אנו מודים לאלחנדרו ברון מCISA-INIA למתן סרה נגיף קדחת העמק נגד הבקעה. עבודה במעבדות שלנו נתמכת על ידי פנינת Forschungsförderung. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum גיסן und מרבורג, בית הספר למוסמכים לייבניץ למחלות ויראליות מתעוררים (EIDIS), Sonderforschungsbereich DFG (SFB) 1021, וSchwerpunktprogramm DFG (SPP) 1596.

1. זריעה של תאי A549 לזיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טפח את בקבוק T75 של תאי A549 על 37 ° C ו 5% CO 2 בתרבית תאים בינונית (DMEM בתוספת FCS 10%, L-גלוטמין 526.6 מ&quot;ג / ליטר, 50.000 פניצילין U / ליטר, ו50 סטרפטומיצין מ&quot;ג / ליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחיל לקצור את התאים, לחמם את המדיום סלולרי תרבות, PBS ו0.05% טריפסין-EDTA בwaterbath מחומם ל37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום ולשטוף את התאים עם 10 מיליליטר PBS. הסר את PBS שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מיליליטר של טריפסין-EDTA ולהפיץ באופן שווה בבקבוק. מעביר את הבקבוק באינקובטור עם 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל התאים מנותקים, להוסיף 7 מיליליטר של מדיום תרבות תא, resuspend התאים, ולהעביר את ההשעיה התא לתוך צינור פלקון 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 800 במשך 5 דקות ב RT, להסיר את supernatant ו resuspend את הכדור ב 10 מיליליטר תרבית תאים בינוני טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים עם חדר ספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.5 x 10 6 תאים ב 5 מיליליטר של מדיום תרבות תא בשתי צלוחיות T25 כל אחד. דגירה של 16 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2. בקבוק אחד משמש לשליטה מדומה ואחד לזיהום Cl 13. </li></ol> 2. זיהום עם Clone וירוס בקעת קדחת 13 (13 Cl) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: 13 Cl הוא מוטציה נגיף מוחלשת שבגרמניה יכול להיות מטופלים תחת BSL-2 תנאים. אנא עיין בכללים לאומיים רלוונטיים. מעוררי IFN אופייניים אחרים יהיו וירוס סנדאי (זן Cantell) או וירוס מחלת ניוקאסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , בינוני סרום ללא טרום חם PBS, ומדיום תרבית תאים המכיל FCS 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1.25 x 10 7 PFU / מיליליטר של 13 Cl במדיום סרום ללא להדביק 2.5 x 10 6 תאי A549 עם ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 5. הכן כמות מעט (בערך 10%) גדולה יותר מהדרוש כדי להסביר שגיאות פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS כמתואר תחת 1.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של דילול Cl 13 אושל מדיום סרום ללא (שליטה נגוע, מדומה) לתאים, ודגירה עבור שעה 1 ב 37 ° C ו 5% CO 2. הזז את הבקבוק בזהירות כל 15 דקות כדי להבטיח חלוקה שווה של Cl 13 דילול ובינוני סרום ללא, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1 של זיהום, להסיר את inocula, מוסיף 5 מיליליטר של מדיום תרבות תא מחומם מראש עם FCS 5%, ו דגירה במשך 5 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li></ol> 3. הכנת lysates התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן PBS / 0.5% טריטון X-100 ב 4 ° C. אל תוסיפו מעכבי פרוטאז סרין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS הקר ולהוסיף 10 מיליליטר של PBS הטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד את התאים כבויים, להעביר את ההשעיה התא בצינור בז, ו צנטריפוגות ב XG 800 במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב μl 30 PBS / 0.5% טריטון X-100. העבר את lysate לתוך צינור מיליליטר טרי 1.5 ודגירה של לפחות 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysate ב10.000 XG 10 דקות ב 4 ° C ולהעביר את lysate הבהיר התא (supernatant) לתוך צינור טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז החלבון על ידי assay ברדפורד כמתואר במקום אחר 33. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב -20 ° C או להמשיך לעיכול טריפסין (4.1) או עמוד ילידים (5.1). </li></ol> 4. קביעת קונפורמציה השינויים של זיהוי התבניות רצפטורים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול TPCK-טריפסין של lysates התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל טריפסין L-1-tosylamido-2-phenylethyl טופלו קטון chloromethyl (TPCK) ב-PBS לריכוז עבודה סופי של 2 מיקרוגרם / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם בשני צינורות חדשים ריכוז חלבון סופי של 25 מיקרוגרם של כל lysate חלבון (מדומה או 13 Cl) בנפח סופי של μl 9 עם PBS. לכן, זה צריך להיות ארבעה צינורות עם 25 lysate מיקרוגרם כל אחת, שתי פעמים מדומה ושתי פעמים Cl זיהום 13. אחד מוגדר כשליטת קלט (ללא טיפול) וקבוצה אחת לטיפול בTPCK-טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של PBS (ללא טיפול)או 1 μl של 2 מיקרוגרם / μl TPCK-טריפסין (ריכוז סופי: 0.2 מיקרוגרם / μl) לlysates התא ומערבבים את התגובות על ידי pipetting. לא להקפיא ולהפשיר aliquots TPCK-טריפסין, כי זה יפגע ביעילות של מערכת העיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה lysates ב37 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות. עצור את התגובה על ידי הוספת 5x denaturing חיץ מדגם (250 מ&quot;מ טריס-HCl pH 6.8, 10% SDS, גליצרול 50%, 25% β-mercaptoethanol, bromphenol 0.5% הכחולים) ועל ידי רתחה במשך 5 דקות ב95 ° C. חשוב לא להאריך את זמן הדגירה טריפסין. במקרה לא שברי פרוטאז עמיד הם לגילוי, הזמן של עיכול טריפסין חייב להתקצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרתיחה, ניתן לאחסן הדגימות ב-20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SDS polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה (עמוד) ומערבי סופג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הדגימות על נתרן גופרתי dodecyl (SDS) ג&#39;ל polyacrylamide המכיל לערום 5% מעל 12% ג&#39;ל פתרון. הפרד את החלבונים ב25 mA לג&#39;ל עדbromphenol הכחול שנגמר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל קרום polyvinylidene פלואוריד (PVDF) ל30 שניות עם מתנול והכניס אותו לתוך חיץ העברה (48 מ&quot;מ טריס, 39 מ&quot;מ glycin, 1.3 מ&quot;מ SDS, מתנול 20%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את סופג עם מערכת סופג semidry ולאפשר העברת החלבונים ב10 V במשך שעה 1. קח את הממברנה החוצה, לשטוף אותו לזמן קצר במים, ולתת לו להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מחדש את הקרום על ידי זמן קצר העברה למתנול. שטוף למשך 5 דקות עם TBS. לחסום עם 10% חלב דל שומן בכפות עבור שעה 1 ב RT או 4 ° CO / נ לשטוף 3x הקרום במשך 5 דקות כל אחד עם TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול נוגדן כפי שהומלץ בטבלה 1 ו דגירה הקרום עבור שעה 1 ב RT או 4 ° CO / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3x הקרום 10 דקות כל אחד עם TBS-T. מוסיף את הנוגדנים משני המתאימים בשילוב עם חזרת peroxidase בדילול 1:20,000 ב1% חלב דל שומן בכפות. דגירה 45 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3x הקרום 10 דקות כל אחד עם TBS-T, וoזמן נוסף ne עם TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזיהוי אות להשתמש במערכת הדמיה דיגיטלית ג&#39;ל ערכת chemiluminescense מסחרית ו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתמים כחולי G-250 מבריקים Coomassie <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע-SDS כמתואר ב4.2.1. דגימות עומס על ג&#39;ל polyacrylamide SDS ולהפעיל את הג&#39;ל על 25 mA לג&#39;ל עד bromphenol הכחול שנגמר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מכתים הכחול G-250 מבריק Coomassie ב RT. האם כל incubations תחת טלטול מתמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הג&#39;ל לפתרון הקיבעון המכיל מתנול 40% ו10% חומצה אצטית ל30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף את החיץ לפתרון destaining (25% אתנול ו -8% חומצה אצטית) ודגירה של 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם ג&#39;ל עם 0.2% Coomassie Brillant Blue-G-250 במתנול 40% וחומצה אצטית 10% במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Destain ג&#39;ל עם פתרון destaining ולהחליף את החיץ לאחר 10 דקות, 30 דקות, ו60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הג&#39;ל ב25% אתנול, 8% חומצה אצטית, וגליצרול 4% ב 4 ° C. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הדמיה וניתוח כפי שתואר תחת 4.2.8. </li></ol></li></ol> 5. ניתוח Oligomeric הברית של זיהוי התבניות רצפטורים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמוד Native <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מיקרוגרם של lysate תא בנפח סופי של μl 10 עם PBS ולהוסיף 5 × חיץ האם של מדגם (250 מ&quot;מ טריס-HCl pH 6.8, 1% deoxycholate נתרן, גליצרול 50%, bromphenol 0.5% הכחולים) לריכוז סופי של 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הדגימות באופן מיידי על ג&#39;ל polyacrylamide יליד עם 5% כלערום ו -8% כפתרון ג&#39;ל. כל עיכוב יגרום לאובדן של קומפלקסי ילידים 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרץ את הג&#39;ל על 20 mA לג&#39;ל על 4 מעלות צלזיוס עם 50 מ&quot;מ טריס-NaOH pH 9.0, 384 מ&quot;מ glycin כמו האנודה ו50 מ&quot;מ טריס pH 8.3, 384 מ&quot;מ glycin, 1% deoxycholate נתרן כחיץ קתודה. לאחר 1.5-2 שעה (להקה הכחולה bromphenol הותירה את הג&#39;ל כ 45 דקות קודם לכן) אלקטרופורזה הוא סיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סופג מערבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל polyvinylidene פלואוריד קרום (PVDF) ל30 שניות עם מתנול והכניס אותו לתוך מאגר טובין (25 מ&quot;מ טריס, 192 מ&quot;מ glycin, 0.1% SDS, מתנול 20%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב קאמרי כתם רטוב על פי הוראות היצרן ולמלא את המכל עם חיץ Towin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הסופג עם 250 mA ל1.5 שעות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשהסופג הוא סיים המשך כמתואר מ4.2.3 הלאה. </li></ol></li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

חישה נוכחותם של וירוסים והפעלה של הסוג אנטי אני IFN מערכת חיוני לתגובה חיסונית מולדת מוצלחת 22. זיהוי וירוסים הוא בתיווך ובכך על ידי קולטנים זיהוי הפתוגן (PRRs) כמו RIG-I ו PKR, ומאפשר תגובה והפעלה של מנגנוני הגנה אנטי מהירים. כאן, אנו מתארים שתי שיטות על מנת להעריך את מצב...

אירוע מכריע בהגנת מארחת נגיפים הוא האיתור המהיר של הפתוגן על ידי קולטנים שנקרא זיהוי תבניות (PRRs) 1,2. איתור תאיים של זיהום בנגיף RNA תלוי בשני helicases cytoplasmic RNA, RIG-I (אני גן מושרה חומצה רטינואית) וMDA5 (חלבון בידול מלנומה קשור 5) 3-5. RIG-מורכב משני תחומים N-מסוף גיוס caspase (כרטיסים), תחום helicase RNA סוג DECH התיבה מרכזי, ותחום בטרמינל C-(CTD) 4,6. ואילו CTD ותחום helicase נדרשים להכרה של RNAs אינו עצמי (ויראלי), הכרטיסים לתווך איתות במורד הזרם שתוביל להקמת מעמד מארח אנטי. אם RIG-אני נמצא במצב השקט, כלומר בהיעדר ליגנד RNA ספציפי, הכרטיס השני אינטראקציה עם תחום helicase המרכזי ושומר RIG-I בקונפורמציה אוטומטית מעכבת 7-11. RIG-I נקשר קצר כפולגדיל RNA (DS) נושאות 5&#39;-טריפוספט (5&#39;PPP), dsRNA הארוך, ו-RNA PolyU / UC-עשיר, מבני חתימה קלאסיים אשר נמצאים בגנומים של וירוסי RNA רבים 12-16. שני מאפיינים עיקריים של RIG-I הפעלה הם מעבר לקונפורמציה סגורה 6,17 וההומו-oligomerization 6,18,19. מתג קונפורמציה משפר RNA מחייב, חושף את הקלפים לאיתות במורד הזרם, וreconstitutes אתר ATPase פעיל 8,9,11,20. היווצרות של קומפלקסי RIG-I oligomeric מובילה לגיוס מוגבר של מולקולות איתות במורד הזרם מתאם כדי ליצור פלטפורמה להעברת אותות אנטי 11. שרשרת האיתות המוסדרת RIG-סופו של דבר מפעילה את גורם שעתוק IRF-3 לעד ויסות של אינטרפרון גנים (IFN-alpha/beta) ומכאן ביטוי גנים של גנים אינטרפרון מגורה (ISGs) לתגובה אנטי מלאה 21,22 . אחד ISGs המאופיין ביותר הוא protei מופעל RNAקינאז n (PKR) 23. PKR שייך למשפחה של ייזום תרגום גורם 2 אלפא אוקריוטים קינאז (eIF2α) והוא מורכב מתחום N-מסוף פעמיים תקוע RNA מחייב ותחום קינאז C-מסוף. תחום קינאז מהווה ממשק dimerization חיוני להפעלת PKR ומבצע את הפונקציות הקטליטית של החלבון. עקידת PKR לdsRNA הנגיפי מובילה לשינוי קונפורמציה התרת dimerization והאוטומטי זירחון בThr 446 בין שאריות אחרות. PKR אז מתווך זירחון של eIF2α, ובכך חוסם את התרגום של mRNAs הנגיפי 23-27. שני RIG-I ו PKR לעבור שחלופים מבניים גדולים, יצירת קומפלקסי oligomeric והם פוסט translationally שונה על ידי זירחון / dephosphorylation וubiquitination 10,11,19,23,24,26-29. להבנה טובה יותר של מבנים שרנ&quot;א נגיפיים מפעילים RIG-I ו PKR (ובאיזה שלב יריבים נגיפיים יכולים bדואר להתערב), חשוב על מנת לקבוע את מצב ההפעלה בדיוק. עבור שניהם PRRs שתואר בעבר על כך שהפעיל גורם להופעתה של שברי טריפסין עמיד חלבון 6,17,30 וoligomers מסדר גבוה 6,18,19. עם זאת, בהתחשב בעושר של ספרות על גורמי מפתח אלה של תגובת המארח אנטי 1,2,24, יישום של שיטות ישירות נראה יחסית נדיר. בתקווה להגביר את השימוש רחב יותר, אנו מספקים פרוטוקולים נוחים ורגישים כדי לנתח וחסונה מדינות ההפעלה של RIG-I ו PKR. A549 שורת תאים אנושי המוסמך IFN נגוע בactivator הוקם RIG-I ו PKR, שיבוט נגיף קדחת עמק השבר נחלש המוטציה 13 (13 Cl) 31,32. לאחר הליך lysing פשוט, תמציות של תאים נגועים נבדקות על ידי עיכול / ניתוח כתם מוגבל טריפסין מערבי להעריך מיתוג קונפורמציה, ועל ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידים הכחול (עמוד) / analys כתם המערביהוא למדוד היווצרות oligomers.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320">
	<tbody>
		<tr height="43" style="height:32.25pt">
			<td class="xl66" height="43" style="height:32.25pt;width:60pt" width="80">Name</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Company</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Catalog Number</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">cell culture</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">21969-035</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">OptiMEM</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">31985-47</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">L-glutamine</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25030-024</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl72" height="61" style="height:45.75pt;width:60pt" width="80">penicillin-streptomycin</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">15070-063</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl73" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">fetal calf serum (FCS)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">10270</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25300-054</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">chemicals</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="190" style="height:142.5pt">
			<td class="xl73" height="190" style="height:142.5pt;width:60pt" width="80">L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">T1426</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">antibodies</td>
			<td class="xl78" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1)</td>
			<td class="xl74" style="width:60pt" width="80">Enzo Life Sciences</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">ALX-804-849-C100</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-PKR (B10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-6282</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Epitomics</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">1120-1</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">rabbit polyclonal anti-IRF-3</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-9082</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">IBL</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">og-413</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="126" style="height:94.5pt">
			<td class="xl81" height="211" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 height:158.25pt;border-top:none;width:60pt" width="80">rabbit anti-RVFV hyperimmune serum &#34;C2&#34; (MP-12)</td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl75" style="width:60pt" width="80">Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA)</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl65" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Cell Signalling</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">3700</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">0031460 1892914</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl64" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">0031430 1892913</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring activation of the antiviral pattern recognition receptors rig-i and pkr by limited protease digestion and native page

הגנה מארחת לזיהום בנגיף תלוי באיתור מהיר על ידי קולטנים זיהוי תבניות (PRRs) של מערכת החיסון המולדת. בציטופלסמה, PRRs RIG-I ו לאגד PKR לליגנד רנ&quot;א הנגיפי הספציפי. זה מתווך ראשון מיתוג וoligomerization קונפורמציה, ולאחר מכן מאפשר הפעלה של תגובת אינטרפרון אנטי. בעוד שיטות כדי למדוד ביטוי גני מארח נגיפים מבוססות היטב, שיטות לניטור ישירות מדינות ההפעלה של RIG-I ו PKR הן רק באופן חלקי ופחות מבוססות היטב. כאן, אנו מתארים שתי שיטות לניטור RIG-I ו PKR גירוי על זיהום עם inducer הוקמה אינטרפרון, נגיף קדחת בקעת שיבוט מוטציה 13 (Cl 13). עיכול טריפסין מוגבל מאפשר לנתח שינויים ברגישות פרוטאז, המצביע על שינויי קונפורמציה של PRRs. עיכול טריפסין של lysates מתוצאות תאים נגועים מדומה בהידרדרות מהירה של RIG-I ו PKR, whereaזיהום של Cl 13 מוביל להופעתה של פרוטאז עמיד RIG-שבר. גם PKR מראה התנגדות חלקית מושרה וירוס לעיכול טריפסין, אשר עולה בקנה אחד עם זירחון סימן ההיכר שלה בThr 446. היווצרות RIG-I ו oligomers PKR היה תוקף על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידים (עמוד). עם הזיהום, יש הצטברות חזקה של RIG-I ו מתחמי oligomeric PKR, ואילו חלבונים אלה נותרו כמונומרים בדגימות נגועות מדומה. עיכול מוגבל פרוטאז ועמוד מקורי, שניהם יחד לניתוח כתם מערבי, מאפשרים מדידה רגישה וישירה של שני שלבים שונים של RIG-I ו הפעלת PKR. טכניקות אלה קלות ומהיר יחסית לביצוע ואינו דורשות ציוד יקר.

הכרה באגוניסט ויראלי ידי RIG-I או PKR מפעיל מיתוג קונפורמציה 6,17,30 וoligomerization 6,18,27. אנו assayed שני סמני הפעלה אלה על ידי עיכול פרוטאז מוגבל וג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידים (עמוד), בהתאמה. תאי A549 אדם היו נגועים בנגיף קדחת שיבוט ...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE at JoVE.com

Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

הגנה מולדת לנגיף מופעלות על ידי קולטנים זיהוי תבניות (PRRs). שני PRRs cytoplasmic RIG-I ו לאגד PKR כדי RNAs הנגיפי החתימה, שינוי קונפורמציה, oligomerize, ולהפעיל את איתות אנטי. שיטות מתוארות המאפשרות לפקח על מיתוג קונפורמציה וoligomerization של PRRs cytoplasmic אלה בנוחות.

הפעלת ניטור של התבנית אנטי רצפטורים ההכרה RIG-I ו PKR ידי מוגבל פרוטאז עיכול ועמוד Native

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

monitoring-activation-antiviral-pattern-recognition-receptors-rig-i

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.0K Views.  Philipps-University Marburg.  הגנה מולדת לנגיף מופעלות על ידי קולטנים זיהוי תבניות (PRRs). שני PRRs cytoplasmic RIG-I ו לאגד PKR כדי RNAs הנגיפי החתימה, שינוי קונפורמציה, oligomerize, ולהפעיל את איתות אנטי. שיטות מתוארות המאפשרות לפקח על מיתוג קונפורמציה וoligomerization של PRRs cytoplasmic אלה בנוחות. 

Video: Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In genetically predisposed individuals, tTG2 triggers autoimmune responses that are characterized by the production of tTG2 antibodies and their direct deposition into small intestinal wall 1,2. The presence of such antibodies constitutes one of the major hallmarks of the celiac disease (CD). Epidermal transglutaminase (eTG) is another member of the transglutaminase family that can also function as an autoantigen in a small minority of CD patients. In these relatively rare cases, eTG triggers an autoimmune reaction (a skin rash) clinically known as dermatitis herpetiformis (DH). Although the exact mechanism of CD and DH pathogenesis is not well understood, it is known that tTG2 and eTG share antigenic epitopes that can be recognized by serum antibodies from both CD and DH patients 3,4.
In this study, the confocal microscopy examination of biopsy samples from skin lesions of two rhesus macaques (Macaca mulatta) with dermatitis (Table 1, Fig. 1 and 2) was used to study the affected tissues. In one animal (EM96) a spectral overlap of IgA and tTG2 antibodies (Fig. 3) was demonstrated. The presence of double-positive tTG2+IgA+ cells was focused in the deep epidermis, around the dermal papillae. This is consistent with lesions described in DH patients 3. When EM96 was placed on a gluten-free diet, the dermatitis, as well as tTG2+IgA+ deposits disappeared and were no longer detectable (Figs. 1-3). Dermatitis reappeared however, based on re-introduction of dietary gluten in EM96 (not shown). In other macaques including animal with unrelated dermatitis, the tTG2+IgA+ deposits were not detected. Gluten-free diet-dependent remission of dermatitis in EM96 together with presence of tTG2+IgA+ cells in its skin suggest an autoimmune, DH-like mechanism for the development of this condition. This is the first report of DH-like dermatitis in any non-human primate.

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Dermatitis herpetiformis (DH) is a chronic inflammatory condition characterized by an autoimmune reaction between IgA and epidermal transglutaminase (eTG). DH develops in a very small portion of gluten-sensitive and/or celiac patients. The results of this study indicate that DH can also develop in a rhesus monkey host with symptoms of idiopatic dermatitis.

הכרה Transglutaminase עוריות על ידי IgA ו Transglutaminase רקמות 2 נוגדנים במקרה נדיר של רזוס דרמטיטיס

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

Immunofluorescence לפקח על הספיגה הסלולארית של לקטופרין האדם והפעילות הקשורה אנטי נגד וירוס הצהבת מסוג C

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

מבחני ויראלי המוקדם כניסה לזיהוי והערכה של אנטי תרכובות

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

ה<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גירוי קולטן הכרת תרבות תבנית של עכבר המעיים Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

יצירה<em&gt; דה נובו</em&gt; לקולטנים המצויים בתאי אנטיגן ספציפי האדם T על ידי retroviral התמרה של Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

זיהומים arbovirus כמו כלים ההקרנה לצורך זיהוי גורמים אנטי ויראלי Immunomodulators ומנחה

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Co-immunoprecipitation Assay ללמוד אינטראקציות פונקציונלי בין קולטנים ואנזימים

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

העיכול של הכבד מאתר של ניתוח Cytometric זרימת הלימפה תאי אנדותל

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

הדמיה קונאפוקלית של זוגיות גדילי RNA ודפוס זיהוי רצפטורים להדבקת וירוס RNA שלילי-סנס

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

עיבוד פרוטוקול עבור הניתוח של פעפוע וגודל האשכול של קולטני ממברנה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ תמונה

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...