Funding was provided by the Joint Science and Technology Office &#8211; Chemical Biological Defense (JSTO-CBD) Defense Threat Reduction Agency (DTRA) under sponsor project number CCAR# CB3675 and National Institutes of Health (1 R21 AI101387-01 and 5 U01AI082051-05).

תאי הגזע העובריים של עכבר צלחת 20,000 הבדיל (MES) / גם ב96 צלחות ליזין מצופה פולי-D היטב ולשמור בתקשורת בידול מסוף הנוירון מוטורי 5-7 ימים. מנהל 1. מתחם ושיכרון בונט / לבצע את כל העבודה הבאה במתחם BSL2 על מנת לעמוד בהנחיות ה- CDC / NIH. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 פתרונות מניות מ&quot;מ של כל מתחם ספרייה ב100% DMSO בפוליפרופילן 96 צלחות גם. השתמש במניית 10 מ&quot;מ להכין צלחת דילול ביניים שהיא פי 10 גדולים יותר מריכוז ההקרנה הרצויה. הכן 100 צלחת ביניים אום על ידי מחלק 10 מניות מ&quot;מ לתוך צלחת 96-היטב ולדלל אותו ל -100 UM באמצעות תקשורת ותרבות. להפריש 10 μl של התרכובות על 90 μl של תקשורת על התאים 11. תבדוק את התרכובות בשעה 10 בריכוז סופי אום ולהבטיח את האחוז הסופי של DMSO אינו עולה על 0.5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את כל ההרבעהies שעושה שימוש בתאים חיים ורעלן פעיל ברמת בטיחות ביולוגית 2 תנאים. החלף את המדיה הישנה ב96-גם צלחות עם 80 μl של תקשורת בידול מסוף הטרי באמצעות פיפטה במדריך 12 ערוץ. לבצע שאיפה ולוותר צעדים על ידי שורות כדי למנוע חשיפה של התאים ללא תקשורת לאוויר הסביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pretreat תאים עם תרכובות שלפני היישום של רעלן על ידי תוספת של 10 μl של 10x תרכובות מצלחת המקור באמצעות פיפטה 12 ערוץ, ואחריו ערבוב על ידי שאיפה (פעמיים). לכל צלחת 96-היטב, לטפל בשני טורים של 6 בארות עם 10x DMSO המדולל בתקשורת כדי לשרת גבוהה כאות ובקרת אות נמוכה. הטור ללא טיפול בונט מציג את הרמה הגבוהה ביותר של האורך המלא SNAP-25 (שליטת אות גבוהה). פנק את הטור השני עם bont לבד (ללא כל תרכובות) כשליטת אות הנמוכה. השתמש שליטה נמוכה כדי לבחון את היעילות של המחשוף בונט של SNAP-25 וזיהוי שלה עם נוגדן BACS (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם תרכובות למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס ו -6% CO 2 בתרבית תאי החממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עצבי טוקסין מ1 מ&quot;ג / מיליליטר במקור מסחרי פוספט שנאגרו מלוח (PBS) למניות 10x סופיות עובדות על ידי דילול עם תקשורת בידול מסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום שיכרון על ידי הוספת 10 μl של 10x בונט / המניה לתוך בארות המיועדות לבקרת טיפול ואות נמוכה בעזרת פיפטה רבה (איור 2). פנק את הבארות יועדו כגבוהה שליטה עם תקשורת לבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את כל כלי הפלסטיק חד-פעמים ואחרות שבאים במגע עם בונט / במהלך המחקר על ידי טבילה בתמיסת היפוכלוריט 0.825% במים לפחות 20 דקות. לבצע את כל ההליכים בארונות בטיחות ביולוגיים ולטהר אזורי עבודה לפני ואחרי ניסויים עם 5% חומר ניקוי חיטוי חומרי ניקוי כגון פתרון MicroChem. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית הצלחות ברורה כדי לציין את הרעל וincubצלחות אכלו טופלו בnM 1 / L בונט / 4 שעה על 37 מעלות צלזיוס ו -6% CO 2 באינקובטור תרבית תאים. להציג שילוט מתאים כדי ליידע עמיתים שהרעל נמצא בשימוש במעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחנה בונט / מחשוף פרוטאוליטים על ידי קיבעון מתנול. הסר מדיה המכילה רעלן ותרכובות מכל טוב עם פיפטה רבה וזורקים בפתרון אקונומיקה 10%. להוסיף מתנול הקרח הקר (100 μl) ישירות לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר (RT) על מנת לאפשר קיבוע להתרחש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע, להתמודד בבטחה עם ריאגנטים המושלכים (נחשב מנוטרל) עם פרוטוקולי 1 רמת בטיחות ביולוגית וזורקים בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל מתנול ולהשתמש של PBS 100 μl לשטוף את התאים ורעננותם לפני immunostaining. בצע שני שוטף PBS נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה של הדבר, לעזוב את PBS בבארות, צלחות חותם עם סרט דבק microplate ולאחסן ב 4 ° C עד לניתוח. צלחות חנות ב 4 ° C FOr כמה ימים. </li></ol> 2. Immunostaining הליך immunostaining הוא, פעולה רב שלבי עבודה אינטנסיבית הכוללת מחזורים חוזרים ונשנים מגיב לוותר / לשאוב ושטיפת צלחת נרחבת שעלולות להוביל להקדמה האפשרית של השתנות intraplate וinterplate משמעותיות. גישה חצי אוטומטי מוחלת לחסוך את הזמן של אנשי מעבדה, להגדיל את תפוקת assay, ולמזער immunostaining שונות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתחנת עבודה אוטומטית מצויד בראש 96-היטב מסוגל להעביר נפחים של עד 250 μl ומשולב עם זרוע רובוטית תפסן לעבור מעבדתי למקומות שונים על הסיפון המודולרי (ראה חומרים וציוד) לפרוטוקול זה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסיפון מודולרית נועד לארח סוגים שונים של מעבדתי ויכול לתמוך בעד 11 פריטים בכל זמן נתון. מטפל microplate האוטומטית מצויד במערה microplate מגזין כפול כדי להחזיק ולתפעל עד 50 צלחות בכל מחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחנת העבודה האוטומטית ממוקמת בתוך ארון בטיחות ביולוגי Class II המיועד לציוד אוטומציה מעבדה כדי לספק לעקרות ובטיחות. עבור immunostaining האוטומטי, הסיפון מסודר כפי שמוצג באיור 3 כדי לאפשר גישה מגיב בהתאם לצורך וללא התערבות אדם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות טרום עומס המכילות תאים קבועים למגזין הצלחת ומעביר לסיפון כנדרש לפעילות טיפול נוזלי. השתמש מצויד עם 250 טיפים μl ראש 96 פיפטה כדי לשאוב PBS מהבארות עד 10 μl. Permeabilize קרומים תאיים כדי להקל על נוגדן מחייב למטרות תאיות עם חיץ permeabilization (0.1% Triton-X 100). לוותר חיץ permeabilization (100 μl) לתוך זה גם לפני החזרת הצלחות למגזין האחסון השני של מערה microplate לדגירת 15 דקות בטמפרטורת חדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חוצץ permeabilization וPEשטיפת צלחת rform עם PBS (פעמיים) כפי שתוארה לעיל בשלב 1.13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלב לשטוף האחרון, להסיר את PBS חיץ ולוותר של חיץ חסימה המכיל 1% בסרום סוס ו -0.1% Tween 20 בPBS 100 μl לכל microplates לפני החזרתן למגזין הצלחת 1 שעתי דגירה על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשני נוגדנים ראשוניים לimmunostaining: נוגדן BACS אנטי עכבר הארנב polyclonal, לגילוי אורך מלא אנטי-III נוגדן טובולין SNAP-25 וחד שבטי עכבר לצורך זיהוי של תאי עצב (ראה חומרים וציוד). לאחר 60 דקות של דגירה, להסיר את חיץ החסימה ולוותר 50 μl של 4ug / מיליליטר של נוגדן BACS ו0.5 מיקרוגרם / מיליליטר של III-טובולין בחסימת מאגר לכל הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 1 שעות ב RT להסיר את הנוגדנים הראשוניים ולשטוף 3 פעמים עם PBS של 100 μl מכיל 0.05% Tween (PBST). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש IgG אנטי עכבר שכותרתו עם אלקסה פלואוריד 647 לדמיין IgG -III טובולין ונגד הארנב מתויג עם אלקסה Fluor 568 לדמיין את נוגדן BACS. הכן שני הנוגדנים כדילול / מיליליטר 2 מיקרוגרם בחסימת מאגר ולוותר 50 μl של התערובת לתוך כל טוב. הערה: הנוגדנים משני שנבחרו לimmunostaining מסומנות עם fluorophores שונה ומאפשרת גילוי של אור הניאון נפלט באורכי גל שונים באמצעות ערוצים שונים בתוך הגלאי של Imager התוכן הגבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור שעה 1 ב RT. לשאוב את הנוגדנים משני ולשטוף 3 פעמים עם PBST של 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה של הדבר, להוסיף צבע של PBS המכיל Hoechst (32 מיקרומטר) 100 μl להכתים את ה- DNA לזיהוי גרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את הצלחות עם סרט בלתי חדיר אור כדי להגן על fluorophores מphotobleaching. ניתן לאחסן צלחות ב 4 &#160; ° C במשך שבועות ללא אובדן משמעותי של אות. </li></ol> 3. הדמיה הערה: בצע רכישת תמונה באמצעות תוכן גבוה ההדמיה SysTEM (ראה חומרים וציוד). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפרט של הגדרות Imager תוכן גבוהות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר סוג פלייט, פריסה, מספר תחומים, מטרה: גריינר u ברור, פורמט 96 גם, 16, 20X מים בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערוצים נבחרים: EX עירור גרעין: 405 ננומטר כערוץ 4; ציטופלסמה EX: 644 ננומטר כערוץ 2; EX אנטיגן הספציפי ערוץ נוגדן: 561 ננומטר כערוץ 3 וכוח עירור הגדרה של כל לייזר, ניסוי התקנה כמו 2 חשיפות, חשיפה 1 עם עירור אחד ב644 ננומטר, חשיפה 2 עם שני עירורים ב 405 ננומטר ו561 ננומטר. בחר binning כBin2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בבארות שליטה גבוהות לאופטימיזציה חשיפה בעוצמה המרבית כערוץ SNAP-25 ובארות שליטה נמוכות לעצמה מינימאלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את החשיפה, כך שהעצמה של כל ערוץ היא כמחצית מרמת הרוויה (2,000-2,500 יחידות יחסית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את מטוס Z האופטימלי בערוץ מסכת תא באמצעות סקריפט תיקון דלתא. ראה Figure 5 לתוצאות לאחר immunostaining והדמיה. נתוני יצוא לשרת שבי תוכנת ניתוח תמונה המתגוררת. </li></ol></li></ol> 4. ניתוח תמונה (איור 6) הערה: השלבים הבאים מתארים יישום של אלגוריתמי תוכנת קולומבוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אלגוריתם מתאים למגזר האובייקטים העיקריים (גרעינים). במידת הצורך, להתאים את סף רקע ופרמטרים לעומת זאת. תוכנת קולומבוס מספקת 4 שיטות זיהוי גרעינים. בחר את השיטה שגרעיני קטע בצורה מדויקת על ידי בחינה ויזואלית בדיקת גרעינים מפולחים (בF שיטת 6 א igure M נבחר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את אלגוריתם neurite (CSIRO neurite ניתוח 2) למגזר neurites אם נדרש, להתאים את הפרמטרים סף רקע ולעומת זאת להסרת רקע. ראה 6 ב איור לפרמטרים המשמשים לאיתור neurites. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את אזורי neurite (מגזרי neurite) basאד על אובייקטים משני (neurites) באמצעות הרחבת פיקסל -3 של ערוץ טובולין β-III (Alexa קמח 640) כמסכה (איור 6 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב עוצמת ערוצי האות (SNAP-25, (Alexa קמח 568) לאזור neurites וערוץ β-III טובולין (איור 6 ד &amp; 6-ה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פרמטרים רצויים ליצוא, כגון אורך neurite, עוצמות ממוצעת של SNAP-25, טובולין β-III, מספר גרעינים, מספר קטע neurite, וכו &#39;(6F איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת צלחות ממלגזות צלחת באמצעות הרובוט והעומס לImager התוכן הגבוה לרכישת תמונה. </li></ol> 5. ניתוח נתונים: כדי להעריך את חוסנו של assay נועד, לחשב את הפרמטרים הבאים מהניסוי מבוסס הצלחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אות (S) לרקע (B): S B = עוצמת אומרת עוצמת שליטת אות גבוהה) / אומר / שליטה אות נמוכה </li> &lt;li&gt; מקדמים שונה (CV) של אות ורקע (כדי למדוד את האחידות של האות הספציפית): קורות חיים = (סטיית תקן (/ ממוצע של מדגם SD)) * 100 (%), כדי לקבוע את השונות בטיפול נוזלי, ריאגנטים, וכו &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אות לרעש: S = (ממוצע עוצמת האות - אומר עוצמת שליטת אות נמוכה) / SD שליטה נמוכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב הגורם &quot;Z עם שיכרון מחצית מצלחת 96-היטב ושכרות מדומה של החצי השני. Z &#39;= 1 - 3 * (SD שליטה אות גבוהה + SD שליטה אות נמוכה) / (ממוצע של שליטת אות גבוהה - ממוצע של שליטת אות נמוכה). לניתוח נוסף של נתוני ההקרנה, לנרמל חלק מפרמטרי הגלם העיקריים על בסיס צלחת כדי לאפשר השוואה בין לוחות ובין ימים השונים של ניסויים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחוזים ממחשוף, המשקפים ירידה של האות הקשורים באורך מלא SNAP-25 זוהה על ידי נוגדן ספציפי (BACS):% מחשוף = 100% * (MEAעוצמת n שליטה אות גבוהה - עוצמת המדגם) / אומרת עוצמת שליטת אות גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחוזים מהעיכוב של מחשוף:% עיכוב = 100% * (עוצמת המדגם - אומר עוצמת שליטת אות נמוכה) / (ממוצע עוצמת שליטת אות גבוהה - כלומר עוצמת שליטת אות נמוכה). </li></ol>

<ol>
	<li>Lamanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+most+poisonous+poison.">The most poisonous poison.</a> Science. 130, 763-772 (1959).</li><li>Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Characterization+of+a+Novel+Botulinum+Neurotoxin+Type+H+Gene.">Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene.</a> J. Infect. Dis. , (2013).</li><li>Hakami, R. M., Ruthel, G., Stahl, A. M., Bavari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+ground:+assays+for+therapeutics+against+botulinum+neurotoxin.">Gaining ground: assays for therapeutics against botulinum neurotoxin.</a> Trends in microbiology. 18, 164-172 (2010).</li><li>Yersin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+synaptic+vesicle+fusion+proteins+explored+by+atomic+force+microscopy.">Interactions between synaptic vesicle fusion proteins explored by atomic force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8736-8741 (2003).</li><li>Dong, M., Tepp, W. H., Johnson, E. A., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescent+sensors+to+detect+botulinum+neurotoxin+activity+in+vitro+and+in+living+cells.">Using fluorescent sensors to detect botulinum neurotoxin activity in vitro and in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 14701-14706 (2004).</li><li>Stahl, A. M., Adler, M., and, C. B. M., Gilfillan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerating+botulism+therapeutic+product+development+in+the+Department+of+Defense.">Accelerating botulism therapeutic product development in the Department of Defense.</a> Drug Development Research. 70, 303-326 (2009).</li><li>Nuss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-based+assays+to+measure+botulinum+neurotoxin+serotype+A+activity+using+cleavage-sensitive+antibodies.">Development of cell-based assays to measure botulinum neurotoxin serotype A activity using cleavage-sensitive antibodies.</a> Journal of biomolecular screening. 15, 42-51 (2010).</li><li>Opsenica, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemotype+that+inhibits+three+unrelated+pathogenic+targets:+the+botulinum+neurotoxin+serotype+A+light+chain,+P.+falciparum+malaria,+and+the+Ebola+filovirus.">A chemotype that inhibits three unrelated pathogenic targets: the botulinum neurotoxin serotype A light chain, P. falciparum malaria, and the Ebola filovirus.</a> Journal of medicinal chemistry. 54, 1157-1169 (2011).</li><li>Opsenica, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthesis+of+2,5-bis(4-amidinophenyl)thiophene+derivatives+providing+submicromolar-range+inhibition+of+the+botulinum+neurotoxin+serotype+A+metalloprotease.">The synthesis of 2,5-bis(4-amidinophenyl)thiophene derivatives providing submicromolar-range inhibition of the botulinum neurotoxin serotype A metalloprotease.</a> European journal of medicinal chemistry. 53, 374-379 (2012).</li><li>Nuss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacophore+Refinement+Guides+the+Rational+Design+of+Nanomolar-Range+Inhibitors+of+the+Botulinum+Neurotoxin+Serotype+A+Metalloprotease.">Pharmacophore Refinement Guides the Rational Design of Nanomolar-Range Inhibitors of the Botulinum Neurotoxin Serotype A Metalloprotease.</a> ACS medicinal chemistry letters. 1, 301-305 (2010).</li><li>Kiris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies,+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery.">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem cell research. 6, 195-205 (2011).</li><li>Pellett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+targeting,+internalization,+and+biological+activity+of+a+recombinant+atoxic+derivative+of+botulinum+neurotoxin+A.">Neuronal targeting, internalization, and biological activity of a recombinant atoxic derivative of botulinum neurotoxin A.</a> Biochemical and biophysical research communications. 405, 673-677 (2011).</li><li>McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+neurons+are+a+novel,+highly+sensitive+tissue+culture+platform+for+botulinum+research.">Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research.</a> Biochemical and biophysical research communications. 405, 85-90 (2011).</li><li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimodal+modulation+of+the+botulinum+neurotoxin+protein-conducting+channel.">Bimodal modulation of the botulinum neurotoxin protein-conducting channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 1330-1335 (2009).</li></ol>

Krishna P Kota is an employee of Perkin Elmer Inc. Waltham, MA, that produces instruments and software used in this manuscript. The content of this publication does not necessarily reflect the views or policies of the U.S. Department of Health and Human Services, the U.S. Department of Defense, the U.S. Department of the Army, or the institutions and companies affiliated with the authors.

העוצמה הגבוהה של עצבי טוקסין והקלות היחסית של חימושם הביאה סיווגם כקטגוריה (העדיפות הגבוהה ביותר) סוכני biothreat על ידי המרכז האמריקאי לבקרת מחלות ומניעתן. למרבה הצער, אין FDA אישר תרופה נגד שכרות בונט לאחר רעלן הופנם על ידי תאי העצב המוטוריים. כל מנגנון druggable שמקדם את ההח?...

טוקסין החיידק Clostridium מייצר רעל עצב טוקסין, אחד מהרעלים הביולוגיים החזקים ביותר הידוע לאדם 1. ישנם 7 קפסיד bont מובהקים (בונט / AG). בונט / A-גאל לגרום שיתוק בצומת העצבית-שהרירית בשל proteolysis המורכבת מלכודת 2,3. proteolysis המלכודת מונעת איחוי שלפוחית-קרום מוליך עצבי, ולכן לוקים הנוירוטרנסמיטר exocytosis 4. יעד המלכודת הספציפי תלוי בסרוטיפ bont המסוים המעורב בתהליך שכרות. בונט / וונט / E תדבק SNAP-25 ואילו דבק בונט / C שני SNAP-25 וsyntaxin 5. Synaptobrevin ידבק קפסיד הנותרים (המכונה גם חלבון הקרום קשור-שלפוחיות (נצלנית). בונט / נבחר לפיתוח assay כפי שהוא אחראי לשיעור גבוה של בוטוליזם באופן טבעי ויש לו משך הזמן הארוך ביותר של פעולה 6. פיתוח של מולקולה קטנה תרופות נגד ונט / היא מטרה עיקרית לתכנית גילוי תרופות ו נצלה שיטות המבוסס על יעד מסורתיים לזהות מעכבי proteolytic האתר פעילים 7, 8-10. עם זאת, היצירה של מעכבי אתר פעילים עם פעילות קשת רחבה נגד קפסיד מרובה ויעילות לאחר החשיפה צפויה להיות מאתגרת. לכן יש לנו יישמתי גישה חדשנית, פנוטיפי תרופת גילוי שמשתמשת במחשוף בונט SNAP-25 כנקודת סיום פונקציונלית לזהות מולקולות קטנות שיכול לחסום שיכרון הנוירון מוטורי בתיווך בונט. SNAP-25 נדרש לשחרור הנוירוטרנסמיטר, כהשפלה של SNAP-25 הוא חיזוי של שיתוק וקטלני in vivo. לדוגמא, הקרנה מבוססת תאים עלולה להוביל לגילוי של מאפננים חדשים של גורמים הסלולר אחראים לאיון רעלן או עיכוב של מסלולי רעלן בתוך תאים ממוקדים. גורם חשוב בהתפתחות assay פנוטיפי הוא הבחירה של מודלים ביולוגיים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. Wדואר ואחרים תארו את הנוירונים עכבר גזע עוברי (ES) שמקורן בתאים מנוע כי לשחזר את האופי החיסוני של תאי עצב מוטוריים ראשוניים, ובכלל זה הביטוי של SNAP-25 11- 13. חשוב לציין, המערכות הסלולריות אלה רגישות מאוד לונט / שיכרון ולהפגין מחשוף תלוי-מינון של SNAP-25 בתגובה לגידול בריכוזי של רעלן 11,12. הנוירונים המוטוריים המובחן גם הם מיוצרים בכמויות שמספיקות לניתוח מבוסס צלחת תפוקה גבוהה ואפשרו את העיצוב של מערך של מבחני סלולריים. Assay פנוטיפי הוא שיטת immunofluorescence ניצול שני נוגדנים שונים לכמת מחשוף של באורך מלא בא לידי ביטוי באופן אנדוגני SNAP-25 במהלך ונט / שיכרון של תרבות הנוירון מוטורי עכבר. מסוף carboxyl ונט / נוגדן מחשוף רגיש (BACS) שמכיר באורך מלא רק SNAP-25 מאפשר ההערכה של bont proteolysis תיווך / של SNAP-25ביטוי במנוע עכבר נוירונים 10. תרשים סכמטי של assay HCI מתואר באיור 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="834">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:280px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Botulinum neurotoxin A&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Metabiologics</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:280px;">No catalog number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microtitre plates</td>
			<td style="width:180px;">Greiner&#160;</td>
			<td style="width:119px;">655946</td>
			<td style="width:280px;">Poly-D-Lysine 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">BACs antibody</td>
			<td style="width:180px;">Lampire Biological</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microchem</td>
			<td style="width:180px;">National&#160;</td>
			<td style="width:119px;">0255</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Methanol</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A412-20</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28908</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Horse serum</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16050</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">PE JANUS MDT Mini Automated Workstation</td>
			<td style="width:180px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">AJMDT01</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Opera</td>
			<td style="width:180px;">Perkin Elmer</td>
			<td>OP-QEHS-01</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">9002-93-1</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">BIII tubulin antibody</td>
			<td style="width:180px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">BAM1195</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tween 20</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P1379-1L</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342dye&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">3570</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antimouse IgG</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A21236</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Anti rabbit IgG</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A10042</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Columbus Image analysis software</td>
			<td style="width:180px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">Ver 2.4</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Spotfire</td>
			<td style="width:180px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">Ver 5.5</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Clorox bleach</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">18-861-284</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PlateStack</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high content imaging assay for identification of botulinum neurotoxin inhibitors

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.

נתונים מפקדים גבוהים ונמוכים יצרו שתי אוכלוסיות נפרדות עם ההבדל של שני חציונים עולה על 3 סטיות תקן (איור 7 א). המטרה של תהליך המיון היא למצוא תרכובות באוכלוסיית המדגם עם ערכים קרובים יותר לאוכלוסיית ביקורת חיובית, בהנחה של התפלגות נורמלית באוכלוסיית המדגם <stro...

Watch this Scientific Journal Video about A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors at JoVE.com

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

Assay הדמיה תוכן גבוה לזיהוי של טוקסין עצבי המעכבים

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

a-high-content-imaging-assay-for-identification-botulinum-neurotoxin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.5K Views.  Perkin Elmer Inc.. Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

Video: A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

ברזולוציה גבוהה תהודה מגנטית פונקציונלית שיטות המוח התיכון האדם

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

הדמיה תפקודית של השמיעתי Cortex בחתולים בוגרים באמצעות גבוהה שדה fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample testing. Rapid BoNT testing of foodstuffs is needed during outbreak forensics, patient diagnosis, and food safety testing while accurate potency testing is required for BoNT-based drug product manufacturing and patient safety. The widely used mouse bioassay for BoNT testing is highly sensitive but lacks the precision and throughput needed for rapid and routine BoNT testing. Furthermore, the bioassay&#39;s use of animals has resulted in calls by drug product regulatory authorities and animal-rights proponents in the US and abroad to replace the mouse bioassay for BoNT testing. Several in vitro replacement assays have been developed that work well with purified BoNT in simple buffers, but most have not been shown to be applicable to testing in highly complex matrices. Here, a protocol for the detection of BoNT in complex matrices using the BoTest Matrix assays is presented. The assay consists of three parts: The first part involves preparation of the samples for testing, the second part is an immunoprecipitation step using anti-BoNT antibody-coated paramagnetic beads to purify BoNT from the matrix, and the third part quantifies the isolated BoNT&#39;s proteolytic activity using a fluorogenic reporter. The protocol is written for high throughput testing in 96-well plates using both liquid and solid matrices and requires about 2 hr of manual preparation with total assay times of 4-26 hr depending on the sample type, toxin load, and desired sensitivity. Data are presented for BoNT/A testing with phosphate-buffered saline, a drug product, culture supernatant, 2% milk, and fresh tomatoes and includes discussion of critical parameters for assay success.

The BoTest Matrix botulinum neurotoxin (BoNT) detection assays rapidly purify and quantify BoNT from a range of sample matrices.&#160;Here, we present a protocol for the detection and quantification of BoNT from both solid and liquid matrices and demonstrate the assay with BOTOX, tomatoes, and milk.

בידוד וכימות של טוקסין עצבי ממטריצות מורכבות באמצעות מטריקס מבחני BoTest

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

ברזולוציה גבוהה<em&gt; In vivo</em&gt; פרוטוקול פילוח ידני לאדם בהיפוקמפוס תת תחומים באמצעות הדמיה בתהודה מגנטית 3T

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central nervous system of small animals. However, transdermal and transcranial neuroimaging is frequently affected by low sensitivity, image aberrations and loss of space resolution, requiring scalp or even skull removal before imaging. To overcome this challenge, a new protocol is presented to gain significant insights in brain hemodynamics by photoacoustic and high-frequency ultrasounds imaging with the animal skin and skull intact. The procedure relies on the passage of ultrasound (US) waves and laser directly through the fissures that are naturally present on the animal cranium. By juxtaposing the imaging transducer device exactly in correspondence to these selected areas where the skull has a reduced thickness or is totally absent, one can acquire high quality deep images and explore internal brain regions that are usually difficult to anatomically or functionally describe without an invasive approach. By applying this experimental procedure, significant data can be collected in both sonic and optoacoustic modalities, enabling to image the parenchymal and the vascular anatomy far below the head surface. Deep brain features such as parenchymal convolutions and fissures separating the lobes were clearly visible. Moreover, the configuration of large and small blood vessels was imaged at several millimeters of depth, and precise information were collected about blood fluxes, vascular stream velocities and the hemoglobin chemical state. This repertoire of data could be crucial in several research contests, ranging from brain vascular disease studies to experimental techniques involving the systemic administration of exogenous chemicals or other objects endowed with imaging contrast enhancement properties. In conclusion, thanks to the presented protocol, the US and PA techniques become an attractive noninvasive performance-competitive means for cortical and internal brain imaging, retaining a significant potential in many neurologic fields.

The present work describes a new protocol to perform non-invasive high-frequency ultrasound and photoacoustic based imaging on rat brain, to efficiently visualize deep subcortical regions and their vascular patterns by directing signals on skull foramina naturally present on animal cranium.

רקמת ריאה, כלי דם וחילוף חומרים בתדר גבוהים לא פולשני אולטראסאונד וphotoacoustic עכברוש Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

הדמיית תהודה מגנטית מבנית ברזולוציה גבוהה של תת-הקליפה&quot; האדם<I&gt; In vivo</I&gt; ולאחר המוות

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.

ניתוח תפוקה גבוהה של התנהגות גינקולוגיות וזמינותו האי דרוזופילה

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

פיתוח assay על כימות תוכן גבוהה של היווצרות צבירה של מוטציה בחלבון Sod1 בתאים חיים

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.