Name: application of fluorescent nanoparticles to study remodeling of the endo-lysosomal system by intracellular bacteria
Uploaded: 2015-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria at JoVE.com

This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 &#8216;Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments&#8217; and HE1964/18 within priority program 1580.

1. סינתזה של 10 ננומטר זהב חלקיקים (זהב NPS) 15 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון: להוסיף 2 מיליליטר 1% כלוריד זהב המימי ל160 מיליליטר מילי- Q, או מזוקק פעמיים, מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הפתרון B: להוסיף 8 מיליליטר 1% ציטראט x 2 H תלת-נתרן 2 O ו -160% μl 1 חומצה טאנית ל -32 מיליליטר מילי- Q, או מזוקק פעמיים, מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את הפתרון A ו- B ל- 60 ° C ומערבבים אותם תוך ערבוב. שים לב בצבע כחול כהה באופן מיידי. שים לב צבע אדום לאחר כ -15 דקות. לאחר מכן לחמם עד 95 מעלות צלזיוס, לשמור על 5 דקות ולקרר את הפתרון לRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה של ההשעיה NP על פחמן רשת מצופה ולאפשר לו להתייבש באוויר. בדוק את הגודל ומורפולוגיה של צירופים ועל ידי מיקרוסקופ אלקטרונים החודר. </li></ol> 2. ציפוי של צירופים וזהב עם BSA ותיוג עם Rhodamine N-hydroxysuccinimidyl אסתר (NHS) 16 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 900 ​​μl צירופים וזהב לתוך צינור Eppendorf 1.5 מיליליטר, צנטריפוגות ב 15,000 XG למשך 30 דקות. אופtionally, להכין צינורות מרובים עשויים בבת אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, מחדש להשעות את גלולה ב900 μl מעוקר המים מילי- Q ולהוסיף 100 μl 2 מ&quot;ג / מיליליטר BSA / PBS, לערבב במערבולת ב 800 סל&quot;ד במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר BSA העודף, צנטריפוגות ההכנה ב15,000 XG במשך 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, מחדש להשעות הצירופים והזהב-BSA ב125 μl PBS, להוסיף 12.5 μl של יקרבונט 1 M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לפני השימוש, להכין פתרון 10 מ&quot;ג / מיליליטר של rhodamine NHS / DMSO, להוסיף 30 μl של פתרון / DMSO rhodamine NHS ל1ml של ההשעיה זהב-BSA הצירופים. דגירה התגובה לשעה 2 (או O / N) ב RT במהלך 800 ערבוב סל&quot;ד, הימנעות מחשיפה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את הצירופים וזהב-BSA-rhodamine באמצעות דיאליזה נגד PBS בºC 4 עם 5 חיץ שינויים על פני תקופת 36-48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצב צירופים ו, ​​להוסיף 10 μl של 200 מ&quot;ג / BSA / PBS מיליליטר לכל 1 מיליליטר צירופים וזהב-BSA-rhodamine. כדי להסיר את צנטריפוגות בחינם או שוחררה BSA-rhodamine, בגיל 15,000 XG במשך 60 דקות. Resuspend גלולה ב 2 מ&quot;ג / מיליליטר BSA / PBS, למדוד OD 520, ולאחסן ב 4 ° C, הימנעות מחשיפה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הפעמים הצירופים 10 עם מילי- Q או מים מזוקקים פעמיים, להוסיף טיפה על רשת מצופה פחמן, ולאפשר לו להתייבש באוויר. בדוק את הגודל ומורפולוגיה של צירופים ועל ידי מיקרוסקופ אלקטרונים החודר (TEM). הערה: כל החומרים המשמשים להכנת NP עוקרו והמבצע שנערך במכסת מנוע תרבית תאים או על ספסל ליד להבה. </li></ol> 3. תרבות של תאי הלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי הלה באופן קבוע להביע LAMP1-GFP בתרבית DMEM עם סרום 10% עגל עוברי (FCS) וגדלתי על 37 מעלות צלזיוס באווירה המכילה 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי התאים בצפיפות של 50,000 לכל גם בתא שקופית 8 היטב (Ibidi) ודגירת O / N. </li></ol> 4. תרבות של חיידקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> serovar enterica השימוש סלמונלה Typhimurium NCTC 12,023 wild-סוג מתח (WT). לשם השוואה, להשתמש זנים מוטנטים Δ ssaV פגומים בSPI2-T3SS וΔ SIFA חסר מפעיל מפתח SIFA לSIF. השתמש בזני חסת פלסמיד pFPV25.1 לביטוי מכונן של ה- GFP המשופר. הערה: זני חיידקים באופן שיגרתי בתרבית במרק לוריא-Bertani (LB) עם תוספת של 50 מיקרוגרם / מיליליטר carbenicillin (WT) וLB עם תוספת של 50 מיקרוגרם / מיליליטר carbenicillin ו / או 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin (Δ ssaV, Δ SIFA ) של הנדרש כדי לשמור על פלסמידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבה אחת של חיידקים ב 3 מיליליטר LB עם אנטיביוטיקה מתאימה ולגדול O / N ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים רועדים לאוורור, ואז לדלל 01:31 בLB הטרי ולהמשיך את הצמיחה תמורת 3.5 שעות. בנקודה זמן זו, התרבויות להגיע השלב מאוחר יומן וחיידקים הם פולשני מאוד. &quot;תוף הרים &#39;הוא נוח לדגירת תרבויות מבחנה עם אוורור. </li></ol> 5. זיהום של תאי הלה על ידיסלמונלה וזהב-BSA-Rhodamine צירופים וPulse צ&#39;ייס תיוג (ראה תרשים 1 לערכה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד OD 600 של החיידקים תת תרבות ולדלל את OD 600 = 0.2 ב 1 מיליליטר PBS (~ 3 CFU × 10 8 / מיליליטר), להוסיף כמויות מתאימות של חיידקים לתאי הלה בשקופיות קאמריות 8 היטב כדי להשיג ריבוי זיהום (משרד הפנים) של 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה למשך 30 דקות בחממת התא, לשטוף 3 פעמים עם PBS להסיר חיידקים שאינם מופנמים (זמן נקודה זו נקבעה כלאחר זיהום 0 שעה, או 0 pi hr). להוסיף 300 μl של מדיום תרבות הטרי המכיל 100 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין ולשמור עבור שעה 1. לאחר מכן להחליף בינוני עם בינוני טרי המכיל גנטמיצין / מיליליטר 10 מיקרוגרם לשארית זמן הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגרה עם מדיום תרבות המכיל גנטמיצין / מיליליטר 100 מיקרוגרם לשעה 1, הבינוני הוא הוחלף על ידי הדמיה בינונית (הנשרים MEM ללא FCS, L-גלוטמין, ביקרבונט האדום ונתרן פנול, עם 30 מ&quot;מ HEPES, pH 7.4) במשותףntaining 10 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין. צירופים וזהב-BSA-rhodamine מתווספים לתאי הלה להשיג ריכוז סופי של OD 520 = 0.1. הערה: צירופים וזהב-BSA-rhodamine יכול להיות גם הוסיפו לתאים לפני ההדבקה, או בpi נקודות הזמן השונים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה 1 שעה, להסיר את המדיום, לשטוף 3 פעמים עם PBS, ולהוסיף 300 μl של מדיום הדמיה טרי המכיל 10% FCS וגנטמיצין / מיליליטר 10 מיקרוגרם לשארית זמן הדגירה. הערה: משך הדגירה עשוי להשתנות בהתאם לריכוז של צירופים ושורות תאים בשימוש. למקרופאגים RAW264.7, שמה לב שדגירת דקות 30 עם צירופים ובריכוז של OD 520 = 0.05 אפשר הפנמה מספקת. </li></ol> 6. הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במערכת הדמיה confocal כגון לייזר סריקת confocal (CLSM) או מיקרוסקופ דיסק מסתובב (SD) עם תא סביבת humidified להדמיה ברזולוציה גבוהה בזמן נקודות שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור על ג הטמפרטורהontrol מערכת ולחכות עד שהוא יציב. למטב את הגדרות ההדמיה כגון הגדלה, מהירות סריקה, רזולוציה, Z-ערימה וכו &#39;השתמש בהגדרות עירור / פליטה מתאימות לGFP וצירופים וזהב-BSA-rhodamine. לפרוטוקול זה, השתמש 400 הרץ מהירות סריקה, ברזולוציה של 512 x 512 פיקסלים וגודל Z-צעד של 0.25 מיקרומטר. Excite GFP וזהב-BSA-rhodamine באמצעות לייזר Ar (488 ננומטר) וליזר HeNe (543 ננומטר), בהתאמה. כולל בהיר שדה ערוץ (BF) להתבוננות בדמותם של התאים. למערכות אחרות במיקרוסקופ ותנאי זיהום, ההגדרה צריכה להיות בהתאם. הערה: השתמש באותה הלייזר Ar כמקור האור של ערוץ BF ואות זוהה עם גלאי מכפיל תמונה (PMT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בpi נקודות הזמן שצוין, הר השקופיות קאמריות 8-היטב המכילות תאים נגועים על הבמה מיקרוסקופ ותמונות שיא. </li></ol> 7. ניתוח של תמונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת ניתוח תמונה מיקרוסקופית (ראה <strong&gt; חומרים ולוח של הציוד) כדי לנתח את העיצוב מחדש של מערכת אנדו-lysosomal ידי סלמונלה תאית. פתח את הנתונים על-ידי לחיצה על &#39;פתח&#39; ובחירת הקובץ. הערה: לחלופין, חבילות תוכנת קוד פתוחות כגון ImageJ או פיג&#39;י עשויות לשמש לתמונת ניתוחים כמותיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסרגל הכלים האובייקטים של קליק לעלות מבט על הסמל <img alt="אייקון" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon1.jpg" /> כדי להוסיף פריט שטח חדש. לחץ על <img alt="אייקון" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" /> (הבא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח אזור של העניין (ROI), מגזר בחר ROI. באזור תצוגה, סעיף-גובל מלבן מעולף על תמונה המייצג את ההחזר על ההשקעה. הזן את הערכים בקואורדינטות x המקבילות, y-, ושדות Z-, או ישירות לחץ על החצים במלבן התצוגה המקדימה לגודל ומיקום של ההחזר על ההשקעה לשנות. לאחר מכן לחץ על <img alt="אייקון" fo:content-width=".1in" src<html> = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 52,058 / 52058icon2.jpg&quot; /&gt; (הבא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כערוץ מקור, ערוץ בחר 3 (אות לזהב-BSA-Rhodamine NPS). בדוק את האפשרות החלקה להגדיר את החלקות באזור וכתוצאה מכך. להגדיר ערך באופן ידני או לקבל את הערך שנוצר באופן אוטומטי. לסף, בחר באפשרות העוצמה מוחלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאמת הסף, בחר באפשרות הידנית ולהגדיר ערך. באזור התצוגה, תצוגה מקדימה סף משטח מוצגת באפור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על המשטחים לסווג כרטיסיית פני השטח וכתוצאה ניתן לסנן לפי קריטריונים שונים. מסנן ברירת מחדל הוא &#39;מספר voxels&gt; 10&#39;, ומסננים אחרים יכול להיכלל גם על ידי לחיצה על &quot;הוספה&quot;. אם סינון אין צורך, ולאחר מכן למחוק את כל המסננים על ידי לחיצה על כפתור המחיקה. לחץ <img alt="אייקון" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" /> (הבא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשלים את יצירת Surface, לחץ על/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg &quot;/&gt; (Finish). ברשימת האובייקט, עכשיו את הסימון בתיבה לVolume הפריט והמשטח שנוצר חדש מוצג בשטח צפייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הנתונים הסטטיסטיים. עכשיו, בתצוגה לעלות את הצבע של הנושאים משתנים מסגול לאדום בהתאם לאזור שלהם. והשולחן &#39;פינת מספרי מגרש&#39; מציג את המידע הסטטיסטי (למשל, מספר תעודת זהות ושטח של אובייקטים). לייצא את כל הנתונים הסטטיסטיים של משטח 1 לקובץ Excel על ידי לחיצה <img alt="אייקון" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon4.jpg" /> (שמור). </li></ol>

<ol>
	<li>Coto-Garcia, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+fluorescent+labels+for+optical+imaging+and+sensing+in+genomics+and+proteomics.">Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics.</a> Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).</li><li>Xie, J., Lee, S., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+theranostic+agents.">Nanoparticle-based theranostic agents.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1064-1079 (2010).</li><li>Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nanoparticles+for+intracellular+sensing:+a+review.">Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing: a review.</a> Anal. Chim. Acta. 751, 1-23 (2012).</li><li>Wu, C., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+fluorescent+semiconducting+polymer+dots+for+biology+and+medicine.">Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 3086-3109 (2013).</li><li>Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots.">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nat. Methods. 2, 743-749 (2005).</li><li>Kumar, D., Saini, N., Jain, N., Sareen, R., Pandit, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles:+an+era+in+bionanotechnology.">Gold nanoparticles: an era in bionanotechnology.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 10, 397-409 (2013).</li><li>Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+of+engineered+gold+nanoparticles+into+mammalian+cells.">Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells.</a> Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).</li><li>Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+size+and+shape+dependence+of+gold+nanoparticle+uptake+into+mammalian+cells.">Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells.</a> Nano Lett. 6, 662-668 (2006).</li><li>Finlay, B. B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+mammalian+host+cell+functions+by+bacterial+pathogens.">Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens.</a> Science. 276, 718-725 (1997).</li><li>Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+host-cell+pathways+by+bacterial+pathogens.">Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens.</a> Nature. 449, 827-834 (2007).</li><li>Malik-Kale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+-+at+home+in+the+host+cell.">Salmonella - at home in the host cell.</a> Front. Microbiol. 2, 125 (2011).</li><li>Rajashekar, R., Liebl, D., Seitz, A., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+remodeling+of+the+endosomal+system+during+formation+of+Salmonella-induced+filaments+by+intracellular+Salmonella+enterica.">Dynamic remodeling of the endosomal system during formation of Salmonella-induced filaments by intracellular Salmonella enterica.</a> Traffic. 9, 2100-2116 (2008).</li><li>Schroeder, N., Mota, L. J., Meresse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella-induced+tubular+networks.">Salmonella-induced tubular networks.</a> Trends Microbiol. 19, 268-277 (2011).</li><li>Drecktrah, D., Knodler, L. A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+trafficking+is+defined+by+continuous+dynamic+interactions+with+the+endolysosomal+system.">Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system.</a> Traffic. 8, 212-225 (2007).</li><li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+of+preparing+gold+probes+for+multiple-labeling+cytochemistry.">A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry.</a> Eur. J. Cell Biol. 38, 87-93 (1985).</li><li>Zhang, Y., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanoparticles+as+endocytic+tracers+in+cellular+microbiology.">Evaluation of nanoparticles as endocytic tracers in cellular microbiology.</a> Nanoscale. 5, 9296-9309 (2013).</li><li>Pollard, T. D., Earnshaw, W. C., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+22.">Chapter 22.</a> Cell Biology. , (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> LysoTracker and LysoSensor Probes. , (2013).</li><li>Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+biocompatible+and+long-life+marker+for+lysosome+labeling+and+tracking.">Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking.</a> Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).</li><li>Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+putative+effector+proteins+of+the+type+III+secretion+system+of+Salmonella+pathogenicity+island+2+are+required+for+bacterial+virulence+and+proliferation+in+macrophages.">Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages.</a> Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).</li><li>Beuzon, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+maintains+the+integrity+of+its+intracellular+vacuole+through+the+action+of+SifA.">Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA.</a> EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

מערכת אנדו-lysosomal של תאי יונקים שולטת בתהליכים פיסיולוגיים חשובים, כוללים מזין קליטה, הולכים אותות בתיווך הורמון, מעקב חיסוני, והצגת אנטיגן 17. עד עכשיו, מגוון רחב של סמנים שימש במשך תיוג של לימודי מסלול ומעקב endocytic. לדוגמא, בדיקות Lysotracker הן בדיקות ניאון acidotropic שפות?...

חלקיקי ניאון (NPS), כוללים צירופים ומתכת, נקודות קוונטיות, צירופים ופולימר, צירופים וסיליקה, נקודות פחמן, וכו &#39;, משכו תשומת לב רבה במהלך העשורים האחרונים 1,2. בהשוואה לצבעים אורגניים מסורתיים, צירופים וניאון להראות כימיים, תכונות אופטיות ומכאניות רצויות, כגון עוצמת אות חזקה, התנגדות לphotobleaching ו3,4 biocompatibility גבוה. יתרונות אלה הופכים אותם לשיטת בחירה של חישה תאית והדמיה תא חי. יתר על כן, מגוון רחב של צירופים ואלקטרון-צפוף גלוי על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים (EM), המאפשר את השימוש בם לניתוח מיקרוסקופי מתואם, המאפשר שילוב של תא חי מעקב עם מיקרוסקופ אור (LM) ורזולוציה גבוהה יותר ברמת ultrastructural עם EM 5. לדוגמא, צירופים וזהב היו זמן רב ביעילות משמש כחיישנים ביולוגיים בתאים חיים לאבחון רגיש, כמו גם בתחום אימונו-תיוג 6. ים האחרוןtudies עולה כי צירופים וזהב עם גודל וצורה שונים יכול להיות בקלות ספיגה על ידי מגוון גדול של שורות תאים ובאופן שיגרתי להעביר דרך מסלול endosomal, ולכן יש לי יצור פוטנציאל גדול הגיש בקשה למעקב תחבורה השלפוחית ​​תאית ותיוג מערכת אנדו-lysosomal 7,8 . פתוגנים חיידקים, כגון סלמונלה enterica, flexneri Shigella וחיידקים ליסטריה, פיתחו מנגנונים שונים כדי לפלוש תאי מארח שאינו phagocytic 9. לאחר שהפנים, פתוגנים, מקומי או בcytosol או מוחרם בתאי קרום נכנסים, אינטראקציה נרחבת עם סביבות המארח שלהם ולווסת את אלה לטובת ההישרדות שלהם 10. לדוגמא, enterica סלמונלה מתגורר ומשכפל בתוך תא phagosomal תאית המכונה vacuole המכיל סלמונלה (SCV) על זיהום 11. SCV ההתבגרותtraffics כלפי מערכת גולג&#39;י, עוברים אינטראקציות רציפות עם מסלול endocytic, וגורם להיווצרות של מבנים נרחבים צינורי, כגון חוטי -induced סלמונלה (SIF), מיון tubules nexin, 3 tubules סלמונלה מוביל הפרשת -induced חלבון קרום (SCAMP3), וכו &#39; . 12-14. לומדים איך חיידקים פתוגנים אלה לתפעל מסלולי מארח תאים חיוני להבנת מחלה זיהומית. כאן, צירופים וזהב-BSA-rhodamine שמשו כקליעים נותבים נוזל לתייג מערכת אנדו-lysosomal הסלולרית המארח, והפתוגן עיכול Typhimurium serovar enterica אדם סלמונלה (Salmonella) שימש כחיידק מודל ללמוד את יחסי הגומלין של הפתוגן עם לארח מסלול endocytic. צירופים וזהב-BSA-rhodamine תאיים בתאים הנגועים באי ותאים נגועים בסלמונלה WT או זנים מוטנטים היו צילמו על ידי מיקרוסקופ confocal לייזר סריקה (CLSM).אז תוכנת Imaris שימשה לכמת את ההפצה של צירופים ו, מצביע על כך שזיהום סלמונלה מושרה סידור מחדש קיצוני של endosomes / lysosomes. לאחר התיאור של שיטה זו, יכולים להיות מתוכנן ניסויים מקבילים כדי לעקוב אחר גורל לטווח הארוך של צירופים והמופנמים ולחקור את ההשפעה של חומרים אקסוגניים שונים או גורמים במשק על מסלול endocytic של תאים האיקריוטים.

<table><tbody><tr><td>Gold chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Tannic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>403040</td><td></td></tr><tr><td>Tri-sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Rhodamine</td><td>Pierce</td><td>46406</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Applichem</td><td>A1492</td><td></td></tr><tr><td>Kanamcyin</td><td>Roth</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Roth</td><td>6344</td><td></td></tr><tr><td>8-well chamber slides</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>tissue culture treated, sterile</td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Bitplane</td><td>version 7.6</td><td>various configurations available</td></tr></tbody></table>

application of fluorescent nanoparticles to study remodeling of the endo-lysosomal system by intracellular bacteria

חלקיקי ניאון (NPS) עם כימי רצוי, תכונות אופטיות ומכאניות הם כלים מבטיחים לתייג אברונים תוך-תאיים. כאן, אנו מציגים שיטה באמצעות זהב-BSA-rhodamine צירופים ולתייג את מערכת אנדו-lysosomal של תאים האיקריוטים ולעקוב אחר מניפולציות של מסלולים סלולריים מארח ידי enterica סלמונלה הפתוגן תאיים. הצירופים והופנמו בקלות על ידי תאי הלה ומקומיים בendosomes / lysosomes מאוחר. זיהום סלמונלה מושרה סידור מחדש של שלפוחית ​​והצטברות של צירופים ובמבני קרום Salmonella- מושרה. אנחנו פרסנו את חבילת תוכנת Imaris לניתוחים כמותיים של תמונות מיקרוסקופיה confocal. מספר האובייקטים והתפלגות גודלם בתאים הנגועים שאינם היו שונים מאלה בתאי -infected סלמונלה, המציין מאוד שיפוץ של מערכת אנדו-lysosomal ידי WT סלמונלה.

צירופים וזהב שהופקו באמצעות שיטה מבוססת היטב באמצעות הפחתה של חומצת chloroauric ידי ציטראט וחומצה טאני. כפי שניתן לראות באיור 2 א, הצירופים והזהב מסונתזים היו מעין-כדוריים בצורה בגודל של כ -10 ננומטר. BSA-הציפוי וrhodamine תיוג לא השפיעו המורפולוגיה שלהם או גודל (איו?...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria at JoVE.com

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

מאמר זה מתאר שיטות לסינתזה ותיוג ניאון של חלקיקים (NPS). הצירופים ויושמו בניסויי דופק מרדף לתייג מערכת אנדו-lysosomal של תאים האיקריוטים. מניפולציה של מערכת אנדו-lysosomal על ידי פעילויות של enterica סלמונלה הפתוגן תאיים היו במעקב על ידי הדמיה תא החי ולכמת.

יישום של פלורסנט חלקיקים לחקר שיפוץ של מערכת Endo-lysosomal על ידי חיידקים תאיים

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

application-fluorescent-nanoparticles-to-study-remodeling-endo

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K Views.  Universität Osnabrück.  מאמר זה מתאר שיטות לסינתזה ותיוג ניאון של חלקיקים (NPS). הצירופים ויושמו בניסויי דופק מרדף לתייג מערכת אנדו-lysosomal של תאים האיקריוטים. מניפולציה של מערכת אנדו-lysosomal על ידי פעילויות של enterica סלמונלה הפתוגן תאיים היו במעקב על ידי הדמיה תא החי...

Video: Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To study retrograde protein traffic, we have recently developed a versatile nanobody-based toolkit to analyze transport from the cell surface to the Golgi complex, either by fixed and live cell imaging, by electron microscopy, or biochemically. We engineered functionalized anti-green fluorescent protein (GFP) nanobodies &#8212; small, monomeric, high-affinity protein binders &#8212; that can be applied to cell lines expressing membrane proteins of interest with an extracellular GFP moiety. Derivatized nanobodies bound to the GFP reporters are specifically internalized and transported piggyback along the reporters&#39; sorting routes. Nanobodies were functionalized with fluorophores to follow retrograde transport by fluorescence microscopy and live imaging, with ascorbate peroxidase 2 (APEX2) to investigate the ultrastructural localization of reporter-nanobody complexes by electron microscopy, and with tyrosine sulfation (TS) motifs to assess kinetics of trans-Golgi network (TGN) arrival. In this methodological article, we outline the general procedure to bacterially express and purify functionalized nanobodies. We illustrate the powerful use of our tool using the mCherry- and TS-modified nanobodies to analyze endocytic uptake and TGN arrival of cargo proteins.

Retrograde transport of proteins from the cell surface to the Golgi is essential to maintain membrane homeostasis. Here, we describe a method to biochemically analyze cell surface-to-Golgi transport of recombinant proteins using functionalized nanobodies in HeLa cells.

ניתוח של ספיגת Endocytic ותעבורה רטרוגרדית לרשת הטרנס-גולג'י באמצעות Functionalized Nanobodies בתאים בתרבית

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Biochemistry

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

חקר Phagolysosome Biogenesis בהמקרופאגים בשידור חי

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

gingivalis Porphyromonas כאורגניזם מודל להערכת אינטראקציה של חיידקים אנאירוביים עם תאי מארח

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Neuroscience

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence microscopy as observations made at a population level may not truly reflect what occurs at a single cell level. Live-cell timelapse microscopy allows investigators to monitor the changes in cell division or cell morphology which provide valuable insights regarding subcellular localization of proteins and timing of gene expression, as it happens, to potentially aid in answering important biological questions. Here, we describe our protocol to monitor phenotypic changes in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus using a high-resolution deconvolution microscope. The objective of this report is to provide a simple and clear protocol that can be adopted by other investigators interested in conducting fluorescence microscopy experiments to study different biological processes in bacteria as well as other organisms.

This article provides a step-by-step guide to investigate protein subcellular localization dynamics and to monitor morphological changes using high-resolution fluorescence microscopy in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית החיה כדי לחקור את הלוקליזציה של חלבון Subcellular ושינויי מורפולוגיה של תאים בחיידקים

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Biology

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling, and Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase nutrients and other material in cells. The dramatic extension of cell surface ruffles, their closure to form macropinosomes, and the maturation of internalized macropinosomes are key events in this pathway that can be difficult to capture using conventional confocal imaging based on tracking a bolus of fluorescent cargo. Fluorescent dextrans are commonly used experimentally as fluid phase markers for macropinosomes and for other endocytic pathways. A method the lab has adopted to optimize the imaging of dextran uptake involves using live imaging of cells bathed in high concentrations of fluorescent dextran in the medium, with the unlabeled cells appearing in relief (as black). The cell ruffles are highlighted to visualize ruffle closure, and internalized macropinosomes appear as fluorescent vacuoles in the cell interior. This method is optimal for visualizing macropinosome features and allows for easy segmentation and quantification. This paper describes dual-labeling of pathways with different sized dextrans and the co-expression of lipid probes and fluorescent membrane proteins to demark macropinosomes and other endosomes. The detection of internalized dextran at an ultrastructural level using correlative light and electron microscopy (CLEM) is also demonstrated. These cell processes can be imaged using multiple live imaging modalities, including in 3D. Taken together, these approaches optimize macropinosome imaging for many different settings and experimental systems.

This protocol demonstrates dextran imaging in live cells using continuous uptake and inverse images to optimize visualization of ruffling, macropinosome maturation, and analysis of dextran and other cell labelings.

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase ...

The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in the biogenesis of melanosomes, a lysosome-related organelle produced by melanocytes. REs deliver the melanocyte-specific cargo to premature melanosomes during their formation. Blockage in the generation of REs, observed in several mutants of Hermansky-Pudlak syndrome, results in hypopigmentation of skin, hair, and eye. Therefore, studying the dynamics (refer to number and length) of REs is useful to understand the function of these organelles in normal and disease conditions. In this study, we aim to measure the RE dynamics using a resident SNARE STX13.

Recycling endosomes are part of the endosomal tubular network. Here we present a method to quantify the dynamics of recycling endosomes using GFP-STX13 as an organelle marker.

המיקרוסקופיה מבוססת אסאי ללמוד ולנתח את אנדוזומים מיחזור באמצעות סחר SNARE

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in ...

An Introduction to Endocytosis and Exocytosis

Cells can take in substances from the extracellular environment by endocytosis and actively release molecules into it by exocytosis. Such processes involve lipid membrane-bound sacs called vesicles. Knowledge of the molecular architecture and mechanisms of both is key to understanding normal cell physiology, as well as the disease states that arise when they become defective. This video will first briefly review a few pivotal discoveries in the history of endo- and exocytosis research. Next, some key questions will be examined, followed by a discussion of the prominent methods used to investigate these problems, including cell labeling, fusion assays, and fluorescence imaging. Finally, it will explore current research being conducted by scientists in the field today.

Endocytosis and Exocytosis; Clathrin Coated Pits and SNAREs

מבוא לאנדיציטוזיס ואקסוציטוזיס

Cells can take in substances from the extracellular environment by endocytosis and actively release molecules into it by exocytosis. Such processes ...

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Cell Biology

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging

Source: Tsuruta, F., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55488">Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates how neuronal vesicles are labeled with specific fluorescent proteins to visualize their movement. First, a plasmid coding for a fluorescent protein is incubated with a transfection agent and then introduced into a culture of neurons. Subsequently, images of the neurons are acquired and analyzed to track the vesicles&#39; movement.

הדמיה של תנועתיות שלפוחית בתאי עצב באמצעות הדמיה פלואורסצנטית

1. Imaging Vesicle Motility

	Prepare the plasmids that will label each type of vesicle. For instance, use EGFP-Rab5 for early endosomes, EGFP-Rab7 for ...

יישום של פלורסנט חלקיקים לחקר שיפוץ של מערכת Endo-lysosomal על ידי חיידקים תאיים

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST