We thank Victor Marquez for providing DZNep.HCl and Scotty Bolling for manufacturing the bloodfeeders. The Mopti and SUA2La strains of An. gambiae were obtained from the Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). This work was supported by the Fralin Life Science Institute and the grant from National Institutes of Health 1R21AI094289 to Igor V. Sharakhov.

הערה: שלושה חלקים של הפרוטוקול מתארים את החשיפה המימית של תרופת DZNep ליתושי זחל, חשיפה מבוססת דם של DZNep לנשים בוגרות ללמוד את השפעתו של פוריות, ועיכוב hydrolase SAH ידי DZNep נמדד באמצעות טכניקת colorimetric פשוטה. ייצוג סכמטי של מבחני אלה מוצג באיור 1. 1. מבחני כילה נגד פיתוח והישרדות ילדותיים הערה: סעיף זה מסביר את השימוש בתרופה מסיס במים המשפיעה על התפתחות זחלי יתושים והישרדות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א האץ ביצי gambiae על 28 מעלות צלזיוס במים מזוקקים (DH O 2) וזחלי instar להם 2 nd אחוריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח DNAse שש היטב, צלחת תרבית תאים חופשית RNAse ולשפוך 10 מיליליטר DH 2 O היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר זחלי יתושים ב2 nd instar ולהוסיף 15 זחלים בכל טוב. לפני הוספת זחלי instar 2 nd לצלחת, עמ &#39;ut אותם על מגבת נייר במשך 2-3 שניות כדי להסיר עודפי מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארות תווית עם קלטות בצבעים באקראי ניסוי. לייבל 2 בארות לריכוז מבחן על כל צלחת (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן hydrochloride 1 מ&quot;מ DZNep פתרון מניות (MW = 298.73) על ידי המסת DZNep 0.3 מ&quot;ג ב 1 מיליליטר של DH 2 O. הוספת פתרון מניות של DZNep.HCl לבארות שכותרתו כדי להשיג ריכוז סופי של 0.5 מיקרומטר ו5.0 מיקרומטר. הערה: פתרון המניות יכול להיות מאוחסן על 4 ° C לטווח קצר (יום 1 לחודש) או -20 מעלות צלזיוס למשך זמן ארוך (יותר מאחד בחודש). הערה: תוספת של פתרון המניות לריכוזים האמורים לא תשנה את נפח מים בבארות באופן משמעותי. אולם במקרה של ריכוזים גבוהים בהרבה, רצוי לפזר את המתחם במדיום הזחל כדי למנוע דילול מיותר של המתחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כמות שווה של מזון דגי פתית היטב כל אחד. מכסה את הצלחתשל דגירה אותם ב 28 ° C באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את התמותה ליתושי זחל שטופל DZNep ואינו מטופלים לאחר תקופת חשיפה של 24 שעות. להסיר ולסלק כל זחלים מתים. חזור על הקלטה זה כל יום עד שכל קוביית הזחלים או pupate ולהתגלות כמבוגרים. רשום את הגודל של זחלים בכל יום שני, כלומר, יום 0, 2, 4, 6, 8, עד שהם pupate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את נתוני פיתוח ותמותת זחל באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטית הולמת. הערה: גרף עמודות ניתן להשתמש כדי לייצג את נתוני התמותה ב- Microsoft Excel. ניתוח רב משתני שונה (MANOVA) הופיע עם תוכנה כגון JMP או SPSS יגלה אם מינונים שונים של התרופה לגרום להישרדותם של זחלי יתושים שונים באופן משמעותי. </li></ol> 2. פוריות Assay על ידי מתן תרופות באמצעות מזין מלאכותי ליתושי נקבה הערה: סעיף זה מפרט את התוספת של התרופה לדםnd להאכיל אותו ליתושי נקבה בוגרים באמצעות מערכת מזין מלאכותית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את כלובי יתושים בוגרים עם מספר שווה של יתושים ממין זכר ונקבה לשליטה וכלוב מבחן. לספק 10% תמיסת סוכר ספוגים בכדורי צמר גפן לשני כלובים עד הנקבות מוכנים להאכלה (3-5 ימים הוא אופטימליים עבור אנופלס gambiae). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 שעות לפני האכלת הדם, להסיר את כדורי צמר גפן כדי להבטיח נקבות רעבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב שני מתקני האכלת דם מלאכותיים שמורכבים ממשפך הפוך רחב תחתית כוס (קוטר = 50 מ&quot;מ, אורך = 70 מ&quot;מ) ופלסטיק המקיף אטום עם דבק תעשייתי. צרף צינורות פלסטיק (קוטר = 7 מ&quot;מ) לשני שקעים &#39;מתקני ההאכלה (קוטר = 10 מ&quot;מ) באמצעות מחברים ליבוא ויצוא של מים. תווית שני מתקני ההאכלה כמו &quot;שליטה&quot; ו- &quot;5 מיקרומטר DZNep.&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בגוף חימום זמין מסחרי, הגדיר את התכנית להאכלה. ב&quot; תפריט &quot;ללכת&quot; הגדרות &quot;ובחר &quot;Setpoints&quot;; תוכניות שנטענו מראש יופיעו. בחר באפשרות &quot;SP1&quot; ולהגדיר את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס. הערה: גוף החימום מבטיח כי הדם מנוהל נשמר בטמפרטורה קבועה. הגדרות תכנית נוספות עשויות לשמש למיני יתושים או חרקים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא דלי במים ולטבול את גוף החימום למים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי חתיכה מרובעת של Parafilm (50 מ&quot;מ x 50 מ&quot;מ) ולמתוח אותו לעשות סרט קרומי דק. מכסה את חלקו התחתון של מתקני ההאכלה המלאכותיים עם Parafilm. לחתוך חתיכת Parafilm (50 מ&quot;מ x 10 מ&quot;מ) אחרת, למתוח וסוגר את הקצוות של מתקני ההאכלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את המערכת, חיבור מתקני ההאכלה וגוף חימום על ידי הצינורות. ברגע שסיים, לעבור על המערכת ובחר באפשרות &quot;SP1&quot;. לחץ על &quot;Enter&quot; כדי להפעיל את מערכת. הערה: המים יקבלו מחוממים ל 37 ° C ונשמר בטמפרטורה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג הטמפרטורת דואר של מים באמצעות מדחום בדלי המים. הערה: המחברים והצינורות לעזור לשמור על זרימה קבועה של מים במערכת, כך שהטמפרטורה של הדם נשארת על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מגש תחתון שטוח עם פתרון אקונומיקה 10% שישמש כדי לטהר כל נשפך דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של דם הכבשים defibrillated לצינור microcentrifuge. תווית זו כ&quot; שליטה &quot;. חזור על התהליך עבור הצינור הניסיוני שכותרתו &quot;5 מיקרומטר DZNep&quot; .Add μl 6 של פתרון מניות DZNep (ראה שלב 1.5) לצינור הניסיוני שכותרתו &quot;5 מיקרומטר DZNep&quot; בעדינות מערבב את הדם וסמים על ידי היפוכו כמה פעמים. דגירה צינור 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, להוסיף 2 מיליליטר של שליטה ודם מבחן לחלק העליון של מתקני האכלה שכותרתו בהתאם. מחק את פיפטה בפתרון אקונומיקה. לכסות את הכלוב עם שקית כהה ולנשום אוויר בכלוב מעת לעת כדי לעודד females להאכלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו היתושים להאכיל למשך כ -30 דקות. ברגע ההאכלה הושלמה, לכבות את גוף החימום, לקחת את מתקני ההאכלה החוצה ולהפשיט את Parafilm. משרים את המזין בפתרון אקונומיקה למשך כ -5 דקות ולשטוף היטב במים ללא יונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מתקני ההאכלה ולשים כדורי צמר גפן במי סוכר בכלובים במשך 48 שעות. מניחים צלחת ביצה המכילה מים ונייר סינון בכלובי לילה כדי להקל על הטלת ביצים. לייבל כל צלחת ביצה עם ריכוז מבחן או שליטה בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת הביצה למחרת ולבחון את המספר והמבנה של ביצים תחת מיקרוסקופ סטריאו. להשיג תמונות באמצעות תוכנת Q-colors5. לספור את מספר הביצים. לנתח הבדל במספר הביצים המתקבלות מכלובים בדיקה ובקרה. הערה: מבחן t מזווג ניתן להשתמש כדי לקבוע אם מספר הביצים שונים באופן משמעותי (p ≤0.05). </li></ol> 3. ביוכימיים Assay של יתוש אנזים עיכובעל ידי תרופות הערה: סעיף זה מתאר assay פעילות אנזים באמצעות DTNB כאינדיקטור לקבוע את ההשפעה של DZNep על עיכוב hydrolase SAH בזכר בוגר ויתושים ממין נקבה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 HPO 4 פתרון 0.1 M Na (פוספט נתרן dibasic) על ידי הוספת 14.19 גרם של Na 2 HPO 4 לL 1 של DH 2 O. בשלב הבא, להכין 4 פתרון 0.1 M לאא 2 PO (פוספט נתרן monobasic) על ידי הוספת 13.79 גר &#39;לאא 2 PO 4 לL 1 של DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל M Na פתרון 0.1 2 HPO 4 עם פתרון 0.1 M לאא 2 PO 4 לpH 8.5. הערה: זה יהיה פתרון המניות החוזרת של 0.1 M Na 2 HPO 4 (pH 8.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון הומוגניזציה של 0.1 M Na 2 HPO 4 (pH 8.5) על ידי הוספת 0.3% Triton X-100. הערה: פתרון הומוגניזציה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prepare פתרון 1.6 מ&quot;מ SAH (MW = 384.4) על ידי המסת 6.15 מ&quot;ג של SAH ב 10 מיליליטר של 0.1 M Na 2 HPO 4 (pH 8.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 1.6 מ&quot;מ DTNB (MW = 396.4) על ידי המסת 6.3 מ&quot;ג של DTNB ב 10 מיליליטר של 0.1 M Na 2 HPO 4 (pH 8.5). שמור את פתרון DTNB הטרי על קרח עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מ&quot;מ DZNep.HCl 1 (MW = 298.73) פתרון על ידי המסת 0.3 מ&quot;ג של DZNep ב1ml DH 2 O. בשלב הבא, לדלל את פתרון מ&quot;מ DZNep 1 לסדרה של ריכוזים מ1,000 מיקרומטר ל0.002 מיקרומטר ב DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את עיכוב hydrolase SAH ידי DZNep, להכין תמצית אנזים גולמי של יתושים: Homogenize 10 יתושים בוגרים שאינם דם-fed ב 1 מיליליטר של קר כקרח 0.1 M לאא 2 PO 4 (pH 8.5), המכילים 0.3% Triton X- 100, באמצעות homogenizer רקמת זכוכית. מעביר את homogenate לצינור microcentrifuge 1.5ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה homogenate 5 דקות ב10,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. מעביר את supernatant לנקי1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge. השתמש supernatant כמקור האנזים לassay ביוכימיים SAH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטיפול הריק (כלומר, לא DZNep, אין אנזים), להוסיף 50 μl 1.6 מ&quot;מ SAH, 50 μl 1.6 מ&quot;מ DTNB, ו -100 μl 0.1 M Na 2 HPO 4 (pH 8.5) לבארות בודדות של 96-היטב, microplate תחתית שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשליטה (כלומר, אין DZNep), להוסיף 50 μl 1.6 מ&quot;מ SAH, 50 μl 1.6 מ&quot;מ DTNB, 50 μl 0.1 M Na 2 HPO 4 (pH 8.5) ו -50 אנזים μl (hydrolase SAH מתקבל מתמצית גולמי) ליחיד בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטיפולי DZNep, להוסיף 50 μl 1.6 מ&quot;מ SAH, 50 μl 1.6 מ&quot;מ DTNB, 50 אנזים μl ו -50 μl ריכוז DZNep נבחר לבארות בודדות. הכן 4 חזרות לכל טיפול ושליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הצפיפות האופטית (OD) של דגימות אנזים SAH ב 405 ננומטר במשך 5 דקות במרווחים של 20 שניות באמצעות קורא microplate 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסר OD הריק משליטהnd טיפול OD המתקבל מכל טוב. לחשב את האחוזים הנותרים פעילות hydrolase SAH באמצעות המשוואה הבאה:% פעילות שיורי = (הטיפול OD / הבקרה OD) x 100. </li></ol>

<ol>
	<li>Gatton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+mosquito+behavioural+adaptations+to+malaria+control+in+Africa.">The importance of mosquito behavioural adaptations to malaria control in Africa.</a> Evolution; International Journal of Organic Evolution. 67, 1218-1230 (2013).</li><li>Sternberg, E. D., Thomas, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+adaptation+to+temperature+and+the+implications+for+vector-borne+diseases.">Local adaptation to temperature and the implications for vector-borne diseases.</a> Trends in Parasitology. , (2014).</li><li>Rocca, K. A., Gray, E. M., Costantini, C., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2La+chromosomal+inversion+enhances+thermal+tolerance+of+Anopheles+gambiae+larvae.">2La chromosomal inversion enhances thermal tolerance of Anopheles gambiae larvae.</a> Malaria Journal. 8, 147 (2009).</li><li>Coluzzi, M., Sabatini, A., Petrarca, V., Di Deco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+differentiation+and+adaptation+to+human+environments+in+the+Anopheles+gambiae+complex.">Chromosomal differentiation and adaptation to human environments in the Anopheles gambiae complex.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73, 483-497 (1979).</li><li>Donepudi, S., Mattison, R. J., Kihslinger, J. E., Godley, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+Cancer+Therapeutics.">Update on Cancer Therapeutics.</a> Science Direct. 2 (4), 157-206 (2007).</li><li>Greer, E. L., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+methylation:+a+dynamic+mark+in+health,+disease+and+inheritance.">Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 343-357 (2012).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li><li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenetics:+from+mechanism+to+therapy.">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li><li>Clough, E., Tedeschi, T., Hazelrigg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+oogenesis+and+germ+stem+cell+maintenance+by+the+Drosophila+histone+methyltransferase+Eggless/dSetDB1.">Epigenetic regulation of oogenesis and germ stem cell maintenance by the Drosophila histone methyltransferase Eggless/dSetDB1.</a> Developmental Biology. 388, 181-191 (2014).</li><li>Conrad, T., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosage+compensation+in+Drosophila+melanogaster:+epigenetic+fine-tuning+of+chromosome-wide+transcription.">Dosage compensation in Drosophila melanogaster: epigenetic fine-tuning of chromosome-wide transcription.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 123-134 (2011).</li><li>Miranda, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DZNep+is+a+global+histone+methylation+inhibitor+that+reactivates+developmental+genes+not+silenced+by+DNA+methylation.">DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8, 1579-1588 (2009).</li><li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMA-1,+a+Mutant+p53+Reactivator,+Restores+the+Sensitivity+of+TP53+Mutant-type+Thyroid+Cancer+Cells+to+the+Histone+Methylation+Inhibitor+3-Deazaneplanocin+A+(DZNep).">PRIMA-1, a Mutant p53 Reactivator, Restores the Sensitivity of TP53 Mutant-type Thyroid Cancer Cells to the Histone Methylation Inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep).</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 99 (11), E962 (2014).</li><li>Fujiwara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Deazaneplanocin+A+(DZNep),+an+inhibitor+of+S-adenosyl-methionine-dependent+methyltransferase,+promotes+erythroid+differentiation.">3-Deazaneplanocin A (DZNep), an inhibitor of S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferase, promotes erythroid differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2014).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+polycomb+group+protein+EZH2+is+a+novel+therapeutic+target+in+tongue+cancer.">The polycomb group protein EZH2 is a novel therapeutic target in tongue cancer.</a> Oncotarget. 4, 2532-2549 (2013).</li><li>Nakagawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+therapy+with+the+histone+methyltransferase+EZH2+inhibitor+3-deazaneplanocin+A+inhibits+the+growth+of+cholangiocarcinoma+cells.">Epigenetic therapy with the histone methyltransferase EZH2 inhibitor 3-deazaneplanocin A inhibits the growth of cholangiocarcinoma cells.</a> Oncology Reports. 31, 983-988 (2014).</li><li>Crea, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+disruption+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+inhibits+tumorigenicity+and+tumor+progression+in+prostate+cancer.">Pharmacologic disruption of Polycomb Repressive Complex 2 inhibits tumorigenicity and tumor progression in prostate cancer.</a> Molecular Cancer. 10, 40 (2011).</li><li>Vella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZH2+down-regulation+exacerbates+lipid+accumulation+and+inflammation+in+in+vitro+and+in+vivo+NAFLD.">EZH2 down-regulation exacerbates lipid accumulation and inflammation in in vitro and in vivo NAFLD.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14, 24154-24168 (2013).</li><li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+disruption+of+Polycomb-repressive+complex+2-mediated+gene+repression+selectively+induces+apoptosis+in+cancer+cells.">Pharmacologic disruption of Polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells.</a> Genes &amp; Development. 21, 1050-1063 (2007).</li><li>Chiang, P. K., Cantoni, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+biochemical+transmethylations+by+3-deazaadenosine+in+vivo.">Perturbation of biochemical transmethylations by 3-deazaadenosine in vivo.</a> Biochemical Pharmacology. 28, 1897-1902 (1979).</li><li>Lu, Y. X., Denlinger, D. L., Xu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+repressive+complex+2+(PRC2)+protein+ESC+regulates+insect+developmental+timing+by+mediating+H3K27me3+and+activating+prothoracicotropic+hormone+gene+expression.">Polycomb repressive complex 2 (PRC2) protein ESC regulates insect developmental timing by mediating H3K27me3 and activating prothoracicotropic hormone gene expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 23554-23564 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ישנם מספר צעדים חיוניים ליישום המוצלח של פרוטוקול זה. עבור assay הזחל, יש להקפיד לתייג בצורה נכונה ולשכפל את כל ריכוז בדיקה. באופן אקראי, דגימות בדיקה והוספת הסכום המיועד של תרופה לבארות מבחן המתאימות היא חלק חשוב מניסיוני זה להגדיר. לפני הוספת זחלי היתושים instar 2 nd ...

מלריה היא אחראית למספר הגבוה ביותר של מקרי מוות הקשורים חרקים בעולם. 219 מיליון מקרים מוערכים מתרחשים מדי שנה ברחבי העולם, וכתוצאה מכך כ 660,000 מקרי מוות, בעיקר באפריקה 1. למרות מאמצי תוכניות מלריה, בפני מספר אתגרים. בעוד bednets חרקים טופלו ורכיבי מפתח צורת ריסוס שייר מקורה של התכנית, התנגדות לחומרי הדברה באוכלוסיות מקומיות לעכב את המאמצים אלה 2. הגידול המהיר באוכלוסיות יתושים עמידות חרקים מיוחסים במידה רבה ליכולתם של יתושי המלריה להסתגל במהירות לשינויים בסביבה שלהם ולנצל נישות שונות 3,4,5. כדי להתגבר על המנגנונים קיימים התנגדות חרקים, החקירה של מטרות הדברה רומן ותרכובות הדור הבא היא מוצדקת. פרוטוקול פשוט, צעד-אחר-צעד לקביעת היעילות של חומרי הדברה ניסיוניות בשלבי החיים השונים של מלריה מ &#39;osquitoes היה לשפר באופן משמעותי את המאמצים הללו. מחקרים פרמקולוגיים של שפעות תרופה על שורות תאים ומודלים של בעלי החיים הקימו את השימוש בסמים אפיגנטיים ככלי שימושי לויסות הגנטיקה והפיסיולוגיה של תאים ואורגניזמים. מתילציה DNA ושינוי היסטון שני מנגנונים אפיגנטיים המשפיעים על ביטוי גנים ביצורים רב-תאיים, מבלי לשנות את רצף ה- DNA הבסיסי 6. שינויי ההודעה translational כגון מתילציה לשחק תפקיד מכריע בשמירה על שלמות תאים וביטוי גנים, ועשויים להשפיע על מספר תהליכים בסיסיים 7,8,9. מחקר בכמה מיני חרקים הדגיש את החשיבות של אפיגנטיקה בתהליכים מעורבים אאוגנזה ותאי גזע תחזוקה 10, וכן פיצוי מינון 11. עם זאת, כגון היבטים בוקטורי מחלה טרם נחקרו. שימוש במתחם לווסת מערכת זו ביתושים עשוי לספק לנו במראות למסלולי יעד הדברה הרומן. 3-Deazaneplanocin (DZNep) הוא מעכב מתילציה היסטון ידוע, המשפיעים על סוגים שונים של הסרטן נחקרו 12,13,14,15,16. DZNep הוא תרופה יציבה מסיסים במים אפיגנטיים שבעקיפין מעכבת -methyltransferase N ליזין היסטון (EZH2), מרכיב של Polycomb המורכב המדכא 2 (PRC2) בתאי יונקים. PRC2 משחק תפקיד חשוב בויסות הצמיחה של תאי גזע ביצורים רב-תאיים, ומתילציה היסטון היא היבט מרכזי של השתקת גני PRC2 תיווך. בעכברי מדוכאי חיסון, תאים טרום שטופלו בDZNep הוכחו להיות פחות tumorigenic 17. תרופה זו הופכת משמשת לחקר מחלות אחרות, כגון מחלת כבד השומני שאינו אלכוהוליים, שבו הוא מעורבת EZH2 18. DZNep הוא מעכב -adenosylhomocysteine ​​S הוקם (SAH) hydrolase 19, 20. העיכוב של תוצאות hydrolase SAH בהצטברות של SAH ו, בתורו, מובילה לעיכוב של פעילות methyltransferase ידי הגבלת קבוצות תורמות מתיל זמינות. SAH הוא נגזר של חומצת אמינו מנוצל על ידי אורגניזמים רבים, כוללים חרקים, במסלולים המטבוליים שלהם. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי DZNep במינונים נמוכים עלולים להשפיע דיאפאוזה ולעכב את ההתפתחות בחרקים 21. כאן, פרוטוקול חזק כדי לחקור את ההשפעות של מתחם מסיס במים בשלבי חיים שונים של יתושים מפותח. שלושה החלקים של פרוטוקול זה כוללים הוראות לבחינת ההשפעות של מתחם מסיס במים ביתושים בוגרים, נקבות האכלה-דם למבוגרים, ופעילות אנזים של זכר בוגר ונקבת יתושים. ראשית, DZNep מומס במים ללמוד פיתוח יתושים בוגר והישרדות. המהלך זה מתבצע בשני ריכוזים להשוות כל הבדלים הנובעים מגידול של פי 10 בחשיפה לסמים. כדי לחקור את ההשפעה של תרופה על יתושי נקבה, DZNep הבוגרמתווסף לדם כבשים defibrillated והאכיל את הדם באופן מלאכותי לנקבות. בהמשך לכך, התוצאה של התרופה על פוריות נבחנה. לבסוף, assay פעילות אנזים מתבצע באמצעות 5,5&#39;-dithiobis- (חומצת 2-nitrobenzoic) (DTNB) כאינדיקטור לקבוע את ההשפעה של DZNep על עיכוב hydrolase SAH בזכר בוגר ויתושים ממין נקבה. בעוד פרוטוקול זה הוא פותח עם יתושים מלריה, אנופלס gambiae, זה יכול להתאים בקלות לחקר ההשפעות של תרכובות של ריבית על כל מינים של יתושים או חרקים אחרים. הטכניקות מפורטות בפרוטוקול זה לא יכולה להיות מיושמות ביעילות לתרופה עם מסיסות מוגבלת או לא במים או בתקשורת מימית.

<table><tbody><tr><td>96-well microplate</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565561</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture plate</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall Fresco</td><td>76003758</td><td>A different centrifuge can be used</td></tr><tr><td>Colored tape rolls</td><td>Fisher</td><td>S68134</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ</td><td></td></tr><tr><td>DTNB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>DZNep.HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SMLO305</td><td></td></tr><tr><td>Egg dish cups</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter papers</td><td>Fisher</td><td>09-795E</td><td></td></tr><tr><td>Glass feeders</td><td>Virginia Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass tissue homogenizer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating element</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0520091</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Percival scientific</td><td>I36VLC8</td><td>A different incubator can be used</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube, 2&amp;nbsp;ml</td><td>Axygen</td><td>22-283</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube, 1.5&amp;nbsp;ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Eppendorf</td><td>4910 000.069</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-3154</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-8643</td><td></td></tr><tr><td>pH meter&amp;nbsp;</td><td>Mettler Toledo 7easy</td><td>S20</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Spectramax</td><td>M2</td><td></td></tr><tr><td>SAH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9384</td><td>store at -20 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

toxicological assays for testing effects of an epigenetic drug on development, fecundity and survivorship of malaria mosquitoes

התנגדות חרקים מהווה בעיה גדולה עבור תוכניות שליטת מלריה. יתושים להתאים למגוון רחב של שינויים בסביבה במהירות, מה שהופך את המלריה לשלוט בעיה בכל מקום בארצות טרופיות. הופעתם של אוכלוסיות עמידות חרקים מצדיק את החקירה של מסלולי רומן יעד סמים ותרכובות לשליטת יתוש וקטור. תרופות אפיגנטיים מבוססות היטב בחקר הסרטן, אך לא הרבה ידועה על ההשפעות שלהם על חרקים. מחקר זה מספק פרוטוקול פשוט לבחינת ההשפעות הרעילות של 3-Deazaneplanocin (DZNep), תרופה ניסיונית אפיגנטיים לטיפול בסרטן, על וקטור המלריה, אנופלס gambiae. עליית ריכוז תלוי בתמותה וירידה בגודל נצפתה ביתושים בוגרים שנחשפו לDZNep, ואילו המתחם הפחית את הפוריות של יתושים בוגרים יחסית לשלוט טיפולים. בנוסף, חלה ירידה בסמים תלויים בS -adenosylhomocysteine ​​פעילות (SAH) hydrolase ביתושים בעקבות החשיפה לDZNep יחסי לשלוט טיפולים. פרוטוקולים אלה מספקים חוקר עם הליך פשוט, צעד-אחר-צעד כדי להעריך נקודות קצה טוקסיקולוגית מרובות עבור תרופה ניסיונית ו, בתורו, להפגין גישה רבת-שיניים ייחודיות לחקר ההשפעות הרעילות של תרופות אפיגנטיים מסיסים במים או תרכובות של עניין נגד יתושי וקטור וחרקים אחרים.

איור 1 הוא ייצוג סכמטי של מבחני; זה מתאר את השלבים השונים של ההליך המפורט במאמר זה. כפרוטוקול מבוסס על שלבי חיים שונים של יתושים, אין רצף מסוים כדי להיות במעקב במשך הניסויים המפורטים כאן. המשתמש יכול לבחור לנהל מבחני אחד או יותר באותו הזמן, בהתאם לזמינות מדגם. <...

Watch this Scientific Journal Video about Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes at JoVE.com

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

מבחני לבדיקת השפעות רעילים של תרופות אפיגנטיים בפיתוח, פוריות והישרדות של יתושים מלריה

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

toxicological-assays-for-testing-effects-an-epigenetic-drug-on

Research

JoVE Journal

Biology

8.4K Views.  Virginia Tech. A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition. 

Video: Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new infections each year. Despite decades of research, there is still no vaccine against malaria, highlighting the need for novel control strategies. One innovative approach is the use of genetically modified mosquitoes to effectively control malaria parasite transmission. Deliberate alterations of cell signaling pathways in the mosquito, via targeted mutagenesis, have been found to regulate parasite development 1. From these studies, we can begin to identify potential gene targets for transformation. Targeted mutagenesis has traditionally relied upon the homologous recombination between a target gene and a large DNA molecule. However, the construction and use of such complex DNA molecules for generation of stably transformed cell lines is costly, time consuming and often inefficient. Therefore, a strategy using locked nucleic acid-modified oligonucleotides (LNA-ONs) provides a useful alternative for introducing artificial single nucleotide substitutions into episomal and chromosomal DNA gene targets (reviewed in 2). LNA-ON-mediated targeted mutagenesis has been used to introduce point mutations into genes of interest in cultured cells of both yeast and mice 3,4. We show here that LNA-ONs can be used to introduce a single nucleotide change in a transfected episomal target that results in a switch from blue fluorescent protein (BFP) expression to green fluorescent protein (GFP) expression in both Anopheles gambiae and Anopheles stephensi cells. This conversion demonstrates for the first time that effective mutagenesis of target genes in mosquito cells can be mediated by LNA-ONs and suggests that this technique may be applicable to mutagenesis of chromosomal targets in vitro and in vivo.

Oligonucleotides can be used to site specifically substitute a single nucleotide of transfected target genes in both Anopheles gambiae and Anopheles stephensi cells.

Transfection ו mutagenesis של גני מטרה של תאים על ידי יתוש נעול חומצה שונה oligonucleotides גרעין

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new ...

Immunology and Infection

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

פרוטוקול עבור הפקה של הצלב גנטית של טפילי מלריה מכרסמים

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections.   Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections. Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

בניית יתוש עדיף: זיהוי הגנים הפעלת מלריה קדחת דנגי ההתנגדות ב א gambiae וא aegypti יתושים

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical regions, is caused by infection with Plasmodium parasites. The development of more effective drugs to combat malaria can be accelerated by improving our understanding of the biology of this complex parasite. Genetic manipulation of these parasites is key to understanding their biology; however, historically the genome of P. falciparum has been difficult to manipulate. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been utilized in malaria parasites, allowing for easier protein tagging, generation of conditional protein knockdowns, and deletion of genes. CRISPR/Cas9 genome editing has proven to be a powerful tool for advancing the field of malaria research. Here, we describe a CRISPR/Cas9 method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in P. falciparum. This method is highly adaptable to other types of genetic manipulations, including protein tagging and gene knockouts.

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

We describe a method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in Plasmodium falciparum using CRISPR/Cas9 genome editing.

CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי להפוך מותנה מוטציות של בני אדם טפיל המלריה falciparum פ

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Genetics

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. However, effective malaria parasite targets for vaccine and chemotherapy development are still limited. This is largely due to the unavailability of relevant and practical in vivo infection models for human Plasmodium species, most notably for P.&#160;falciparum and P. vivax. Therefore, rodent malaria species have been extensively used as practical alternative in vivo models for malaria vaccine, drug targeting, immune response, and functional characterization studies of conserved Plasmodiumspp. genes. Indeed, rodent malaria models have proven to be invaluable, especially for exploring mosquito transmission and liver stage biology, and were indispensable for immunological studies. However, there are discrepancies in the methods used to evaluate the phenotypes of transgenic and wild-type asexual and sexual blood-stage parasites.&#160;Examples of these discrepancies are the choice of an intravenous vs. intraperitoneal infection of rodents with blood-stage parasites and the evaluation of male gamete exflagellation. Herein, we detail standardized experimental methods to evaluate the phenotypes of asexual and sexual blood stages in transgenic parasites expressing reporter-gene or wild-type rodent malaria parasite species. We also detail the methods to evaluate the phenotypes of malaria parasite mosquito stages (gametes, ookinetes, oocysts, and sporozoites) inside Anopheles mosquito vectors. These methods are detailed and simplified here for the lethal and non-lethal strains of P. berghei and P. yoelii but can also be applied with some adjustments to P. chabaudi and P. vinckei rodent malaria species.

Due to the striking similarities of the life cycle and biology of rodent malaria parasites to human malaria parasites, rodent malaria models have become indispensable for malaria research. Herein, we standardized some of the most important techniques used in the phenotypic analysis of wild-type and transgenic rodent malaria species.

ניתוח פנוטימית של מלריה מכרסם טפיל מינית ושלבי דם מיניים ושלבי יתוש

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This parasitic disease requires a protozoan parasite, an Anopheles mosquito vector, and a vertebrate host. The Anopheles genus comprises more than 500 species, of which 60 are known as vectors of the parasite. The Plasmodium parasite genus consists of 250 species, and 48 of these are involved in disease transmission. Furthermore, the Plasmodium falciparum parasite has contributed toward an estimated 99.7% of malaria cases in sub-Saharan Africa in recent years. 
Gametocytes form part of the sexual stage of the parasite and are ingested by the female mosquito upon feeding on an infected human host. Further development of the parasite within the mosquito is enhanced by favorable environmental conditions in the midgut of the mosquito. Here, the fusion of the female and male gametes takes place, and the motile ookinetes originate. The ookinetes enter the midgut epithelium of the mosquito, and mature ookinetes form oocysts, which, in turn, produce motile sporozoites. These sporozoites migrate to the mosquito's salivary glands and are injected as a mosquito takes a blood meal. 
For drug discovery purposes, mosquitoes were artificially infected with gametocyte-infected blood in the standard membrane feeding assay (SMFA). To detect infection within the mosquito and/or to assess the efficacy of antimalarial compounds, the midguts of the female mosquitoes were removed post infection and were stained with mercurochrome. This method was used to enhance the visual detection of oocysts under the microscope for the accurate determination of oocyst prevalence and intensity.

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

The standard membrane feeding assay (SMFA) is regarded as the gold standard for the assessment and identification of potential antimalarial compounds. This artificial feeding system is used to infect mosquitoes to further evaluate the effects of such compounds on the intensity and prevalence of the Plasmodium falciparum parasite.

בדיקת הזנת ממברנה סטנדרטית לזיהוי זיהום פלסמודיום פלציפרום בווקטורים של יתושים אנופלס

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...

הכלאה פלואורסצנטית באתרו לחקר זרע יתושים

Whole-Mount Fluorescence In Situ Hybridization to Study Spermatogenesis in the Anopheles Mosquito

Spermatogenesis is a complex biological process during which diploid cells undergo successive mitotic and meiotic division followed by large structural changes to form haploid spermatozoa. Besides the biological aspect, studying spermatogenesis is of paramount importance for understanding and developing genetic technologies such as gene drive and synthetic sex ratio distorters, which, by altering Mendelian inheritance and the sperm sex ratio, respectively, could be used to control pest insect populations. These technologies have proven to be very promising in lab settings and could potentially be used to control wild populations of Anopheles mosquitoes, which are vectors of malaria. Due to the simplicity of the testis anatomy and their medical importance, Anopheles gambiae, a major malaria vector in sub-Saharan Africa, represents a good cytological model for studying spermatogenesis. This protocol describes how whole-mount fluorescence in situ hybridization (WFISH) can be used to study the dramatic changes in cell nuclear structure through spermatogenesis using fluorescent probes that specifically stain the X and Y chromosomes. FISH usually requires the disruption of the reproductive organs to expose mitotic or meiotic chromosomes and allow the staining of specific genomic regions with fluorescent probes. WFISH enables the preservation of the native cytological structure of the testis, coupled with a good level of signal detection from fluorescent probes targeting repetitive DNA sequences. This allows researchers to follow changes in the chromosomal behavior of cells undergoing meiosis along the structure of the organ, where each phase of the process can clearly be distinguished. This technique could be particularly useful for studying chromosome meiotic pairing and investigating the cytological phenotypes associated with, for example, synthetic sex ratio distorters, hybrid male sterility, and the knock-out of genes involved in spermatogenesis.

מחבר זרקור: הכלאה פלואורסצנטית באתרו לחקר ספרמטוגנזה ביתוש אנופלס  

Given their simple anatomy, Anopheles testes offer a good cytological model for studying spermatogenesis. This protocol describes whole-mount fluorescence in situ hybridization, a technique used to investigate this biological process, as well as the phenotype of transgenic strains harboring mutations in the genes involved in sperm production.

הכלאה פלואורסצנטית באתרה לחקר ספרמטוגנזה ביתוש האנופלס

Spermatogenesis is a complex biological process during which diploid cells undergo successive mitotic and meiotic division followed by large structural ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

פרוטוקולים לבדיקת הרעילות של הרומן בדיקות, חרקים הביוכימיה על היתושים

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

מבחני לבדיקת השפעות רעילים של תרופות אפיגנטיים בפיתוח, פוריות והישרדות של יתושים מלריה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Transfection ו mutagenesis של גני מטרה של תאים על ידי יתוש נעול חומצה שונה oligonucleotides גרעין

פרוטוקול עבור הפקה של הצלב גנטית של טפילי מלריה מכרסמים

בניית יתוש עדיף: זיהוי הגנים הפעלת מלריה קדחת דנגי ההתנגדות ב א gambiae וא aegypti יתושים

CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי להפוך מותנה מוטציות של בני אדם טפיל המלריה falciparum פ

ניתוח פנוטימית של מלריה מכרסם טפיל מינית ושלבי דם מיניים ושלבי יתוש

בדיקת הזנת ממברנה סטנדרטית לזיהוי זיהום פלסמודיום פלציפרום בווקטורים של יתושים אנופלס

הכלאה פלואורסצנטית באתרה לחקר ספרמטוגנזה ביתוש האנופלס

הכלאה פלואורסצנטית באתרה לחקר ספרמטוגנזה ביתוש האנופלס

הכלאה פלואורסצנטית באתרה לחקר ספרמטוגנזה ביתוש האנופלס

פרוטוקולים לבדיקת הרעילות של הרומן בדיקות, חרקים הביוכימיה על היתושים