This work was supported by NIH grants to T.W. (R01AI072060 and R01AI099123). G. Xie was supported by a Sealy Center for Vaccine Development Predoctoral Fellowship. We thank Dr. Richard Flavell (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven) and Dr. Shizuo Akira (Osaka University, Japan) for providing the MyD88&#8211;/&#8211; mice and Dr. Y Cong (UTMB, Galveston) for providing OTII transgenic mice.

כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת טקסס רפואית הסניף. 1. בידוד של DCs מעכברים נגועים ללא ונגוע WNV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאמה לגיל ושיסוד פעילות המינית 6-10 בן שבוע, wild-type C57BL / 6 (B6) וMyD88 - / - עכברים. לחסן intraperitoneally (IP) עם 500 יחידות פלאק ויוצרים (PFU) של המוטציה WNV NS4B- P38G. ביום 3 לאחר פגיעה, להרדים MyD88 B6 ו-- / - עכברים עם CO 2. השתמש בעכברים שאינם נגועים בשתי הקבוצות שולטת. השתמש בשלושה עכברים מכל קבוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרווה רטובה על צד השמאלי של עכבר הקריב באמצעות אתנול 70% וחתכה את הפרווה בצד השמאלי של העכבר, כמחצית דרך בין החלק הקדמי ורגליו האחוריות. גזור לפתוח את חלל הגוף. הסר את הטחול באמצעות המלקחיים. מניחים את הטחול בצלחת פטרי עם RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד DCs טחול באמצעות חרוזים מגנטיים אנטי-CD11c פיהוראות היצרן. </li></ol> 2. טיהור ותיוג של תאי T של עכברים הטרנסגניים OTII <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר טחול אחד מעכבר OTII נאיבי כמתואר בשלב 1.2 לעיל וhomogenize הטחול בין הקצוות החלבית של שתי שקופיות. מעביר את ההשעיה לתא צינור חרוטי 15 מיליליטר, להוסיף בינוני RPMI עד 14 מיליליטר. בואו ההשעיה לשבת במשך 5 דקות ולהעביר 13 מיליליטר של אותו צינור חרוטי 15 מיליליטר חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד תאי CD4 + T טחול באמצעות ערכת בידוד תא CD4 + T על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאים לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר, לשטוף פעמיים עם PBS. תאים גלולים בPBS עם אלבומין 0.5% בסרום שור (BSA) בשעה 1 x 10 6 תאים לכל מיליליטר, ולהוסיף 0.5 μmol / מיליליטר של CFSE. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, מוגנות מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר בינוני מלא קר (RPMI-1640 עם 10% בסרום שור עוברי חום מומת, כרך 1/100אנטיביוטיקה / antimycotics, 1/100 כרך L-גלוטמין ו 1/1000 כרך של 1000 x 2-mercaptoethanol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על קרח למשך 5 דקות. לשטוף את תאי פעם עם PBS, לתקן 0.2 x 10 6 תאי CD4 + T שכותרתו ב 2% PFA ולרכוש על cytometer זרימה. השתמש בדוגמה זו כדי לקבוע את הרמה הבסיסית של CFSE. מחדש להשעות את שאר תאים שכותרתו במדיום מלא. </li></ol> 3. תאים Co-תרבות OTII T עם DCs של עכברים נגועים WNV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות 2 x 10 5 תאים של עכברי OTII CD4 + T מטוהרים לבד או עם DCs המטוהר של wild-type או MyD88 - / - עכברים (2 x 10 4) בצלחת גם 24 עם או בלי שאריות OVA 323-339 (ז 1 / מיליליטר) ב 1 מיליליטר בינוני מלא בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים. קציר תאים, לשטוף פעמיים במאגר FACS (PBS עם 1% FBS) ולתקן ב0.25 מיליליטר 2% PFA. מערבולת באופן מיידי. </li></ol> 4. ניתוח תזרים Cytometry של במבחנה &lt;/ Em&gt; תא T לקרקע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכישה, לחץ לחיצה כפולה על סמל תוכנת cytometry הזרימה. עבור חלקת צפיפות של יניארי FSC-מול SSC-ליניארי, ערוצים בחרו 0 עד 200,000 בFSC-ו0 עד 200,000 על SSC-. ואז ליצור שער על תאי חיים (P2, ראה איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את עוצמת הקרינה של CFSE, לפתוח את ההיסטוגרמה עבור ערוץ FL1 ולרכוש 20,000 אירועים על האוכלוסייה מגודרת. הגדר את סמן על דגימות תאים בתרבית OTII לבד (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש דוגמאות לתאי OTII שיתוף תרבותיים עם DCs wild-type (איור 1) או MyD88 - / - DCS (איור 1 ג) באופן דומה. </li></ol> 5. בידוד וגירוי של Splenocytes לציטוקין מבחני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק B6 וMyD88 - / - עכברים עם המוטציה WNV NS4B-P38G באותו האופן כפי שתואר בSTEp 1.1. ביום 30 לאחר פגיעה, מחדש אתגר ששרד עכברים עם 2000 PFU של ip הזן הפראי סוג WNV בימים 8 ו -21 זיהום על-יסודי WNV או ביום 4 הבאים זיהום משני, להרדים עכברים עם CO 2 לאוסף של טחולים . הערה: השתמשנו 2-3 עכברים בכל קבוצה לכל נקודת זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך השעיה תא בודדת של splenocytes כמתואר לעיל בשלב 1.2 ושלב 2.2. ספירת תאים באמצעות hemocytometer מחדש להשעות אותם ב 10 מיליליטר בינוני שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תאים עם מדיום מלא ל -2.5 x 10 6 תאים / מיליליטר. הוסף 1 מיליליטר של splenocytes בצינור מיקרו צנטריפוגות 1.5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לדמות תאי CD8 + T, לדלל פפטידים WNV הספציפי NS4B וE (SSVWNATTA וIALTFLAV) ל1 מ&quot;ג / מיליליטר בDMSO. לגירוי של תאי CD4 + T, לדלל פפטידים WNV הספציפי ns3 ו- E (RRWCFDGPRTNTILE וPVGRLVTVNPFVSVA) ל1 מ&quot;ג / מיליליטר בDMSO. הוסף 10 μl של פפטידים לתאים followeד על ידי 1 μl של פתרון Brefeldin. השתמש בתאים ללא טיפול פפטידים כפקדים. מערבבים את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אגרוף שני חורים עם מחט G 18 בכובע של הצינור. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 שעות. </li></ol> 6. תאיים ציטוקין מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאי צינור מיקרו צנטריפוגות חדשה. ספין תאים 5 דקות ב300-400 XG ויוצקים את supernatant. הוסף 1 מיליליטר FACS חיץ, ספין 5 דקות ב300-400 XG מחדש להשעות תאים על ידי pipetting עם 120 μl FACS חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl חוסם Fc דגירה תאים בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. הוסף 1 מיליליטר FACS חיץ על צינור אחד. ספין 5 דקות ב300-400 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות מחדש תאים ב300 μl FACS חיץ ולפצל אותם לשלושה צינורות (כ -0.8 x 10 6 תאים לכל צינור). כפי שניתן לראות בטבלה 1, שומרים לעצמנו את הצינור הראשון של כל מצב תרבות לחולדת צביעת IgG-PE. לצינור השני, להוסיף 3 μl של אנטי-CD4 APC לCD4 תאי פפטידים שטופלו, 3 μl אנטי CD8 FITC לתאים שטופלו-פפטידים CD8 או שניהם הנוגדנים לתאים ללא טיפול פפטידים. השתמש בצינור השלישי לצביעת פיצוי. עבור כל מצב תרבות, להשתמש בשלושה צינורות של תאי CD4 מוכתמים בAPC-מצומדות, CD8 FITC- מצומדות או נוגדני PE- כותרת CD3 לבד (3 μl לכל צינור) כפקדי פיצוי על FL1, fl2 וערוצי FL4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים בקצרה מערבולת. השאר על קרח למשך 20 דקות ולהגן מפני אור. להוסיף 1.4 מיליליטר חיץ FACS. ספין 5 דקות ב300-400 XG ויוצקים את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתסיס לשבש תא גלולה (או בקצרה מערבולת). מחדש להשעות תא גלולה ב250 pipetting solutionby הקיבעון / permeabilization μl. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות ולהגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.2 מיליליטר חיץ FACS. דקות ספין 5 ב300-400 תאי XG וגלולים במאגר FACS 300 μl. הערה: בשלב זה, ניתן להעביר תאים למעבדה BL2 לעיבוד נוסף או לאחסן במקרר ומוגן מפני אור לup לשלושה ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl FACS חיץ. ספין 5 דקות ב300-400 תאי XG וגלולים ב500 μl של חיץ permeabilization / לשטוף 1x. ספין 5 דקות ב300-400 גר &#39;x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות מחדש תאים ב100 μl 1x פרם / לשטוף, להוסיף 3.5 אנטי-IFNγ-PE μl לצינור הוסיף בעבר עם נוגדנים לCD4 ו / או סמני תא CD8 T בשלב 6.3 ועכברוש μl 3.5 IgG-PE בצינור שמורות לשליטת IgG במשך 25 דקות על קרח ולהגן מפני אור. לשטוף את התאים על ידי הוספת 1.4 מיליליטר של חיץ permeabilization / לשטוף 1x. ספין 5 דקות ב300-400 גר &#39;x. חזור על שלב הכביסה על ידי הוספת 1.4 מיליליטר 1x חיץ permeabilization / לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין 5 דקות ב300-400 XG ולמזוג supernatant. לשטוף את התאים על ידי הוספת 1.4 מיליליטר של חיץ FACS מחדש להשעות ב400 μl של חיץ FACS לרכישה סופית. </li></ol> 7. ניתוח תזרים Cytometry של תאיים ציטוקין מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באותן הגדרות כמו בשלב הרכישה 4.1. Create שער על תאי חיים (P2, ראה איור 2 א). התאם את המתח באמצעות צינורות פיצוי לכל אחת מקבוצות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני מגרשי נקודה חדשים פתוחים, אחד כדי להציג נתונים שנאספו לFL1 vs. Fl2 (CD8 vs. IFN-γ), והשני הוא להציג נתונים שנאספו לFL4 vs. Fl2 (CD4 vs. IFN-γ). לרכוש 50,000 אירועים לאוכלוסייה מגודרת של כל דגימה. </li></ol>

<ol>
	<li>Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus.">West Nile virus.</a> Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).</li><li>Welte, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+an+attenuated+West+Nile+virus+NS4B-P38G+mutant+strain.">Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain.</a> Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).</li><li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+control+of+the+adaptive+immune+responses.">Toll-like receptor control of the adaptive immune responses.</a> Nat. Immunol. 5, 987-995 (2004).</li><li>Akira, S., Hemmi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+pathogen-associated+molecular+patterns+by+TLR+family.">Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family.</a> Immunol. Lett. 85, 85-95 (2003).</li><li>Xie, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+West+Nile+virus+NS4B-P38G+mutant+strain+induces+adaptive+immunity+via+TLR7-MyD88-dependent+and+independent+signaling+pathways.">A West Nile virus NS4B-P38G mutant strain induces adaptive immunity via TLR7-MyD88-dependent and independent signaling pathways.</a> Vaccine. 31 (38), 4143-4151 (2013).</li><li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammadelta+T+cells+promote+the+maturation+of+dendritic+cells+during+West+Nile+virus+infection.">gammadelta T cells promote the maturation of dendritic cells during West Nile virus infection.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 59, 71-80 (2010).</li><li>Silva, M. C., Guerrero-Plata, A., Gilfoy, F. D., Garofalo, R. P., Mason, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activation+of+human+monocyte-derived+and+plasmacytoid+dendritic+cells+by+West+Nile+virus+generated+in+different+host+cells.">Differential activation of human monocyte-derived and plasmacytoid dendritic cells by West Nile virus generated in different host cells.</a> J. Virol. 81, 13640-13648 (2007).</li><li>Shrestha, B., Samuel, M. A., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+Cells+Require+Perforin+To+Clear+West+Nile+Virus+from+Infected+Neurons.">CD8+ T Cells Require Perforin To Clear West Nile Virus from Infected Neurons.</a> J. Virol. 80, 119-129 (2006).</li><li>Wang, Y., Lobigs, M., Lee, E., Mullbacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+cells+mediate+recovery+and+immunopathology+in+West+Nile+virus+encephalitis.">CD8+ T cells mediate recovery and immunopathology in West Nile virus encephalitis.</a> J. Virol. 77, 13323-13334 (2003).</li><li>Plebanski, M., Katsara, M., Sheng, K. C., Xiang, S. D., Apostolopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+measure+T-cell+responses.">Methods to measure T-cell responses.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 595-600 (2010).</li><li>Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+cell+division+in+vivo+and+in+vitro+using+flow+cytometric+measurement+of+CFSE+dye+dilution.">Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution.</a> J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).</li><li>Kraus, A. A., Priemer, C., Heider, H., Kruger, D. H., Ulrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Hantaan+virus-containing+samples+for+subsequent+investigations+outside+biosafety+level+3+facilities.">Inactivation of Hantaan virus-containing samples for subsequent investigations outside biosafety level 3 facilities.</a> Intervirology. 48, 255-261 (2005).</li><li>Saxena, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hamster-derived+west+nile+virus+isolate+induces+persistent+renal+infection+in+mice.">A hamster-derived west nile virus isolate induces persistent renal infection in mice.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 7, 2275 (2013).</li><li>Welte, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vgamma4++T+cells+regulate+host+immune+response+to+West+Nile+virus+infection.">Vgamma4+ T cells regulate host immune response to West Nile virus infection.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 183-192 (2011).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

WNV הוא פתוגן BL3. בשל תקנות בטיחות, מבחני אימונולוגיים עם דגימות נגועות WNV לעתים קרובות מוגבלים על ידי הזמינות של ציוד במתקנים BL3 או יותר ארוכים ומייגע לבצע. במחקר שנערך לאחרונה, השתמשנו בשתי שיטות מבוססות cytometry זרימה ללמוד תגובות חיסוני בתיווך תא במהלך זיהום WNV 5. ב...

וירוס הנילוס המערבי (WNV), neurotropic, בתוספת חש-flavivirus, הוא איום על בריאות ציבור מתעורר. נכון לעכשיו, אין חיסונים אושרו לשימוש בבני אדם 1. זן WNV מוחלש, שבו יש תחלופה P38G בחלבון 4B nonstructural (NS), ידוע לגרום לא קטלני בעכברים אבל ציטוקינים מולדים גבוה יותר ותגובות של תאי T בעכברים מאשר wild-type WNV NY99 זן 2. עכברים שחוסנו עם המוטציה NS4B-P38G היו מוגנים מפני כל אתגר המשני עם wild-type הקטלני WNV. הדבר מצביע על כך שיש המוטציה NS4B-P38G תכונות מתאימות למועמד אידיאלי חיסון. המנגנונים שבאמצעותם המוטציה NS4B-P38G גורמת חסינות אדפטיבית מגן גבוהה לא ברור הם הבינו עדיין. קולטנים כמו אגרה (TLRs), אשר מכירים הבקשורים דפוסים מולקולריים הפתוגן, ממלאים תפקיד חיוני בייזום של חסינות מולדת לזיהום נגיפי. מסלול איתות TLR ליבה מנצל תגובה הראשונית בידול מיאלואידית gene 88 (MyD88) כמתאם הראשי 3,4. במחקר שנערך לאחרונה, איתות MyD88 הוצגה לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות של חסינות תא בתיווך בזיהום המוטציה WNV NS4B- P38G בעכברי 5. תאי Dentritic (DC) הם אחד מתאי מציגי אנטיגן החשובים ביותר מציגים היכולת הייחודית ליזום תגובות תא T העיקרי בזיהום ויראלי 6,7. CD4 + CD8 + ותאי T הן לתרום לחסינות לטווח ארוכה וחשובים להישרדות מארח בעקבות זיהום WNV wild-type 8,9. שני מבחני אימונולוגיים שמשו במחקר זה להעריך את הפונקציות של תאים אלה בעכברים שעברו מוטציה נגועה NS4B-P38G. ראשית, assay תחול במבחנה תא T נוצל כדי להשוות את יכולת מציגי אנטיגן של DCs של נגוע WNV wild-type וMyD88 - / - עכברים. כדי להגביר את הרגישות של assay, CD4 הנאיבי &lt;sup&gt; + תאי T היו מבודדים מעכברים מהונדסים OTII, המבטאים ספציפי Vα2 / Vβ5 TCR לovalbumin העוף פפטיד (OVA) 323 - 339. DCs של עכברים נגועים WNV היה מטוהרים, ושיתוף תרבותי עם carboxyfluorescein succinimidyl פסחא (CFSE ) תאי CD4 + T שכותרתו בנוכחות פפטיד OVA. לאחר 5 ימים של התרבות המשותפת, תאים נקצרו וקבוע עם paraformaldehyde (PFA) ונותחו על ידי הזרימה cytometry. מבחני שגשוג בוצעו באופן מסורתי באמצעות שילוב של 5-bromo-2&#39;-deoxyuridine (BrdU) או deoxyriboside tritiated הטימין (3 HTdr) 10. עם זאת, מבחני אלה הם או רדיואקטיביים ו / או בצורך של ציוד מיוחד ברמת הבטיחות ביולוגית (BL) 3 מתקנים, שבו מחקרי WNV מתבצעים. ניתוח התזרים cytometric של שגשוג לימפוציטים ידי halving הסידורי של עוצמת הקרינה של הצבע החיוני CFSE הפך נפוץ יותר במבחנים חיסוניים כצבע הוא יותר ביציבותושולב באופן שווה לתאים, זוהה בקלות על ידי cytometry זרימה, והוא nonradioactive 11. Assay יש גם את היכולת להעריך את מספר חלוקות תא. אחד יתרונות עיקריים של שימוש assay זה במחקרי WNV הוא שקיבוע של התאים הנגועים ב1-2% PFA יכול להשבית 12 WNV, אשר יאפשר רכישת מדגם עם cytometer זרימה במעבדה BL2. בשלב הבא, הליך מכתים ציטוקינים תאיים שונה (ICS) שימש כדי ללמוד את התפקיד של MyD88 איתות ברגולציה של תגובות תא T הספציפיות WNV בעכברים הנגוע במוטציה NS4B-P38G. ב assay זה, טופלו splenocytes מבודד מעכברים נגועים במבחנה עם פפטידים ספציפיים WNV. Brefeldin התווסף ללשמור ציטוקינים בתוך התא. אחרי 5 שעות דגירה, תאים נקצרו, שטפו ומוכתמים עבור תת תא T. תאים אז היו קבועים בPFA, permeabilized ומוכתמת לאינטרפרון -γ (IFN) ונותחו על ידי זרימת cytometry.כמו עם assay זרימה אחר מבוסס cytometry, פעם אחת מטופלות התאים עם קיבעון וחיץ permeabilization מכיל PFA, ניתן להעביר דגימות נגועות למעבדה BL2 לעיבוד וניתוח נוספים. במספר מחקרים שפורסמו, השתמשנו ICS למדוד פונקציות מפעיל סלולארי T בעכברים נגוע WNV 13,14. למרות שזה מבוסס היטב, חסרון עיקרי אחד של assay זה הוא שההליך הוא ארוך מאוד ויכול להיות זמן רב יותר כאשר היא מבוצעת בתוך מתקני BL3. כאן, שיטה מבוססת ICS צינור מיקרו צנטריפוגות הוצגה להיות יותר ריאלי, קל יותר להמשיך ופחות זמן רב כאשר היא מבוצעת בתוך מעבדה BL3.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="655">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:153px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11875</td>
			<td>warm up at 37C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-CD11c magnetic beads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-001</td>
			<td>follow the manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-CD4 magnetic beads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-248</td>
			<td>follow the manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CFSE</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">OVA residue 323-339</td>
			<td>Genscript Corporation</td>
			<td>RP10610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:216px;">Peptides</td>
			<td style="width:153px;">Proimmune</td>
			<td>PC0AD-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">Brefeldin A solution</td>
			<td style="width:153px;">BD Bioscience</td>
			<td align="right">555029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:216px;">Mouse Fc Blocker</td>
			<td style="width:153px;">e-Bioscience</td>
			<td>14-0161-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">APC-conjugated CD4&#160;</td>
			<td style="width:153px;">e-Bioscience</td>
			<td>17-0041-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">FITC-conjugated CD8&#160;</td>
			<td style="width:153px;">e- bioscience</td>
			<td>11-0081-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">Fixation/Permeabilization Solution</td>
			<td style="width:153px;">BD- Bioscience</td>
			<td align="right" style="width:119px;">554722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">Permeabilization/wash buffer</td>
			<td style="width:153px;">BD- Bioscience</td>
			<td align="right">554723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">anti-IFNg-PE&#160;</td>
			<td style="width:153px;">e-Bioscience</td>
			<td>12-7311-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:216px;">Accuri flow cytometer</td>
			<td style="width:153px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro analysis of myd88-mediated cellular immune response to west nile virus mutant strain infection

וירוס מוחלש הנילוס המערבי (WNV), (NS) 4B-P38G מוטציה nonstructural, מושרה ציטוקינים מולדים גבוה יותר ותגובות של תאי T מסוג wild-WNV בעכברים. לאחרונה, גורם בידול מיאלואידית 88 איתות (MyD88) הוצגה להיות חשוב ליחול תא T ראשוני ופיתוח תא T הזיכרון במהלך זיהום המוטציה WNV NS4B-P38G. במחקר זה, שני לזרום שיטות מבוססות cytometry - במבחנה assay תא T תחול ומכתים ציטוקינים תאיים (ICS) - נוצלו כדי להעריך תאים דנדריטים (DCS) ופונקציות תא T. בתא T תחול assay, התפשטות תאים נותחה על ידי זרימת cytometry הבא שיתוף התרבות של DCs משני הקבוצות של עכברים עם succinimidyl אסתר carboxyfluorescein (CFSE) - שכותרתו תאי CD4 + T של עכברים הטרנסגניים OTII. גישה זו סיפקה קביעה מדויקת של שיעור מתרבים תאי CD4 + T עם שיפור ברגישות לכללית מאשר המסורת באופן משמעותיאל מבחנים עם ריאגנטים רדיואקטיביים. מערכת צינור microcentrifuge הייתה בשימוש בשני הליכי תרבית התאים ומכתים ציטוקינים של פרוטוקול ICS. בהשוואה למערכת מבוססת צלחת תרבית רקמה המסורתית, הליך שינוי זה היה קל יותר לביצוע ברמת בטיחות ביולוגית (BL) 3 מתקנים. יתר על כן, טופלו תאים נגועים WNV- עם paraformaldehyde בשני מבחני, שאפשרו ניתוח נוסף מחוץ מתקני BL3. בסך הכל, ניתן להשתמש במבחנה מבחני אימונולוגיים אלה כדי להעריך ביעילות מערכת חיסונית בתיווך תא במהלך זיהום WNV.

בassay תא T תחול, תאי CD4 + T CFSE שכותרתו היו בתרבית עם DCs מטוהר מנגוע המוטציה wild-type NS4B-P38G וMyD88 - / - עכברים בנוכחותו או היעדריו של פפטידים OVA. תאי T שכותרתו בתרבית לבד עם או בלי OVA במשך 5 ימים שמשו כקבוצת ביקורת שלילית. כפי שניתן לראות באיור 1 א, הכולל תאי T היו סג...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection at JoVE.com

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

בניתוח חוץ גופייה של תיווך Myd88 הסלולרי תגובה החיסונית לוירוס הנילוס המערבי זיהום הזנים Mutant

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

in-vitro-analysis-myd88-mediated-cellular-immune-response-to-west

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

8.1K Views.  The University of Texas Medical Branch. Two flow cytometry-based methods – an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

Video: In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development of vaccines and therapeutics1,2,3. Here, we describe a method for the detailed phenotypic and functional analyses of cellular immune responses, specifically intracellular cytokine production by CD4+ and CD8+ T cells as well as the individual memory subsets. We obtained precise quantitative and qualitative measures for the production of interferon gamma (INF-) and interleukin (IL) -2 in both CD4+ and CD8+ T cells from the rhesus macaque PBMC stimulated with PMA plus ionomycin (PMA+I). The cytokine profiles were different in the different subsets of memory cells. Furthermore, this protocol provided us the sensitivity to demonstrate even minor fractions of antigen specific CD4+ and CD8+ T cell subsets within the PBMC samples from rhesus macaques immunized with an HIV envelope peptide cocktail vaccine developed in our laboratory. The multicolor flow cytometry technique is a powerful tool to precisely identify different populations of T cells 4,5 with cytokine-producing capability6 following non-specific or antigen-specific stimulation 5,7.

We demonstrate the utility of multicolor flow cytometry for detailed phenotypic and functional characterization of total as well as memory subsets of CD4+ and CD8+ T cells in rhesus macaques, the ideal model for HIV/AIDS vaccine studies.

Cytometry ססגוניות אנליזות זרימה של תגובה חיסונית תאית של קופי רזוס

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

שבעה צעדים Stellate תאים

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

מבוא של צרעות טפיליות<em&gt; תסיסנית</em&gt; ואת התגובה החיסונית Antiparasite

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, transmission of antibiotic resistant bacteria between animals and humans, and the high cost of treating infections.
In this study, we disclose a new strategy that may be effective in preventing implant-associated infection based on the potential antimicrobial properties of platelet-rich plasma (PRP). Due to its well-studied properties for promoting healing, PRP (a biological product) has been increasingly used for clinical applications including orthopaedic surgeries, periodontal and oral surgeries, maxillofacial surgeries, plastic surgeries, sports medicine, etc.
PRP could be an advanced alternative to conventional antibiotic treatments in preventing implant-associated infections. The use of PRP may be advantageous compared to conventional antibiotic treatments since PRP is less likely to induce antibiotic resistance and PRP's antimicrobial and healing-promoting properties may have a synergistic effect on infection prevention. It is well known that pathogens and human cells are racing for implant surfaces, and PRP's properties of promoting healing could improve human cell attachment thereby reducing the odds for infection. In addition, PRP is inherently biocompatible, and safe and free from the risk of transmissible diseases.
For our study, we have selected several clinical bacterial strains that are commonly found in orthopaedic infections and examined whether PRP has in vitro antimicrobial properties against these bacteria. We have prepared PRP using a twice centrifugation approach which allows the same platelet concentration to be obtained for all samples. We have achieved consistent antimicrobial findings and found that PRP has strong in vitro antimicrobial properties against bacteria like methicillin-sensitive and methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Group A Streptococcus, and Neisseria gonorrhoeae. Therefore, the use of PRP may have the potential to prevent infection and to reduce the need for costly post-operative treatment of implant-associated infections.

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

Implant-associated infection is a significant clinical complication. This study describes an approach using platelet-rich plasma (PRP) to prevent implant-associated infections, presents the protocol for preparing PRP with constant platelet concentration, and reports the newly identified antimicrobial properties of PRP and related protocols for examining such antimicrobial properties in vitro.

PRP כגישה חדשה למניעת זיהום: הכנה ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מאפיינים מיקרוביאלית של PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

באמצעות RNA-התערבות לחקר התגובה החיסונית המולדת בהמקרופאגים עכבר

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל למדידה של מערכת חיסונית למלריה בהקשר של HIV Co-זיהום

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

גישה פשוטה ויעילה לבנות וקטורי וירוס Vaccinia Mutant

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

דגם העכבר כדי להעריך מולדת התגובה החיסונית לזיהום Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...