adenosyl-L-homocysteine-binding+Proteins+by+Capture+Compound+Mass+Spectrometry+(CCMS).">Profiling of methyltransferases and other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS).</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>K&#246;ster, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+compound+mass+spectrometry:+a+technology+for+the+investigation+of+small+molecule+protein+interactions.">Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions.</a> Assay Drug Dev Technol. 5, 381-390 (2007).</li><li>D&#252;vel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+proteomics+approach+to+identify+c-di-GMP+binding+proteins+in+Pseudomonas+aeruginosa.">A chemical proteomics approach to identify c-di-GMP binding proteins in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Microbiological Methods. 88, 229-236 (2012).</li><li>Christen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+control+of+cyclic+di-GMP+signaling.">Allosteric control of cyclic di-GMP signaling.</a> J. Biol. Chem. 281, 32015-32024 (2006).</li><li>Balasubramanian, D., Mathee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptome+analyses+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Comparative transcriptome analyses of Pseudomonas aeruginosa.</a> Human genomics. 3, 349-361 (2009).</li><li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+models+and+empirical+bayes+methods+for+assessing+differential+expression+in+microarray+experiments.">Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments.</a> Stat Appl Genet Mol Biol. 3 (3), (2004).</li><li>Baraquet, C., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+diguanosine+monophosphate+represses+bacterial+flagella+synthesis+by+interacting+with+the+Walker+A+motif+of+the+enhancer-binding+protein+FleQ.">Cyclic diguanosine monophosphate represses bacterial flagella synthesis by interacting with the Walker A motif of the enhancer-binding protein FleQ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18478-18483 (2013).</li><li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins.">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).</li><li>Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions.">Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528-15533 (2011).</li><li>DeSantis, K., Reed, A., Rahhal, R., Reinking, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+differential+scanning+fluorimetry+as+a+high-throughput+assay+to+identify+nuclear+receptor+ligands.">Use of differential scanning fluorimetry as a high-throughput assay to identify nuclear receptor ligands.</a> Nuclear receptor signaling. 10, e002 (2012).</li><li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+thermophoresis+quantifies+biomolecular+interactions+under+previously+challenging+conditions.">Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions.</a> Methods. 59, 301-315 (2013).</li><li>Merighi, M., Lee, V. T., Hyodo, M., Hayakawa, Y., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+messenger+bis-(3&#8216;-5&#8217;)-cyclic-GMP+and+its+PilZ+domain-containing+receptor+Alg44+are+required+for+alginate+biosynthesis+in+Pseudomonas+aeruginosa.">The second messenger bis-(3&#8216;-5&#8217;)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 65, 876-895 (2007).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+cyclic+diguanylate+in+the+non-catalytic+EAL+domain+of+FimX+induces+a+long-range+conformational+change.">Binding of cyclic diguanylate in the non-catalytic EAL domain of FimX induces a long-range conformational change.</a> J. Biol. Chem. 286, 2910-2917 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

טיפול מיוחד יש לנקוט במספר צעדים לפרוטוקול. ריכוז החלבון הוא פרמטר קריטי בריכוז של 10 מ&quot;ג / מיליליטר להיות קשה להגיע כאשר תאים גדלים בתנאי גידול ספציפיים (למשל biofilms או גרסאות מושבה קטנות). לפיכך, resuspension גלולה צריכה להתבצע בהיקף נמוך של מאגר תמוגה. יכולים להיות יר...

ג-di-GMP הוא שליח שני מרכזי המשמש את רוב החיידקים לשלוט בהיבטים שונים של הצמיחה והתנהגותם. לדוגמא, c-di-GMP מסדיר התקדמות תא מחזור, תנועתיות והביטוי של exopolysaccharides וadhesins משטח 2-4. באמצעות התיאום של תהליכים כאלה ג-di-GMP מקדם היווצרות biofilm, תהליך אשר מזוהה עם זיהומים כרוניים של מגוון רחב של חיידקים פתוגניים 5. ג-di-GMP הוא synthetized על ידי אנזימים הנקראים cyclases diguanylate (DGCs) כי נמל תחום GGDEF קטליטי 4. DGCs כמה בעלי אתר מעכב שלמטה מסדיר את פעילות cyclase על ג-di-GMP מחייב. השפלה של c-di-GMP היא זרז על ידי שני סוגים שונים של phosphodiesterases (PDEs) חסה או EAL קטליטי או HD-גיפ תחום 6,7. רוב חלבוני מפעיל הידועים כי ישירות לאגד ג-di-GMP שייך לאחד משלושה סוגים של חלבונים: קטליטיתחומים ברית פעילים GGDEF או EAL ותחומים פילץ, מתגים מולקולריים קטנים שעוברים שינויי קונפורמציה על ג-di-GMP מחייב 8. חלבוני DGCs, PDEs ופילץ מאופיינים היטב וניתן לחזות תחומיהם בסיליקון ויחסית בשלום. עניין מיוחד מתמקד כעת על זיהוי של סוגים חדשים של effectors ג-di-GMP. effectors חלק ג-di-GMP עם מוטיבים שונים מחייבים תוארה כזה לאחרונה כCRP Bcam1349 / FNR משפחת החלבון בBurkholderia cenocepacia או FleQ רגולטור תעתיק בפ aeruginosa 9,10. בנוסף, riboswitches ג-di-GMP ספציפי זוהו לאחרונה ומוצג לשלוט ביטוי גנים באופן c-di-GMP תלוי 11. המוטיבים ג-di-GMP המחייב של effectors שונה רק בצורה גרועה נשמרת ביצוע תחזיות bioinformatic של חלבונים כגון קשות. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו שיטה ביוכימית, המבוסס על השימוש בSPE ג-di-GMPבשילוב מגרש לכידת cific עם ספקטרומטר מסת 1,12,13. יש לנו לאחרונה מהונדס מתחם לכידת ג-di-GMP trivalent רומן (CDG-CC, איור 1) 1. פיגום כימי זה מורכב מ: 1) מחצית ג-di-GMP שימש כפיתיון כדי ללכוד ג-di-GMP מחייב חלבונים, 2) קבוצה תגובתי UV-photoactivatable נהגה לחצות קישור CDG-CC לחלבונים מחויבים ו 3) ביוטין לבודד את החלבונים שנתפסו באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin מצופה. CDG-CC ניתן להשתמש ישירות ובאופן ספציפי כדי ללכוד effectors ג-di-GMP מתערובת מורכבת של מקרו-מולקולות כlysates תא. מתחם לכידת מבוסס וגישות המבוססות פרוטאומיקה כימיות בעבר כבר דיווחו להיות ישים למגוון רחב של אורגניזמים, למשל Caulobacter crescentus, typhimurium serovar enterica סלמונלה וP. aeruginosa 1,14. במאמר המתודולוגי הזה,אנו מספקים בתיאור מעמיק של הליך CCMS באמצעות תמציות של פ aeruginosa כדוגמא. מחקר זה קובע CCMS ככלי רב עוצמה ורב לזהות ביוכימית רכיבי רומן המעורב באיתות מולקולה קטנה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1179">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">caproBox</td>
			<td style="width:223px;">caprotec bioanalytics</td>
			<td style="width:207px;">1-5010-001 (220 V)</td>
			<td style="width:515px;">UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:236px;">caproMag</td>
			<td style="width:223px;">caprotec bioanalytics</td>
			<td style="width:207px;">included in the CCMS Starter Kit</td>
			<td style="width:515px;">For easy handling of magnetic particles without pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:236px;">c-di-GMP caproKit</td>
			<td style="width:223px;">caprotec bioanalytics</td>
			<td style="width:207px;">upon request</td>
			<td style="width:515px;">The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:236px;">Disposable PD-10 Desalting Columns</td>
			<td style="width:223px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:207px;">17-0851-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:236px;">12-tube PCR strips</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:207px;">AB-1114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UIS250v sonicator with VialTweeter</td>
			<td style="width:223px;">Hielscher ultrasound technology</td>
			<td style="width:207px;">UIS250v and VialTweeter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:236px;">Miniature French Pressure Cell</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Electron Corporation</td>
			<td style="width:207px;">FA-003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capture compound mass spectrometry - a powerful tool to identify novel c-di-gmp effector proteins

התקדמות ניכרת נעשתה בעשור האחרון לזיהוי והאפיון של אנזימים מעורבים בסינתזה (cyclases diguanylate) והשפלה (phosphodiesterases) של השליח השני ג-di-GMP. בניגוד לכך, מעט מידע זמין לגבי המנגנונים המולקולריים ומרכיבים תאיים שדרכו מולקולת איתות זה מסדיר מגוון רחב של תהליכים תאיים. רוב חלבוני מפעיל הידועים שייכים למשפחת פילץ או הידרדרו cyclases diguanylate או phosphodiesterases שויתר על קטליזה ואמצה פונקצית מפעיל. לכן, כדי להגדיר טוב יותר את רשת ג-di-GMP הסלולרי במגוון רחב של חיידקי שיטות ניסיוניות נדרשות לזהות ולאמת effectors רומן שאמין בתחזיות סיליקון ולהיכשל. יש לנו לאחרונה פיתחתי תרכובת רומן לכידת ספקטרומטריית מסה (CCMS) המבוססת על טכנולוגיית ככלי רב עוצמה לביוכימית לזהות ולאפיין מחייבים חלבוני c-di-GMP. טכניקה זו כבר דווחה בעבר להיות ישים למגוון רחב של אורגניזמים 1. כאן אנו נותנים תיאור מפורט של הפרוטוקול שאנו מנצלים לחקור רכיבי איתות כזה. כדוגמא, אנו משתמשים Pseudomonas aeruginosa, הפתוגן אופורטוניסטי שבי ג-di-GMP משחק תפקיד קריטי בשליטת ארסיות וbiofilm. CCMS זיהה 74% (38/51) של הרכיבים הידועים או צפויים של רשת ג-di-GMP. מחקר זה מסביר את הליך CCMS בפירוט, וקובע אותה ככלי רב עוצמה ורב-תכליתי לזהות רכיבי רומן מעורבים באיתות מולקולה קטנה.

לזהות effectors ג-di-GMP רומן בפ aeruginosa באופן שיטתי בשימוש CCMS לנתח את השברים המסיסים וקרום של פ PAO1 aeruginosa מתח מתרבות שלב יומן (OD 600 = 0.5). כאן אנו לסכם ולדון בתוצאות נציג של מסע הדיג הזה. ארבעה העתקים ביולוגיים עצמאיים היו בשימוש. עבור כל ניסוי שני ריכוזי CDG-CC שו...

Watch this Scientific Journal Video about Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins at JoVE.com

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

ספקטרומטריית מתחם מיסת לכידה - כלי רב עוצמה לזיהוי הרומן ג-di-GMP חלבונים מפעיל

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

capture-compound-mass-spectrometry-powerful-tool-to-identify-novel-c

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K Views.  Biozentrum of the University of Basel. The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

Video: Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys loop, the glutamate-gated and the P2X receptor channels2. In each case binding of transmitter leads to the opening of a pore through which ions flow down their electrochemical gradients. Many ligand-gated channels are also permeable to calcium ions3, 4, which have downstream signaling roles5 (e.g. gene regulation) that may exceed the duration of channel opening. Thus ligand-gated channels can signal over broad time scales ranging from a few milliseconds to days. Given these important roles it is necessary to understand how ligand-gated ion channels themselves are regulated by proteins, and how these proteins may tune signaling. Recent studies suggest that many, if not all, channels may be part of protein signaling complexes6. In this article we explain how to identify the proteins that bind to the C-terminal aspects of the P2X2 receptor cytosolic domain.
P2X receptors are ATP-gated cation channels and consist of seven subunits (P2X1-P2X7). P2X receptors are widely expressed in the brain, where they mediate excitatory synaptic transmission and presynaptic facilitation of neurotransmitter release7. P2X receptors are found in excitable and non-excitable cells and mediate key roles in neuronal signaling, inflammation and cardiovascular function8. P2X2 receptors are abundant in the nervous system9 and are the focus of this study. Each P2X subunit is thought to possess two membrane spanning segments (TM1 &amp; TM2) separated by an extracellular region7 and intracellular N and C termini (Fig 1a)7. P2X subunits10 (P2X1-P2X7) show 30-50% sequence homology at the amino acid level11. P2X receptors contain only three subunits, which is the simplest stoichiometry among ionotropic receptors. The P2X2 C-terminus consists of 120 amino acids (Fig 1b) and contains several protein docking consensus sites, supporting the hypothesis that P2X2 receptor may be part of signaling complexes. However, although several functions have been attributed to the C-terminus of P2X2 receptors9 no study has described the molecular partners that couple to the intracellular side of this protein via the full length C-terminus. In this methods paper we describe a proteomic approach to identify the proteins which interact with the full length C-terminus of P2X2 receptors.

We describe a simple protocol to identify brain proteins that bind to the full length C terminus of ATP-gated P2X2 receptors. The extension and systematic application of this approach to all P2X receptors is expected to lead to a better understanding of P2X receptor signaling.

Proteomics כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם ליגנד P2X2-מגודרת ערוצי קטיון

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and very simple lipidome, is a valuable model for studying biological functions of various lipid species in multicellular eukaryotes2,3,5. S. cerevisiae has 10 major classes of lipids with chain lengths mainly of 16 or 18 carbon atoms and either zero or one degree of unsaturation6,7. Existing methods for lipid identification and quantification - such as high performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, fluorescence microscopy, and gas chromatography followed by MS - are well established but have low sensitivity, insufficiently separate various molecular forms of lipids, require lipid derivitization prior to analysis, or can be quite time consuming. Here we present a detailed description of our experimental approach to solve these inherent limitations by using survey-scan ESI/MS for the identification and quantification of the entire complement of lipids in yeast cells. The described method does not require chromatographic separation of complex lipid mixtures recovered from yeast cells, thereby greatly accelerating the process of data acquisition. This method enables lipid identification and quantification at the concentrations as low as g/ml and has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. Lipids extraction from whole yeast cells for using this method of lipid analysis takes two to three hours. It takes only five to ten minutes to run each sample of extracted and dried lipids on a Q-TOF mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source.

We describe a new quantitative lipidomics method for identifying numerous lipid species in yeast using survey-scan electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). This method exceeds currently available methods for lipid identification and quantification in the ability to resolve various molecular forms of lipids, sensitivity, and speed.

הערכה כמותית של Lipidome שמרים באמצעות Ionization electrospray ספקטרומטריית מסה

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

Split-יוביקוויטין ממברנה שמרים בהתבסס שני היברידי (מיתוס) מערכת: כלי רב עוצמה עבור זיהוי חלבונים אינטראקציות

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

ניתוח מערכות חלבון גדול על ידי ספקטרומטריית מסה מבנית

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - שיטה לזהות Transcriptome רחב אתרי קישור של חלבונים RNA הכבילה

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

פרופיל של Methyltransferases ועל אחרים S-Adenosyl- L-הומוציסטאין מחייב חלבונים על ידי ספקטרומטריית מתחם המיסה לכידה (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein interactions, protein conformational changes, protein dynamics and protein-ligand interactions. H/D exchange on the backbone amide positions has been utilized to measure the deuteration rates of the micro-regions in a protein by mass spectrometry1,2,3. The resolution of this method depends on pepsin digestion of the deuterated protein of interest into peptides that normally range from 3-20 residues. Although the resolution of H/D exchange measured by mass spectrometry is lower than the single residue resolution measured by the Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) method of NMR, the mass spectrometry measurement in H/D exchange is not restricted by the size of the protein4. H/D exchange is carried out in an aqueous solution which maintains protein conformation. We provide a method that utilizes the MALDI-TOF for detection2, instead of a HPLC/ESI (electrospray ionization)-MS system5,6. The MALDI-TOF provides accurate mass intensity data for the peptides of the digested protein, in this case protein kinase Pak2 (also called &gamma;-Pak). Proteolysis of Pak 2 is carried out in an offline pepsin digestion. This alternative method, when the user does not have access to a HPLC and pepsin column connected to mass spectrometry, or when the pepsin column on HPLC does not result in an optimal digestion map, for example, the heavily disulfide-bonded secreted Phospholipase A2 (sPLA2). Utilizing this method, we successfully monitored changes in the deuteration level during activation of Pak2 by caspase 3 cleavage and autophosphorylation7,8,9.

MALDI-TOF mass spectrometry was successfully utilized to monitor the amide hydrogen/deuterium exchange in protein kinase Pak2 activation.

אמיד מימן / דאוטריום Exchange &amp; MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית ניתוח של הפעלת Pak2

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

פרופיל Proteome חיזור תיאול באמצעות תיוג איזוטופ ספקטרומטריית מסה

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...