המחברים מודים למקורות המימון שלהם, תכנית הווארד יוז הרפואי במכון לתואר ראשון מדע חינוך למכללת ויליאם ומרי; נותן חסות לגרנט: NIH (MSS); מספר גרנט: R15NS067566. הם גם מכירים תמיכה ממכללת ויליאם ומרי, החוג לביולוגיה במכללה לאמנויות ומדעים לקבלת סיוע בטיפול בבעלי חיים.

<ol>
	<li>Eng, M. L., Elliott, J. E., MacDougall-Shackleton, S. A., Letcher, R. J., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+exposure+to+2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl+ether+(BDE-99)+affects+mating+behavior+of+zebra+finches.">Early exposure to 2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl ether (BDE-99) affects mating behavior of zebra finches.</a> Toxicol Sci. 127, 269-276 (2012).</li><li>Winter, V., Elliott, J. E., Letcher, R. J., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+an+egg-injection+method+for+embryotoxicity+studies+in+a+small,+model+songbird,+the+zebra+finch+(Taeniopygia+guttata).">Validation of an egg-injection method for embryotoxicity studies in a small, model songbird, the zebra finch (Taeniopygia guttata).</a> Chemosphere. 90, 125-131 (2013).</li><li>Maney, D. L., Goodson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenomic+mechanisms+of+aggression+in+songbirds.">Neurogenomic mechanisms of aggression in songbirds.</a> Adv Genet. 75, 83-119 (2011).</li><li>Kirn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+of+neurogenesis+and+growth+of+brain+regions+to+song+learning.">The relationship of neurogenesis and growth of brain regions to song learning.</a> Brain and Language. 115, 29-44 (2010).</li><li>Fisher, S. E., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXP2+as+a+molecular+window+into+speech+and+language.">FOXP2 as a molecular window into speech and language.</a> Trends in Genetics. 25, 166-167 (2009).</li><li>Tokarev, K., Tiunova, A., Scharff, C., Anokhin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+for+Song:+Expression+of+C-Fos+and+ZENK+in+the+Zebra+Finch+Song+Nuclei+during+Food+Aversion+Learning.">Food for Song: Expression of C-Fos and ZENK in the Zebra Finch Song Nuclei during Food Aversion Learning.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Vargha-Khadem, F., Gadian, D. G., Copp, A., Mishkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXP2+and+the+neuroanatomy+of+speech+and+language.">FOXP2 and the neuroanatomy of speech and language.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 131-138 (2005).</li><li>Schulz, S. B., Haesler, S., Scharff, C., Rochefort, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+FoxP2+alters+spine+density+in+Area+X+of+the+zebra+finch.">Knockdown of FoxP2 alters spine density in Area X of the zebra finch.</a> Genes, Brain and Behavior. 9, 732-740 (2010).</li><li>Jarvis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+brains+and+a+new+understanding+of+vertebrate+brain+evolution.">Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 151-159 (2005).</li><li>Brainard, M. S., Doupe, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+birdsong:+songbirds+as+a+model+for+basic+applied+medical+research.">Translating birdsong: songbirds as a model for basic applied medical research.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 489-517 (2013).</li><li>Mayer, U., Watanabe, S., Bischof, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+memory+and+the+avian+hippocampus:+Research+in+zebra+finches.">Spatial memory and the avian hippocampus: Research in zebra finches.</a> J Physiol Paris. , (2012).</li><li>Warren, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+a+songbird.">The genome of a songbird.</a> Nature. 464, 757-762 (2010).</li><li>Agate, R. J., Scott, B., Haripal, B., Lois, C., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+songbirds+offer+an+opportunity+to+develop+a+genetic+model+for+vocal+learning.">Transgenic songbirds offer an opportunity to develop a genetic model for vocal learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17963-17967 (2009).</li><li>Birkhead, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+incubation+and+early+hatching+in+brood+parasitic+birds.">Internal incubation and early hatching in brood parasitic birds.</a> Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 278, 1019-1024 (2011).</li><li>Haesler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxP2+expression+in+avian+vocal+learners+and+non-learners.">FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners.</a> J Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).</li><li>Godsave, S. F., Lohmann, R., Vloet, R. P. M., Gahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptors+in+the+embryonic+zebra+finch+hindbrain+suggest+a+function+for+maternal+androgens+in+perihatchingsurvival.">Androgen receptors in the embryonic zebra finch hindbrain suggest a function for maternal androgens in perihatchingsurvival.</a> Journal of Comparative Neurology. 453, 57-70 (2002).</li><li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick;+a+great+model+system+becomes+even+greater.">The chick; a great model system becomes even greater.</a> Dev Cell. 8, 9-17 (2005).</li><li>Kuenzel, W. J., Medina, L., Csillag, A., Perkel, D. J., Reiner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+subpallium:+new+insights+into+structural+and+functional+subdivisions+occupying+the+lateral+subpallial+wall+and+their+embryological+origins.">The avian subpallium: new insights into structural and functional subdivisions occupying the lateral subpallial wall and their embryological origins.</a> Brain Research. 1424, 67-101 (2011).</li><li>Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+chicken+embryology+to+the+understanding+of+vertebrate+limb+development.">The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development.</a> Mech Dev. 121, 1019-1029 (2004).</li><li>Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rediscovering+the+chick+embryo+as+a+model+to+study+retinal+development.">Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development.</a> Neural Development. 7, (2012).</li><li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development.">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenet Genome Research. 117, 231-239 (2007).</li><li>Murray, J. R., Varian-Ramos, C. W., Welch, Z. S., Saha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryological+staging+of+the+zebra+finch,+Taeniopygia+guttata.">Embryological staging of the zebra finch, Taeniopygia guttata.</a> J Morphol. , (2013).</li><li>Hawkins, P., Morton, D. B., Cameron, D., Cuthill, I., Francis, R., Freire, R., Gosler, A., Healy, S., Hudson, A., Inglis, I., Jones, A., Kirkwood, J., Lawton, M., Monaghan, P., Sherwin, C., Townsend, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+birds:+refinements+in+husbandry+and+procedures.+Fifth+report+of+BVAAWF/FRAME+/RSPCA/UFAW+Joint+Working+Group+on+Refinement.">Laboratory birds: refinements in husbandry and procedures. Fifth report of BVAAWF/FRAME /RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement.</a> Lab Anim. , (2001).</li><li>Pearse II, R. V., Esshaki, D., Tabin, C. J., Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+expression+analysis+of+intra-+and+extraarticular+connective+tissue.">Genome-wide expression analysis of intra- and extraarticular connective tissue.</a> Journal of Orthopaedic Research. 27, 427-434 (2009).</li><li>Pizard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridization+and+detection+of+RNAs+in+vertebrate+embryos+and+isolated+organs.">Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 66, (2004).</li><li>Warren, M., Puskarczyk, K., Chapman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+proliferation+studies+using+EdUlabeling.">Chick embryo proliferation studies using EdUlabeling.</a> Developmental Dynamics. 238, 944-949 (2009).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+syntesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA syntesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Hoogesteijn, A. L., DeVoogd, T. J., Quimby, F. W., De Caprio, T., Kollias, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+impairment+in+zebra+finches+(Taeinopygia+guttata).">Reproductive impairment in zebra finches (Taeinopygia guttata).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 24, 219-223 (2005).</li><li>Winter, V., Williams, T. D., Elliott, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-generational+study+of+In+ovo+exposure+to+PBDE-99+in+the+zebra+finch.">A three-generational study of In ovo exposure to PBDE-99 in the zebra finch.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 32, 562-568 (2013).</li><li>Kitulagodage, M., Buttemer, W. A., Astheimer, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adverse+effects+of+fipronil+on+avian+reproduction+and+development:+maternal+transfer+of+fipronil+to+eggs+in+zebra+finch+Taeinopygia+guttata+and+in+ovo+exposure+in+chickens+Gallus+domesticus.">Adverse effects of fipronil on avian reproduction and development: maternal transfer of fipronil to eggs in zebra finch Taeinopygia guttata and in ovo exposure in chickens Gallus domesticus.</a> Ecotoxicology. 20, 653-660 (2011).</li><li>Hallinger, K. K., Zabransky, D. J., Kazmer, K. A., Cristol, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birdsong+differs+between+mercury-polluted+and+reference+sites.">Birdsong differs between mercury-polluted and reference sites.</a> The Auk. 127, 156-161 (2010).</li><li>Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+in+situ+Hybridization+for+Detecting+Diverse+Gene+Expression+Patterns+in+Tissue.">Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li><li>Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+Avian+Brain+Chimeras+Reveal+That+Large+Brain+Size+Differences+Are+Influenced+by+Cell&#8211;Interdependent+Processes.">Interspecies Avian Brain Chimeras Reveal That Large Brain Size Differences Are Influenced by Cell&#8211;Interdependent Processes.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Chen, C. C., Winkler, C. M., Pfenning, A. R., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+the+developing+avian+telencephalon:+Regional+timing+and+brain+subdivision+continuities.">Molecular profiling of the developing avian telencephalon: Regional timing and brain subdivision continuities.</a> The Journal of Comparative Neurology. 521, 3666-3701 (2013).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

פיתוח אחרונים של מדריך עובריים בימוי 22 וביאור הגנום לעשות פינק הזברה אורגניזם מודל רצוי למחקרים התפתחותיים. עם זאת, בגודל ושבריריות הקטן של העוברים פינק זברה, אשר נעו מ 3 עד 7 מ&quot;מ בשלבי 1 - 10 22, יכולים לעשות והניתוחים קשים 11, 14. איתור והסרה נקיה עוברים מפני שטח של החלמון יכול להיות מאתגר. פרוטוקול זה מספק פירוט מספיק כדי לבצע את ההליך בקלות. פרוטוקול זה מדגים את השלבים הקריטיים, כי הם בדרך כלל לא ידועים, אך נחוצים כדי להבטיח לנתיחה מוצלחת. לדוגמא, זה הכרחי כדי להשאיר שכבה קטנה של חלמון בין העובר והגיליון לשקול נייר כדי למנוע דבק. שני זיהוי וההסרה של העובר יכולים להיות קשים. כדי לפתור זיהוי העובר על פני השטח של החלמון, להאיר ישירות מעל החלמון אחרי זה ישהוסר מהביצה, ולהסתכל על החלמון בזווית של ° 45 למצוא את העובר. ברגע שהעובר נמצא, לחתוך את החלמון בשוקל נייר נזהר שלא לקרוע את העובר. אם יישומים נוספים כוללים הדמיה להבדלים אנטומיים, הכלאה באתר, או מבחני התפשטות תאים, חשוב להסיר את קרום vitelline בשלב 1 - 8 22 להדמיה טובה יותר של מבנים. אם נתקל בקשיים בעת הסרת החלמון או קרום vitelline בשלבים מוקדמים, לתקן את העובר בPFA 4% לפני שטיפה ב1X PBS להפחתת שבירות עוברית. על ידי הסרת ראשונה קרום vitelline במהלך הנתיחה כפי שתואר, מבנים גלויים לעין וללא שינוי בעוברים פינק זברה לאחר ביצוע הכלאה באתרו. הגבלה של edu היא ממשל שכרכי מינון מעל 478 מוביל NL הרוג עוברי. עם זאת, טווח המינון העצום מאפשר varyinרמות גרם של תיוג תא שגשוג. התגובה &quot;לחץ&quot; בשימוש בערכה זו היא הנחושת (AAC Cu (I)) (I) האיץ-alkyne-תזיד-cycloaddition. בתגובה הספציפית הזה, מולקולה אנלוגית תימידין המכיל alkyne (edu) משולבת באופן פעיל על ידי חלוקת תאים. קבוצת alkyne בedu בולטת החוצה ממבנה הסליל של ה-DNA, והוא זוהה על ידי חשיפה למולקולה אזיד מצומד למולקולה ירוקה, ניאון אשר נקשר לקבוצת alkyne בחינם. הקרינה הירוקה מראה תאים מתרבים לאחרונה בעובר. יו orthogonality של אזיד והקבוצות alkyne מונעים כתמים שאינם ספציפיים, כי מינים תגובתי אלה אינם נוכחים באופן טבעי ביצורים. כמו כן, כי ה-DNA לא צריך להיות מפוגל על מנת שהתגובה להתרחש, ניתוח ה-DNA תלוי נוסף יכול להיות מבוצע 27 בקלות. מגבלה המובנית של שיטה זו היא בגודל הקטן וFragility של עוברים פינק זברה. הסרת קרום vitelline של עוברים בשלבים 1 - 15 22 יכול לגרום למבנים עובריים מזיקים אם אינו מבוצע בזהירות. עם זאת, פרוטוקול זה מפשט את השיטה לנתיחה, ומאפשר לחוקרים להשתמש בשלבים עובריים מוקדם לבחון אנומליות מבנית וביטוי גנים שלא נחקר בעבר בעומק. פרוטוקול זה מפותח את הדרך לשפע של מבחני סלולריים מולקולריים שיאפשר לחוקרים לקבוע את מקורותיה ההתפתחותי של פנוטיפים מבוגרים. לדוגמא, ניתן יהיה לבחון ביטוי גנים מעורב בלמידה ווקאלית בתנאים סביבתיים שונים או בעקבות טיפולים תרופתיים בשלבים המוקדמים של פיתוח 28, 29,30,31. למרות שלא הפגין במאמר זה, בשיטה זו פוטנציאל המאפשרת להליכים אחרים כגון רדיואקטיביים הכלאה באתרו על סעיפי זברה פינק רקמות וelectroporation / באובניתוח o 32, 33,34. בהתחשב בכך שפנק הזברה כבר נקבע כאורגניזם מודל חשוב בתוך גוף עצום של ספרות, במחקרים מסוג הזדמנויות שלא נוצל לקשר מנגנוני התפתחות בפיזיולוגיה והתנהגות בוגרים, בפרט התפתחות השפה 7, 9.

המטרה הכללית של טכניקה זו היא להשיג פינק זברה עוברים (guttata Taeniopygia) החל מהשלבים המוקדמים של עובר לשימוש במגוון רחב של מחקרים התפתחותיים. זברה פינק הפכו אורגניזם מודל ציפור שיר הדומיננטי והיה בשימוש נרחב במגוון תחומים, ובם רעלים 1,2, התנהגות 3, זיכרון ולמידת 4,5,6, neuroanatomy ההשוואתי 7,8, והתפתחות שפת 9,10 . כציפור השיר רק עם הגנום רצף, פינק הזברה מאפשר מחקר מולקולרי והגנטי של סדר הציפורי השיר, אשר מייצג מעל 50% ממיני ציפורים ידועים 11, 12,13. למרות השימוש במבוגרים ופנקו זברה לנוער במגוון רחב של תחומים, כמה מחקרים שבוצעו בעוברים פינק זברה, במיוחד בשלבים מוקדמים של פיתוח. זו ניתן לייחס לגודל הקטן של הביצים שלהםnd עוברים, והמעמד החדש שלהם כ14,15,16 אורגניזם מודל למחקרים בהם את העוף (Gallus Gallus domesticus) שימש בעבר כ17,18,19,20,21 מערכת מודל דומיננטית. עם זאת, כלומדים שאינם קולניים, תרנגולות אינן מערכת מודל מתאימה ללימוד הבסיס הגנטי של למידה ווקאלית, פיתוח של למידה ווקאלית, תורשתיות, התנהגות, ומעגלי הגרעינים הבזליים-קליפת המוח המעורב בלמידה מוטורית 10. חשוב לציין כי עוברים פינק זברה הם הרבה יותר עדין ויותר בקלות נפגע מעובר חומוס במהלך נתיחה ונהלים מולקולריים. בפרט, נדרשת זהירות רבה יותר בעת ביצוע פעולות permeabilization על עוברים פינק זברה. דטרגנטים חזקים ואנזימים שלא יפגעו עובר אפרוח יכולים לפגוע בעוברים פינק זברה. במונחים של טיפול באופן כללי, יש צורך לשים את הביצים פינק זברה בכוסות קטנות לפני ההשמה בחממהכדי למנוע מהם לפרוץ כאשר מתגלגלים במהלך דגירה. זברה פינק נוחות למחקרים התנהגותיים, בקלות ובשטף גדול מתרבים בכל ימות שנה בשבי, והם לומדים ווקאלי. מאפיינים אלו מאפשרים את השימוש של פינק זברה כדי לענות על הצורך לאורגניזם מודל המשלב פיתוח, גנטיקה, והיבטים התנהגותיים של שפה. ניתוחי שיטות, כמפורט להלן, בשילוב עם מדריך הזמני שפותח לאחרונה ספציפי לפנק זברה 22, להפיק את פינק הזברה אורגניזם מודל ההתפתחותי סטנדרטי שימושי יותר ויותר. עם זאת, קבלת עוברים בשלבים מוקדמים יכולה להיות מרתיעה. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לקבל עוברים בראשית התפתחות בקלות. מחקרים חוקרים את ההתפתחות המוקדמת ואת הבסיס ההתפתחותי המולקולרי של התנהגויות מורכבות בפנקו זברה, או את השפעות טוקסיקולוגי בפיתוח בקטן אחרים, ציפורים passerine ימצאו המתודולוגיה לנתיחה זה שימושי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chicken egg incubator</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10337</td>
			<td>Detection of cell proliferation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Olympus SZ61</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7&#39;&#39; Drummond capillary for Nanoject II injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-00-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drummond Nanoject II microinjector</td>
			<td colspan="2">Drummond</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont Tweezers #55</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td align="right">14099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Falcon tube (polypropylene)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-18&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastPrep Lysis Matrix H tubes</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>6917-100</td>
			<td>Used for RNA extraction, used to homogenize embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator)</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries&#160;</td>
			<td colspan="2">Fiber-Lite MI-150&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass vials with screw cap (DEPC treated)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge eppe tube (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Modeling Clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Narshige PB-7 needle puller</td>
			<td>Narshige</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Omni Bead Ruptor Homogenizer</td>
			<td style="width:71px;">OMNI International</td>
			<td>19-010</td>
			<td>Used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="3" height="25" style="height:25px;">4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 mL 8% PFA (32g paraformaldehyde, 350mL sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400mL sdd H2O), 20mL 2xPBS</td>
			<td>Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="4" height="25" style="height:25px;">Phosphate buffered saline (1xPBS): 200mL 10X PBS, 1800 mL Barnstead H2O, adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="4" height="25" style="height:25px;">Phosphate buffered saline (10xPBS): 800mL Barnstead, 2.013g KCL, 80.063g NaCl, 2.722g KH2PO4 monobasic, 14.196g Na2HPO4 dibasic, 200mL Barnstead H2O, adjust pH to 6.5</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="4" height="25" style="height:25px;">Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1xPTw): 1800mL Barnstead H2O, 200mL 10X PBS, adjust pH to 7.4, 2mL Tween-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35mL Plastic petri dish&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic wrap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prepease RNA Spin Kit</td>
			<td>PrepEase, Affymetrix</td>
			<td>78766 1 KT</td>
			<td>Used for RNA extraction, used to homogenize embryos</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Reaction Mix: 875&#956;L 1xPBS, 100mM 20&#956;L CuSO4 (Kit Component E), 5&#956;L Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100&#956;L diluted reaction buffer additive (Kit Component F)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10337</td>
			<td>Detection of cell proliferation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">sdd H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seed cup&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use it as a container when incubating eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel scalpel&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard nest box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Abba Plastic Finch Nestboxes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">4mL, Teflon Lined Cap, Glass Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-912-352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipettes (polyethylene)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4x4 weigh paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-898-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and downstream analysis of zebra finch embryos at early stages of development

פינק הזברה (guttata Taeniopygia) הפך אורגניזם מודל חשוב יותר ויותר בתחומים רבים של מחקר, כולל רעלים 1, 2, 3 התנהגות, וזיכרון ולמידת 4,5,6. כציפור השיר רק עם הגנום רצף, יש פינק הזברה פוטנציאל גדול לשימוש במחקרים התפתחותיים; עם זאת, מוקדם של פיתוח פינק זברה השלבים לא נחקרו היטב. היעדר המחקר בפיתוח פינק זברה ניתן לייחס את הקושי שלו לנתח את הביצה הקטנה ועובר. השיטה לנתיחה הבאה ממזערת את ניזק לרקמות עוברית, המאפשר חקירה של מורפולוגיה וביטוי גנים בכל שלבי התפתחות עוברית. זה מאפשר גם שדה בהיר והדמיה באיכות הקרינה של עוברים, השתמש בהליכים מולקולריים כגון הכלאה באתרו (ISH), מבחני התפשטות תאים, ומיצוי RNA למבחנים כמותיים כגון ריאה כמותייםl-Time PCR (qtRT-PCR). טכניקה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד שלבים מוקדמים של פיתוח, שהיו קשה בעבר לגישה.

הצעדים נתחו באיור 1 מצביעים על הופעתו של העובר בזמן שמחובר לממברנה vitelline () ולהדגים את השיטה הנכונה כדי להפריד את העובר מן החלמון (ב &#39;). העובר יכול להיות מזוהה על ידי האזור של צומת, שהוא הרבה יותר קל מאשר קרום vitelline. העובר עצמו הוא לעתים קרובות קשה להבחין עד החלמון הוא חתך משם. ברגע שהעובר הוא גזור מהביצה, זה יכול להיות קבוע או הבזק הוקפא לשימוש עתידי. אם הכלאה באתר מתוכנן לעובר גזור, יש צורך להסיר את קרום vitelline כי הוא דבק בעובר דרך האזור של צומת. איור 2 ממחיש את הנראות משופרות של העובר ברגע שקרום זה מוסר (ג), והדרך הנכונה לקלף את קרום vitelline (A, B). לאחר נתיחה וקיבעון, הר שלם הכלאה באתרו בוצע כפי שניתן לראות באיור 3 (, א &#39;, ב&#39;, ב &#39;&#39;) ואיור 4 (, א&#39;, ב &#39;, ב&#39;) ואיור 5 (A, B, C) ​​כדי לזהות הבדלים בorthodenticle homeobox 2 (ביטוי Otx2) בעוברים מבחינה התפתחותית שנחשפו למינונים נמוכים של מתיל כספי. איור 5 מראה תוצאות בדיקה תחושה, חוסר הפגנה של רקע. באיור 4, למרות היותו גזור מן הביצה באותה נקודת הזמן, את העובר מבחינה התפתחותית החשוף לתיל כספי (MeHg) התקדם שלב 5 22 (ב &#39;, ב&#39;), ואילו עובר השליטה פיתח לשלב 6 22 (, &#39;). הקבוצה של עוברים גזורים ומוצגת באיור 4 נאספו מהקן ולקחה מן החממה באותו הזמן. למרות שחלק וריאציה טבעית נמצאת בפיתוח, המבוסס על נתונים נתיחה קודמים, אין זה סביר כי תנודות טמפרטורה בחממה יגרמו רק את העוברים מהתיל כספיים עמודים לדקה 2.4 להיות develo<html> עיכב pmentally. ההבדלים בשלבים להצביע על שינויים בהתפשטות תאים בעוברים התפתחותית החשופים לתיל כספי. לפני הנתיחה, edu הוזרק ליום 2 ביצים ואיפשר לדגירת הלילה. לאחר נתיחה וקיבעון של השלב 16 22 עובר, edu היה דמיינו באמצעות &quot;לחץ על&quot; כימיה, המאפשר זיהוי של תאים מתרבים כפי שניתן לראות באיור 6 (A, B, C). חשוב לעקוב בקפידה נקודות זמן בעת ​​ביצוע ביצים באינקובטור ובמהלך הניתוחים, כמו חשיפה לתיל כספי או ביצוע assay edu עלול לשבש התקדמות התפתחותית. ההזרקה המוקדמת בוצעה ביום 0, אשר היה היום של איסוף כמפורט בשלב 1.3. העובר הזה היה גזור כ 38 שעות מאוחר יותר (שלב 7 22). שיעור ההישרדות נמצא כ 90% (שיעור זהה עובר בקרה), כל עוד סכום ההזרקה היה תחת 478 NL. &quot;Jove_content&quot;&gt; מתודולוגיה לנתיחה זו מאפשרת גם להפקת RNA באיכות גבוהה. לאחר לנתח שלב 16 22 עוברים, מיצוי RNA בוצע על פי הפרוטוקול של היצרן ללא אופטימיזציה הנדרשת, כפי שניתן לראות באיור 7. הסרת קרום vitelline הייתה מיותרת להפקת RNA, ומאוחר יותר יישומי qRT-PCR. הערה: כל נתוני העובר הם בכיוון, כך שהאזורים הקדמי והאחוריים הם בחלק העליון והתחתון של התמונות, בהתאמה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig1highres.jpg" /> איור 1. נוהל איתור ולנתח עוברים פינק זברה, שלבי 1-10 22. אתר עובר על ידי בעדינות מגלגל את החלמון עד לבן הדיסק הקלוש הוא לכאורה (א &#39;). ברגעעובר נמצא במרכזו של החלמון, החלמון הוא גזור באופן הדרגתי (ב &#39;) שבו החתך הראשון מקל על לחץ של קרום vitelline (1) וקיצוצים שלאחר מכן (2) גובל באזור של צומת (ZJ) שהוא דבק בקרום vitelline. ברים סולם מייצגים 1 מ&quot;מ. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig2highres.jpg" /> איור 2. הסרת קרום vitelline ונראות של מבנים עובריים. בעקבות ההסרה של העובר מהחלמון, עובר מקום בצלחת פטרי המכילה 4% PFA. אם הכלאה באתר צריכה להתבצע, נראות של המבנים העובריים היא חיוניות ויכולות להיות מושגת על ידי הסרת קרום vitelline (א &#39;). גריפ קרום vitelline עם קנס נוסף הטה מלקחיים ובעדינות לקלף אותו מעובר על ידי טיפול בעובר באופן ישיר בקצה החיצוני, במידת צורך(ב). הסרת קרום vitelline מגבירה בהירות של מבנים עובריים, ומאפשרת לעוברים להיות צילמו או מעובד עם הכלאה באתרו (C). ברים סולם מייצגים 1 מ&quot;מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51596/51596fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig3highres.jpg" /> איור 3. הר שלם הכלאה באתרו שבוצע על העוברים פינק זברה התפתחותית חשופים לתיל כספי. דפוסי ביטוי של orthodenticle homeobox 2 (Otx2) התאפיינו בעוברים שנחשפו ל0.0 תיל כספי עמודים לדקה (, &#39;) ו2.4 תיל כספי עמודים לדקה (ב&#39;, ב &#39; &#39;) באמצעות דיאטת הורים. המטלותrsal () וביטוי הגחון (א &#39;) של Otx2 גלוי לאורך שלפוחית ​​המוח התיכון והאופטי בשלב 22 12. עוברי קבוצת הטיפול נותחו באותה נקודת הזמן, אבל היו עיכוב התפתחותי כפי שניתן לראות בגב (B) ומבט הגחון (ב &#39;) של מבני ראש, אשר אופייניים לשלב 11 22 קיצורים:. MB, המוח התיכון; אופ, שלפוחית ​​אופטית. ברים סולם מייצגים 1 מ&quot;מ. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig4highres.jpg" /> איור 4. הר שלם &#160; באתר &#160; הכלאה בוצעה על העוברים פינק זברה התפתחותית החשופים לתיל כספי. דפוסי ביטוי של orthodenticle homeobox 2 (Otx2) אופיינו בשלב 6 22 אמברי<html> מערכת הפעלה חשופה לתיל כספי 0.0 עמודים לדקה (, &#39;) ושלב 5 22 עוברים שנחשפו ל2.4 תיל כספי עמודים לדקה (ב&#39;, ב &#39;) באמצעות דיאטת הורים. קיצורים: בבוקר, בשולים קדמי של המזודרם; לא, notochord, המזודרם notochord; פו, proamnion, blastopore הקדמי; ps, תכונה ראשונית 22. ברים סולם מייצגים 1 מ&quot;מ. <img alt="איור 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig5highres.jpg" width="600" /> איור 5. הר שלם באתרם &#160; הכלאה בוצעה על עוברים פינק זברה באמצעות בדיקה תחושה. () שלב 5 22 עובר. (ב &#39;) בשלב מוקדם 6 22 עובר. (C) שלב 11 עובר 22. ברים סולם מייצגים 1 מ&quot;מ. 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51596/51596fig6highres.jpg &quot;/&gt; איור 6. התאגדות edu וtection דה בעוברים פינק זברה. Edu &quot;לחץ&quot; כימיה הייתה בשימוש כדי לזהות תאים מתרבים בשלב 16 22 עובר (A, B, C). Edu הוא שולב DNA במקום של תימידין 26, 27 והוא זוהה באמצעות לחץ כימיה 27. התפשטות היא נראית בבירור בקצוות לרוחב של somites, וtailbud. לוח מראה ריבוי המתרחש באופן בלעדי באחורי של העובר וגם מראה תאי שגשוג פרט. הלוח ב &#39;מציג את מיקומי שגשוג בכל העובר. לוח ג מראה האזור הקדמי, ומציג את telencephalon השגשוג מאוד (TE) ביתר פירוט. קיצורים: af, לקפל מי שפיר; FLB, ניצן forelimb; HLB, ניצן hindlimb; le, שלפוחית ​​עדשה; ms, mesencephalon; הר, Metencephalon; OPC, גביע אופטי; הרשות, קשת בלוע; SM, המזודרם somite; שחפת, tailbud; te, telencephalon. ברים סולם מייצגים 1 מ&quot;מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51596/51596fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig7highres.jpg" /> איור 7. איכות של RNA המופק מעוברים גזורים פינק זברה. בקרה (0.0 עמודים לדקה) ו1.2 עוברי תיל כספיים עמודים לדקה נותחה ופלאש קפוא כפי שמתואר בשלב 3.8. כל נתיב מציג RNA המופק משני עוברים הומוגני מכל קבוצת טיפול.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development at JoVE.com

Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications.

נתיחה וניתוח במורד הזרם של הזברה פינק עוברים בשלבים מוקדמים של פיתוח

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and ...

dissection-downstream-analysis-zebra-finch-embryos-at-early-stages

Research

JoVE Journal

Biology

10.8K Views.  College of William and Mary. The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications. 

Video: Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissection של 6.5 עוברים DPC עכבר

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

הצבת פקטור מצופה חרוזים צמיחה על עוברי תרנגולת בשלב מוקדם

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

פרוטוקול לlentiviral התמרה וניתוח במורד הזרם של המעיים Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis כמודל לזיהוי תרגום ירידת ערך

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune system &#8212; such as neutrophils, dendritic cells, and macrophages &#8212; retain the innate ability to detect and clear such invading pathogens through phagocytosis1. Phagocytosis involves choreographed events of membrane reorganization and actin remodeling at the cell surface2,3. Phagocytes successfully internalize and eradicate foreign molecules only when all stages of phagocytosis are fulfilled. These steps include recognition and binding of the pathogen by pattern recognition receptors (PRRs) residing at the cell surface, formation of phagocytic cup through actin-enriched membranous protrusions (pseudopods) to surround the particulate, and scission of the phagosome followed by phagolysosome maturation that results in the killing of the pathogen3,4.
Imaging and quantification of various stages of phagocytosis is instrumental for elucidating the molecular mechanisms of this cellular process. The present manuscript reports methods to study the different phases of phagocytosis. We describe a microscope-based approach to visualize and quantify the binding, phagocytic cup formation, and the internalization of particulate by phagocytes. As phagocytosis occurs when innate receptors on phagocytic cells encounter ligands on a target particle bigger than 0.5 &#181;m, the assays we present here comprise the use of pathogenic fungi Candida albicans and other particulates such as zymosan and IgG-coated beads.

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

חזותי בשלבים המוקדמים של Phagocytosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...