Name: real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled bdnf in primary neurons
Uploaded: 2014-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons at JoVE.com

ברצוננו להודות ליואה (פאולין) הו, רחל Sinit לקבלת הסיוע הטכני שלהם. המחקר נתמך על ידי מענק NIH (EY016525 PN2) ועל ידי מימון מחקר תסמונת דאון וטיפול הקרן ולארי L. Hillblom הקרן.

הליכים כירורגיים ובעלי החיים מתבצעים אך ורק על פי מדריך NIH לטיפול ושימוש בחי מעבדה. כל הניסויים בתחום השימוש בבעלי החיים אושרו על ידי UCSD המוסדי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש. .1 פלסמיד שיבוט, ביטוי וטיהור של BDNF biotinylated-Mono (mBtBDNF) הערה: לבנות מראש proBDNFavi והבירה cDNA לתוך וקטור pcDNA3.1 וcoexpress בתאי HEK293FT 10. לטהר mBtBDNF באמצעות חרוזים Ni-נ.ת. ע על פי שיטה שפורסמה בעבר לייצר גורם בוגר ופעיל ביולוגי גדילה העצבית monobiotinylated (mBtNGF) 10. 2 הכנת לשכות Microfluidic מכשיר culturing נוירון microfluidic מאפשר לבודד את fluidically האקסונים מגופי תא נוירון. להרכיב תאים עם coverslips טרי מצופה נכון לפני כל נתיחה. תאי microfluidic משמשיםבפרוטוקול זה נרכש באופן מסחרי (ראה חומרים ושולחן של הציוד). כביסה ביד ותאים לרכוש מסחרי לשימוש חוזר עד 5-6x. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ידיים תאי microfluidic ב1% Alconox. לשטוף שלוש פעמים עם מים מילי- Q ל30 דקות כל אחד. תאים לשטוף ידיים שוב ב70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוציא תאים לייבוש על Parafilm בזרימה למינרית. להקרין ולעקר את שני הצדדים של התאים עבור 20 דקות תחת UV. חנות מעוקרת תאים בצלחת 15 סנטימטר סטרילי החתומה עם Parafilm בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 24 x 40 coverslips מ&quot;מ זכוכית מס &#39;1 במכל זכוכית. משרים את coverslips ב35% חומצת hydrochloride לילה על הכתף. ביום למחרת, לשטוף את coverslips שלוש פעמים ל30 דקות כל אחד עם מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את coverslips אחד אחד על ידי טבילת כל coverslip ל100% אתנול ובוער מעל מבער בונזן. אחסן coverslips היבש בצלחת פטרי סטרילית ולשמור אותו בטמפרטורת חדר עד ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח out coverslips בצלחת תרבות 15 סנטימטר. מעיל כל coverslip עם 0.7 מ&quot;ל של 0.01% פולי-L-ליזין (PLL) ו דגירה במכסת המנוע בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, לשטוף את coverslips שלוש פעמים עם מים סטריליים. coverslips יבש עם ואקום ומקום כל coverslip לתוך צלחת תרבות 6 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להרכיב את תא microfluidic, למקם את החדר עם צד microgroove בתחתית על coverslip המצופה PLL בזהירות לא לגעת בmicrogrooves. לחץ בעדינות את התא עם קצה פיפטה כדי להבטיח את התא היה סגור היטב. </li></ol> .3 Dissection עצבי תרבות ופלייט על צ&#39;יימברס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים שתי hippocampi E17-E18 חולדה (מוח אחד) גזור בצינור חרוטי 15 מ&quot;ל המכיל 2 מ&quot;ל חיץ דיסקציה (HBSS, אין סידן, לא מגנזיום, עם 1% עט / סטרפטוקוקוס ו10 HEPES מ&quot;מ. שוטפים את הרקמות 3x עם 5 מ&quot;ל נתיחת חיץ בכל פעם. הסר את החוצץ לנתיחה ככל האפשר ולהוסיף 900 ​​μl של di הטריחיץ ssection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעכל את הרקמה, להוסיף של 10x טריפסין (2.5%) 100 μl למאגר לנתיחה כדי להפוך את ריכוז העבודה 1x. מניחים את צינור חרוטי באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לאחר 10 דקות של עיכול, להוסיף 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​DNase אני 100 μl לריכוז סופי סביב 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה זכוכית פסטר אש מלוטשת, בעדינות triturate הרקמות על ידי pipetting למעלה ולמטה 5-10x. מייד לאחר טחינה דקה, להרוות את טריפסין עם 2 מ&quot;ל ציפוי בינוני (Neurobasal עם 10% FBS, 2 מ&quot;מ Glutamax, B27 2%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את המדגם במכסת המנוע למשך 5 דקות כדי לאפשר לכל פסולת של הרקמות להתיישב לתחתית. מוציא בזהירות 2 מ&quot;ל של supernatant לתוך צינור נקי סטרילי 15 מ&quot;ל חרוטי ו צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות עד גלולה התאים. Resuspend גלולה ב50 תקשורת μl ציפוי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים עם hemocytometer. עומס 15-20 השעיה μl תא (~ 40,000 תאים) לתוך תא אחד של חדר microfluidic. מניחים את החדרבחממה במשך 10 דקות, כדי לאפשר לתאים לצרף לcoverslip. לאחר 10 דקות, להוסיף מדיה ציפוי יותר כדי למלא את שני התאים של החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום השני של נתיחה, להחליף לחלוטין את תקשורת הציפוי עם תקשורת תחזוקה (Neurobasal עם 2 מ&quot;מ Glutamax, B27 2%) בשני גוף התא ותא האקסון. האקסונים מתאי העצב בהיפוקמפוס להתחיל לחצות את microgrooves ביום 3 ולהגיע לתא האקסון בין היום 5-7. בתקופה זו של זמן, להחליף מחצית תקשורת culturing עם תקשורת תחזוקה טריות בכל שעה 24 ~ 48. </li></ol> .4 Axonal תחבורה של QD-BDNF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני גר הדמיה תחבורת axonal QD-BDNF, לרוקן BDNF משני גוף התא והאקסון תאים של חדר microfluidic על ידי ביסודיות לשטוף את שני התאים עם תקשורת BDNF ללא, סרום חופשית Neurobasal כל 30 דקות לשעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך דלדול BDNF, להכין conjugates QD-BDNF. מערבבים 50 ננומטר של BD מונו biotinylatedדימר NF עם 50 conjugates QD655-streptavidin ננומטר בתקשורת neurobasal ולדגור על קרח למשך 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה בתא האקסון ולהוסיף 300 μl QD-BDNF עם ריכוז סופי של 0.25 ננומטר במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס. כדי למזער את לשדר של QD-BDNF לתוך תא גוף תא, זה מאוד חשוב תמיד לשמור על רמה גבוהה יותר של תקשורת בתא גוף תא מאשר בתא האקסון. לשטוף QD-BDNF מאוגד לאחר דגירה לפני ההדמיה לחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הדמיה חיה של תחבורת QD-BDNF באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מצוידת בעדשה אובייקטיבית שמן 100X. לחמם את ההיקף והתא הסביבתי קשור אליו לטמפרטורה קבועה (37 מעלות צלזיוס) וCO 2 (5%). השתמש בסט של קוביות עירור / פליטה האדומה טקסס כדי להמחיש את אות QD655. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש וללכוד זמן לשגות תמונות בתוך האקסונים האמצע במהירות של 1 מסגרת / שנייה עבור הסכום כולל של 2 דקות באמצעות מצלמת CCD. microgrooves שימוש ללא האקסונים thaלא צריכים שום QD ולכן אין אות כביקורת לחדירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח תחבורת BDNF באמצעות כל תוכנת ניתוח תמונה או NIH ImageJ. </li></ol>

<ol>
	<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+dynein-microtubule+network+is+required+for+NGF+signaling+through+the+Rap1/MAPK+pathway.">A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway.</a> Traffic. 8, 1503-1520 (2007).</li><li>Wortzel, I., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ERK+Cascade:+Distinct+Functions+within+Various+Subcellular+Organelles.">The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles.</a> Genes &amp; cancer. 2, 195-209 (2011).</li><li>Huang, E. J., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trk+receptors:+roles+in+neuronal+signal+transduction.">Trk receptors: roles in neuronal signal transduction.</a> Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).</li><li>Nonomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+and+survival+effects+of+BDNF+and+NT-3+on+cultured+cerebellar+granule+cells.">Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells.</a> Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).</li><li>Weissmiller, A. M., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+using+neurotrophic+factors+to+treat+neurodegenerative+disorders.">Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders.</a> Translational neurodegeneration. 1, 14 (2012).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+axonal+transport+of+Rab7+GTPase+results+in+dysregulated+trophic+signaling.">Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature methods. 2, 599-605 (2005).</li><li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+at+a+time,+live+tracking+of+NGF+axonal+transport+using+quantum+dots.">One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).</li><li>Xie, W., Zhang, K., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+and+axonal+transport+of+quantum+dot+labeled+BDNF.">Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).</li><li>Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+producing+mono-biotinylated,+biologically+active+neurotrophic+factors:+an+essential+reagent+for+single+molecule+study+of+axonal+transport.">A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport.</a> Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).</li><li>Tani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+a+ligand-receptor+complex+on+the+growth+cones+as+an+essential+step+for+the+uptake+of+nerve+growth+factor+at+the+distal+end+of+the+axon:+a+single-molecule+analysis.">Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).</li><li>Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-induced+internalization+of+the+p75+neurotrophin+receptor:+a+slow+route+to+the+signaling+endosome.">Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).</li><li>Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+nerve+growth+factor+carboxyl+terminus+in+receptor+binding+and+conformational+stability.">The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability.</a> The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).</li><li>Zuccato, C., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+in+neurodegenerative+diseases.">Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases.</a> Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).</li><li>Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+over-expression+in+the+forebrain+ameliorates+Huntington's+disease+phenotypes+in+mice.">Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice.</a> Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).</li><li>Gauthier, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+controls+neurotrophic+support+and+survival+of+neurons+by+enhancing+BDNF+vesicular+transport+along+microtubules.">Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules.</a> Cell. 118, 127-138 (2004).</li><li>Her, L. S., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sensitivity+of+striatal+neurons+to+axonal+transport+defects+induced+by+mutant+huntingtin.">Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).</li><li>Rong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+intracellular+trafficking+of+huntingtin-associated+protein-1+is+critical+for+TrkA+protein+levels+and+neurite+outgrowth.">Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריזו.

במחקר זה, אנו מדווחים על הפיתוח של שיטה חדשנית לייצור פעיל מבחינה ביולוגית, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) שניתן להשתמש בי להתחקות תחבורת axonal של BDNF. על ידי להטות את החלבון לstreptavidin נקודה קוונטית, ובאמצעות תא microfluidic, השיטה מאפשרת לאדם לזהות תחבורת axonal של BDNF בנוירונים עיקרי עם רגישות ...

נוירונים מקוטבים מאוד תאי תהליכים שארוכים, ולעתים קרובות הרחיב מאוד הם יסוד להקמה ולשמירה על המבנה והתפקוד של מעגלים עצביים. האקסון ממלא תפקיד חיוני בביצוע מטענים אל ומסינפסות. חלבונים ואברונים מסונתזים בסומה התא צריכים להיות מועברים דרך האקסונים להגיע מסוף presynaptic לתמוך תפקוד עצבי. במקביל, אותות המתקבלים באקסונים דיסטלי צריכים להיות transduced והועברו לסומה. תהליכים אלה הם חיוניים להישרדות עצבית, בידול, ותחזוקה. שבהובלת axonal בכמה נוירונים חייבת להתנהל דרך מרחקים יותר מ -1,000 פעמים הקוטר של גוף התא, את האפשרות שנחזתה בקלות שגם גירעונות קטנים יכולים במידה ניכרת להשפיע תפקוד עצבי ומעגל. המופק ממוח גורם neurotrophic (BDNF), חבר של משפחת neurotrophin של גורמי גדילה, הוא בהווה בmaאזורי ניו יורק במוח, כולל ההיפוקמפוס, קליפת מוח, ומוח קדמי בסיסי. BDNF ממלא תפקיד מכריע בהיווצרות הכרה וזיכרון על ידי תמיכה בהישרדות, בידול, והתפקוד של תאי עצב המשתתפים במעגלים קוגניטיביים. BDNF נקשר לקולטן שלו, TrkB טירוזין קינאז, במסוף האקסון שבו מפעיל מסלולי איתות בתיווך TrkB כוללים חלבון קינאז מופעל mitogen / קינאז תאי מוסדר אות החלבון (MAPK / Erk), phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) ופוספוליפאז C-gamma (PLCγ). החלבונים המשתתפים במסלולי איתות אלה ארוזים על גבי מבני לפוחי endocytic כדי ליצור את BDNF / TrkB איתות endosome 1-6 שלאחר מכן הובל retrogradely לסומה העצבית. חדר תרבות microfluidic הוא פלטפורמה מאוד שימושית לחקר הביולוגיה axonal בתנאים רגילים, כמו גם בהגדרה של 7,8 פציעה והמחלה. על ידי אקסונים בידודמהגופים התא, המכשיר אפשר אחד ללמוד תחבורה במיוחד באקסונים 8-10. פלטפורמות microfluidic מבוססות PDMS עם 450 מיקרומטר מחסומי microgroove שימשו במחקר זה נרכשו באופן מסחרי (ראה טבלת חומרים). כדי לבחון תחבורת BDNF, שפיתחנו טכנולוגיה חדשנית לייצור BDNF monobiotinylated (mBtBDNF). אנחנו ניצלנו את הפפטיד acceptor ביוטין, AP (הידוע גם בAviTag). זה רצף חומצות אמינו המכיל 15 שאריות ליזין שניתן ligated במיוחד כדי ביוטין על ידי האנזים Escherichia coli ביוטין האנזים, בירה. אנחנו התמזגו AviTag לC-הסופי של העכבר מראש proBDNF cDNA על ידי PCR (איור 1 א). המבנה שובט לתוך וקטור הביטוי של יונקים, myc-וקטור pcDNA3.1. אנחנו גם משובטים DNA בירה החיידקים לתוך myc-וקטור pcDNA3.1. שני פלסמידים היו זמניים במשותף transfected לתאי HEK293FT לבטא שני החלבונים. בירה הייתה זרז לקשירה של ביובאופן ספציפי ליזין מתגורר בתוך AviTag בC-הסופי של BDNF ב1: 1 יחס לתוצרת monobiotinylated מונומר BDNF. Biotinylated, להתבגר BDNF עם מסה מולקולרית של ~ 18 kDa היה התאושש ומטוהר מהתקשורת באמצעות Ni-שרף (איור 1 ג). Biotinylation של BDNF היה מלא, כמו להישפט על ידי חוסר היכולת לזהות BDNF ללא שינוי על ידי immunoblotting (1D איור). נקודות streptavidin מצומדות קוונטים, QD 655, שמשו לתייג mBtBDNF לעשות QD-BDNF. הנוכחות של AviTag לא להפריע לפעילות של BDNF כmBtBDNF הייתה מסוגלת להפעיל TrkB פוספורילציה (איור 1E) ולעורר תולדת neurite (איור 1F) בהיקף של BDNF רקומביננטי האנושי (rhBDNF). Immunostaining הראה כי QD-BDNF colocalized עם TrkB באקסונים בהיפוקמפוס, המצביע על כך QD-BDNF הוא ביו (איור 1G). ללמוד תחבורת BDNF, QD-BDNF התווסף לתא האקסון הדיסטלי שלתרבויות microfluidic מכילות חולדה נוירונים בהיפוקמפוס (איור 2 א) E18. תחבורה מדרדר QD-BDNF בתוך האקסונים נתפסה על ידי הדמיה חיה בזמן אמת של תג הניאון האדום (S1 תמיכת קטעי וידאו, S2). על ידי ניתוח רשם גלים שנוצרו, QD-BDNF נצפה להיות מועבר retrogradely במהירות מרגשת של כ 1.06 מיקרומטר / sec (איור 3 א). GFP או BDNF מתויג mCherry היה בשימוש כדי לעקוב אחר תנועת axonal של BDNF. החסרונות העיקריים הם שהם לא בהירים מספיק ללימודי מולקולה בודדים. כמו כן, הנוכחות של שני אנטרוגדית ותנועות BDNF המדרדר עושה את זה קשה להעריך האם או לא BDNF מועבר retrogradely היה במתחם neurotrophin / קולט. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הטכניקות המשמשות לבחינת סחר בחיות של QD-BDNF בתאי microfluidic באמצעות נוירונים עיקרי. Ultrabrightness וphotostability מצוין של Mak נקודות קוונטיותes זה ניתן לבצע מעקב ארוך טווח של תחבורת BDNF. ניתן לנצל את הטכניקות הללו כדי לשפר את הלימודים של פונקצית axonal בספירה, HD, והפרעות ניווניות אחרות.

<table><tbody><tr><td>Platinum pfx DNA polymerase&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11708021</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI&amp;nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>FD0274</td><td></td></tr><tr><td>BamHI&amp;nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>FD0054</td><td></td></tr><tr><td>HEK293FT cells</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-high glucose media</td><td>Mediatech</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>D-biotin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>TurboFect&amp;nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>PMSF&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA resins</td><td>Qiagen</td><td>30250</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitors cocktail</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;S8820</td><td></td></tr><tr><td>Silver staining kit&amp;nbsp;</td><td>G-Biosciences</td><td>786-30</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant BDNF</td><td>Genentech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfluidic chambers</td><td>Xona</td><td>SND450</td><td></td></tr><tr><td>24 x 40 mm No. 1 glass coverslips&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>48393-060</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine&amp;nbsp;</td><td>Cultrex</td><td>3438-100-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>FBS&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>B27&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>QD655-streptavidin conjugates</td><td>Invitrogen</td><td>&amp;nbsp;Q10121MP</td><td></td></tr><tr><td>anti-Avi tag antibody</td><td>GenScript</td><td>A00674</td><td></td></tr><tr><td>streptavidin-agarose beads&amp;nbsp;</td><td>Life Technology</td><td>&amp;nbsp;SA100-04</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid</td><td>Sigma</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>HRP-streptavidin&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>N100</td><td></td></tr><tr><td>anti-pTrkB antibody</td><td>a generous gift from Dr M. Chao of NYU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-TrkB antibody</td><td>BD Science</td><td>610101</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled bdnf in primary neurons

BDNF ממלא תפקיד חשוב בכמה היבטים של הישרדות, בידול, ותפקוד עצביים. גירעונות מבניים ותפקודיים באקסונים נתפסים יותר ויותר כתכונה מוקדמת של מחלות ניווניות, כוללים מחלת אלצהיימר (AD) ומחלת הנטינגטון (HD). עדיין לא ברור הוא המנגנון (ים) שבו פציעת axonal מושרה. אנחנו דיווחו על ההתפתחות של שיטה חדשנית לייצור פעיל מבחינה ביולוגית, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) שניתן להשתמש בי להתחקות תחבורת axonal של BDNF. BDNF שכותרתו נקודה קוונטית (QD-BDNF) הופק על ידי והטה נקודה קוונטית 655 לmBtBDNF. מכשיר microfluidic שימש לבודד את האקסונים מגופי תא נוירון. תוספת של QD-BDNF לתא axonal אפשרה הדמיה חיה של תחבורת BDNF באקסונים. אנחנו הוכיחו כי QD-BDNF עבר בעצם באופן בלעדי retrogradely, עם מעט מאוד הפסקות, במהירות הנעה של כ 1.06 מיקרומטר / sec. מערכת זו יכולה לשמש כדי לחקור אותיchanisms של פונקציה שיבשו axonal בספירה או HD, כמו גם הפרעות ניווניות אחרות.

ייצור וטיהור של BDNF מונו biotinylated פעיל ביולוגית וקטור הביטוי של BDNF התמזגו עם רצף AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) נוצר על פי פרוטוקול שפורסם בעבר 10. המסה המולקולרית של חלבון היתוך באורך המלא הייתה צפויה להיות ~ 32V kDa <a href="http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html" targe...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons at JoVE.com

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

תחבורת axonal של BDNF, גורם neurotrophic, היא קריטית להישרדות והתפקוד של כמה אוכלוסיות נוירונים. כמה הפרעות ניווניות מסומנות על ידי שיבוש של מבנה ותפקוד עצב. אנחנו הדגמנו את הטכניקות המשמשות לבחינת סחר בחיות של QD-BDNF בתאי microfluidic באמצעות נוירונים עיקרי.

הדמיה של axonal תחבורה של Quantum בזמן אמת Dot-כותרת BDNF בנוירונים העיקרי

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

real-time-imaging-axonal-transport-quantum-dot-labeled-bdnf-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K Views.  University of California, San Diego.  תחבורת axonal של BDNF, גורם neurotrophic, היא קריטית להישרדות והתפקוד של כמה אוכלוסיות נוירונים. כמה הפרעות ניווניות מסומנות על ידי שיבוש של מבנה ותפקוד עצב. אנחנו הדגמנו את הטכניקות המשמשות לבחינת סחר בחיות של QD-BDNF בתאי microfluidic באמצעות נוירונים עיקרי....

Video: Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  Vital fluorescent probes, particularly green fluorescent protein (GFP) have revolutionized cell biology stemming from the ability to label specific intracellular compartments and cellular structures. For example, the live imaging of GFP (and its spectral variants) chimeras have allowed for a dynamic 
analysis of the cytoskeleton, organelle transport, and membrane dynamics in a multitude of organisms and cell types [1-3].  Although live imaging has become prevalent, this approach still poses many technical challenges, particularly in primary cultured neurons.  One challenge is the expression of GFP-tagged proteins in post-mitotic neurons; the other is the ability to capture fluorescent images while minimizing phototoxicity, photobleaching, 
and maintaining general cell health.  Here we provide a protocol that describes a lipid-based transfection method that yields a relatively low transfection rate (~0.5%), however is ideal for the imaging of fully polarized neurons.  A low transfection rate is essential so that single axons and dendrites can be characterized as to their orientation to the cell body to confirm directionality of transport, i.e., anterograde v. retrograde.  Our approach to imaging 
GFP expressing neurons relies on a standard wide-field fluorescent microscope outfitted with a CCD camera, image capture software, and a heated imaging chamber. We have imaged a wide variety of organelles or structures, for example, dense-core vesicles, mitochondria, growth cones, and actin without any special optics or excitation requirements other than a fluorescent light source. Additionally, spectrally-distinct, fluorescently 
labeled proteins, e.g., GFP and dsRed-tagged proteins, can be visualized near simultaneously to characterize co-transport or other coordinated cellular events.  The imaging approach described here is flexible for a variety of imaging applications and can be adopted by a laboratory for relatively little cost provided a microscope is available.

Live cell imaging is of particular utility when studying the dynamics of organelle trafficking. Here we describe a protocol for live imaging of dense-core vesicles in cultured neurons using wide-field fluorescence microscopy. This protocol is flexible and can be adapted to image other organelles such as mitochondria, endosomes, and peroxisomes.

הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית ​​בתוך ראשי נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

Biology

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

זמן פקיעה הדמיה חיה הקוונפיקציה של הענף הדנדריטים המהירה בפיתוח של דרוזופילה נוירונים

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

An Improved Protocol to Purify and Directly Mono-Biotinylate Recombinant BDNF in a Tube for Cellular Trafficking Studies in Neurons

Recombinant BDNF containing an Avi sequence (BDNFAvi) is produced in HEK293 cells and then cost-effectively purified by affinity chromatography. A reproducible protocol was developed to directly&#160;mono-biotinylate BDNFAvi with the enzyme BirA in a tube. In this reaction, mono-biotinylated BDNFAvi retains its biological activity.
Neurotrophins are target-derived growth factors playing a role in neuronal development and maintenance. They require rapid transport mechanisms along the endocytic pathway to allow long-distance signaling between different neuronal compartments. The development of molecular tools to study the trafficking of neurotrophins has enabled the precise tracking of these proteins in the cell using in vivo recording. In this protocol, we developed an optimized and cost-effective procedure for the production of mono-biotinylated BDNF. A recombinant BDNF variant containing a biotinylable avi sequence (BDNFAvi) is produced in HEK293 cells in the microgram range and then purified in an easily scalable procedure using affinity chromatography. The purified BDNF can then be homogeneously mono-biotinylated by a direct in vitro reaction with the enzyme BirA in a tube. The biological activity of the mono-biotinylated BDNF (mbtBDNF) can be conjugated to streptavidin-conjugated to different fluorophores. BDNFAvi and mbtBDNF retain their biological activity demonstrated through the detection of downstream phosphorylated targets using western blot and activation of the transcription factor CREB, respectively. Using streptavidin-quantum dots, we were able to visualize mbtBDNF internalization concomitant with activation of CREB, which was detected with a phospho-CREB specific antibody. In addition, mbtBDNF conjugated to streptavidin-quantum dots was suitable for retrograde transport analysis in cortical neurons grown in microfluidic chambers. Thus, in tube produced mbtBDNF is a reliable tool to study physiological signaling endosome dynamics and trafficking in neurons.

Recombinant BDNF containing an Avi sequence (BDNFAvi) is produced in HEK293 cells in a cost-effective manner and is purified by affinity chromatography. BDNFavi is then directly mono-biotinylated with the enzyme BirA in a tube. BDNFavi and mono-biotinylated BDNFavi retain their biological activity when compared to commercially available BDNF.

פרוטוקול משופר כדי לטהר ו מונו ישירות-Biotinylate BDNF בתוך צינור ללימודי סחר בתאי הסלולר בנוירונים

Recombinant BDNF containing an Avi sequence (BDNFAvi) is produced in HEK293 cells and then cost-effectively purified by affinity chromatography. A ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

הדמיה וניתוח של תעבורת Neurofilament בעצב שוקה עכבר excised

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a powerful model system for the investigation of cell type-specific mechanisms of neuronal morphogenesis and connectivity. The organization and composition of retinal subtypes are well-defined, and genetic tools are available to access specific types during development. Many retinal cell types also constrain their dendrites and/or axons to narrow layers, which facilitates time-lapse imaging. Mouse retina explant cultures are well suited for live-cell imaging using confocal or multiphoton microscopy, but methods optimized for imaging dendrite dynamics with temporal and structural resolution are lacking. Presented here is a method to sparsely label and image the development of specific retinal populations marked by the Cre-Lox system. Commercially available adeno-associated viruses (AAVs) used here expressed membrane-targeted fluorescent proteins in a Cre-dependent manner. Intraocular delivery of AAVs in neonatal mice produces fluorescent labeling of targeted cell types by 4-5 days post-injection (dpi). The membrane fluorescent signals are detectable by confocal imaging and resolve fine branch structures and dynamics. High-quality videos spanning 2-4 h are acquired from imaging retinal flat-mounts perfused with oxygenated artificial cerebrospinal fluid (aCSF). Also provided is an image postprocessing pipeline for deconvolution and three-dimensional (3D) drift correction. This protocol can be used to capture several cellular behaviors in the intact retina and to identify novel factors controlling neurite morphogenesis. Many developmental strategies learned in the retina will be relevant for understanding the formation of neural circuits elsewhere in the central nervous system.

Here, we present a method for investigating neurite morphogenesis in postnatal mouse retinal explants by time-lapse confocal microscopy. We describe an approach for sparse labeling and acquisition of retinal cell types and their fine processes using recombinant adeno-associated virus vectors that express membrane-targeted fluorescent proteins in a Cre-dependent manner.

הדמיה בזמן לשגות של arborization עצבי באמצעות תיוג וירוסים דליל אדנו הקשורים של אוכלוסיות תאי רשתית ממוקדים גנטית

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

הרחבת ערכת הכלים להדמיית In Vivo של תחבורה אקסונלית

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal ...

Measuring Axonal Cargo Transport in Mouse Primary Cortical Cultured Neurons

Neuronal cells are highly polarized cells that stereotypically harbor several dendrites and an axon. The length of an axon necessitates efficient bidirectional transport by motor proteins. Various reports have suggested that defects in axonal transport are associated with neurodegenerative diseases. Also, the mechanism of the coordination of multiple motor proteins has been an attractive topic. Since the axon has uni-directional microtubules, it is easier to determine which motor proteins are involved in the movement. Therefore, understanding the mechanisms underlying the transport of axonal cargo is crucial for uncovering the molecular mechanism of neurodegenerative diseases and the regulation of motor proteins. Here, we introduce the entire process of axonal transport analysis, including the culturing of mouse primary cortical neurons, transfection of plasmids encoding cargo proteins, and directional and velocity analyses without the effect of pauses. Furthermore, the open-access software "KYMOMAKER" is introduced, which enables the generation of a kymograph to highlight transport traces according to their direction and allow easier visualization of axonal transport.

The present protocol describes the whole procedure of analysis for axonal transport. In particular, the calculation of transport velocity, not including the pausing, and the visualization method using open-access software "KYMOMAKER" are shown here.

Neuronal cells are highly polarized cells that stereotypically harbor several dendrites and an axon. The length of an axon necessitates efficient ...

<meta charset="utf8"></head><body>הדמיה של חלבונים בתאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס באמצעות הדמיה של תאים חיים

Using Live&#45;Cell Imaging to Measure the Effects of Pathological Proteins on Axonal Transport in Primary Hippocampal Neurons

Bidirectional transport of cargos along the axon is critical for maintaining functional synapses, neural connectivity, and healthy neurons. Axonal transport is disrupted in multiple neurodegenerative diseases, and projection neurons are particularly vulnerable because of the need to transport cellular materials over long distances and sustain substantial axonal mass. Pathological modifications of several disease-related proteins negatively affect transport, including tau, amyloid-&#946;, &#945;-synuclein, superoxide dismutase, and huntingtin, providing a potential common mechanism by which pathological proteins exert toxicity in disease. Methods to study these toxic mechanisms are necessary to understand neurodegenerative disorders and identify potential therapeutic interventions.
Here, cultured primary rodent hippocampal neurons are co-transfected with multiple plasmids to study the effects of pathological proteins on fast axonal transport using live-cell confocal imaging of fluorescently-tagged cargo proteins. We begin with the harvest, dissociation, and culturing of primary hippocampal neurons from rodents. Then, we co-transfect the neurons with plasmid DNA constructs to express fluorescent-tagged cargo protein and wild-type or mutant tau (used as an exemplar of pathological proteins). Axons are identified in live cells using an antibody that binds an extracellular&#160;domain of neurofascin, an axon initial segment protein, and an axonal region of interest is imaged to measure fluorescent cargo transport.
Using KymoAnalyzer, a freely available ImageJ macro, we extensively characterize the velocity, pause frequency, and directional cargo density of axonal transport, all of which may be affected by the presence of pathological proteins. Through this method, we identify a phenotype of increased cargo pause frequency associated with the expression of pathological tau protein. Additionally, gene-silencing shRNA constructs can be added to the transfection mix to test the role of other proteins in mediating transport disruption. This protocol is easily adaptable for use with other neurodegenerative disease-related proteins and is a reproducible method to study the mechanisms of how those proteins disrupt axonal transport.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: הבנת ההשפעה של חלבונים פתולוגיים על תחבורה אקסונלית במחלות נוירודגנרטיביות

Here, we demonstrate how to combine transfection of primary hippocampal rodent neurons with live-cell confocal imaging to analyze pathological protein-induced effects on axonal transport and identify mechanistic pathways mediating these effects.

הדמיה של axonal תחבורה של Quantum בזמן אמת Dot-כותרת BDNF בנוירונים העיקרי

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST