We would like to acknowledge the Department of Pathology at the University of Illinois at Chicago for financial support. Histology and visible imaging services were provided by the Research Resources Center - Research Histology and Tissue Imaging Core at the University of Illinois at Chicago established with the support of the Vice Chancellor of Research, in particular we would like to thank Ryan Deaton and Andy Hall for their expertise. We would also like to thank Agilent Technologies, in particular Frank Weston for support and loaning of additional IR lens.

1. הגדרת FT-IR מיקרוסקופים ורכישת תמונות רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף בלוק קבוע פורמלין המוטבע פרפין רקמה ב 4 מיקרומטר עובי לשקופית תואמת IR באמצעות microtome. לחלופין, סעיף רקמת נוזל חנקן קפוא ב 4 מיקרומטר עובי על שקופית תואמת IR באמצעות cryostat. הערה: בדרך כלל, סעיף סדרתי יהיה גם רכש בשקופית זכוכית ומוכתמת במיוחד (כגון Haematoxylin וEosin (H &amp; E)) או כתם immunohistochemical. בנוסף, ניתן לגדל שורות תאים בתרבית בשקופיות תואמות IR. שקופיות תואמות IR יכולות להיות שקופיות רעיוני IR עבור הדמיה השתקפות מצב (לדוגמא, שקופיות MirrIR, זהב) או שקופיות שקופות IR עבור הדמיה מצב שידור (למשל, BAF 2, CAF 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טהר את המיקרוסקופ FT-IR וספקטרומטר או באמצעות אוויר יבש או גז חנקן יבש כדי להסיר מים באטמוספרה מהמערכת. חכה לפחות 45 דקות לפני ההדמיה כדי להבטיח purg יסודידואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני הגלאים מגניבים FPA (79 K) וגלאי MCT הפנימי במיקרוסקופ FT-IR באמצעות חנקן נוזלי. לקרר את הגלאים בערך כל שעה 6. זהירות! חנקן נוזלי הוא נוזל קירור ועלול לגרום לכוויות קור, כוויות קור ובמחנק חללים סגורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר שקופיות מדגם על הבמה מיקרוסקופ הדמיה FT-IR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא האור הנראה הוא &quot;ON&quot; ולאחר מכן גם באמצעות המשקפת או תכנית לכידת מדגם (המספק בזמן אמת תמונה נראית לעין של הרקמה), תתמקד במדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חבילת תוכנת חבילה כגון החלטות פרו ולחץ על &#39;אסוף&#39;, לאחר מכן &#39;אבחון&#39; ולאחר מכן בחר &#39;יישור ספקטרומטר &quot;לחץ. ודא שנתיב הקרן לגלאים הפנימיים ספקטרומטר אינו חסום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;התקנת הדמיה &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה &quot;האלקטרוניקה&quot;, בחר &#39;המהירות&#39; המתאימה &#39;, תחת Saיחס mpling (UDR) &#39;ו&#39; הגדרות &#39;מסננים בהתאם למערכת. הערה: בדוגמא זו, ההגדרה היא המהירות = 2.5 KHz, UDR = 4 ומסננים = אין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה &quot;אופטיקה&quot; להבטיח כי &quot;מקור Mid-IR &#39;,&#39; צמצם פתוח &#39;ו&#39; מחליש קרן 100% &#39;נבחרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכייל את המערכת, בכרטיסייה &#39;אופטיקה&#39;, &#39;הגלאי&#39; בחר בשם &quot;קרקע&quot;, &quot;מיקרוסקופ גלאי &#39;כ&#39;שמאל&#39;, ולאחר מכן בחרו באפשרות&quot; העברה &quot;או&quot; החזרה &#39;תחת&#39; מצב אופטיקה &#39;בהתאם לסוג של להחליק בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הגדרה, שיפתח את החלון &quot;לנסר הבקרה &#39;. הערה: למצב השתקפות לעקוב אחר הוראות ב1.12 1.13 ולמצב שידור לעקוב אחר הוראות ב1.14-1.16. המשך מ1.17 עבור שתי השתקפות והולכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למצב השתקפות, וב# 8216; &quot;לחץ על &#39;לנסר בקרת גלם&quot;. באמצעות ג&#39;ויסטיק שליטת במה וצופה בתצוגה החיה של תמונת FT-IR interferogram (תמונה עליונה מימין), לעבור לאזור נקי בשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את זמן אינטגרציה לכ -8,000 ספירה. בשלב הבא, להזיז את הבמה כדי למצוא פיסת הרקמה עם מבנה, רצוי קצה רקמה, ולשכלל את המיקוד של התמונה. &quot;החום&quot; השינוי והאפשרויות &#39;ניגודיות&#39; כדי לעזור ליצור תמונה כדי לשפר את ההתמקדות, זה לא יהיו כל השפעה על נתוני IR. המשך מ1.18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למצב שידור, בלחיצה &quot;לנסר הבקרה &#39;על&#39; גלם &#39;. באמצעות ג&#39;ויסטיק שליטת במה וצופה בתצוגה החיה של תמונת FT-IR interferogram (תמונה עליונה מימין), לעבור לאזור נקי של השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את זמן אינטגרציה לכ -8,000 ספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את תחתית התמקדות / אובייקטיבי הקבל להגדיל את מספר הספירות לmaximuמ &#39;. צפה בצורה של התמונה הימנית התחתונה בלנסר בקרה כדי להבטיח שזה גאוס במראה ואחיד יחסית. התאם את זמן האינטגרציה שוב לכ -8,000 ספירה. הערה: אם כל הפיקסלים בתמונה interferogram FT-IR להלבין, להפחית את זמן האינטגרציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הבמה כדי למצוא פיסת הרקמה עם מבנה, רצוי קצה רקמה ולשכלל את המיקוד של התמונה. לחלופין, לשנות את אפשרויות חום ולעומת זאת כדי לעזור ליצור תמונה כדי לשפר את המיקוד, אבל לא תהיה כל השפעה על נתוני IR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות ג&#39;ויסטיק שליטת שלב, לעבור לאזור נקי של השקופית. לחץ על הכפתור &#39;כייל &quot;. ודא &#39;מחוץ לתחום (Oor)&#39; הערך הוא פחות מ 50 ואת ההבדל בין &#39;הגבוה השטף&#39; והספירות &#39;נמוך Flux &quot;הוא לפחות 4,000 ספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;אישור&#39; פעמיים. בכרטיסיות אופטיקה לבחור; &quot;MCT &#39;=&#39; הגלאי &#39;,&#39; Microsלהתמודד ימני &#39;=&#39; הגלאי &#39;ולאחר מכן לחץ על&#39; הגדרות &#39;. בשלב זה לא יהיה interferogram FT-IR על המסך. לחץ על &quot;מצא את Centerburst &#39;. לחץ על &#39;אוקיי&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה &#39;אופטיקה&#39;, בחר שוב &#39;קרקע&#39; = &#39;הגלאי&#39;, &#39;מיקרוסקופים גלאי&#39; = &#39;שמאל&#39; ובחר &#39;הגדרות&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלנסר בקרה - להבטיח התמונה עדיין על אזור נקי ו&#39;כיול &#39;לחץ שוב. לחץ על &#39;אוקיי&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, לאסוף תמונת FT-IR רקע לתיקון לספיגה מהאווירה, המערכת והשקופיות. עבור לכרטיסייה &#39;האלקטרוניקה&#39; ובחר ברזולוציה הספקטרלית מתאימה, בדרך כלל של 4 סנטימטר -1 או 8 סנטימטר -1 לרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לכרטיסיית &#39;הרקע&#39; והקלד 128 ב&#39;סריקות לשתף להוסיף &quot;. בחר &#39;הקובץ החדש ... &quot;כפתור ולמקם את קובץ הרקע בקיפול מתאיםאה. בדוק כרטיסייה &#39;ההדמיה&#39; כדי להבטיח mosaicing היא 1 על ידי &#39;רקע&#39; 1. לחץ, לחכות לסריקה לסיים ולאשר היכן לשמור את הקובץ. לחץ על אזור תמונת FT-IR רקע ולבדוק את הספקטרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקחת תמונת פסיפס גדולה של המדגם, בחר בכרטיסייה &#39;ההדמיה&#39; ולהכניס את מספר מסגרות X ו- Y לגודל הפסיפס שברצונך לרכוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;הגדרות&#39; ובלנסר בקרה להשתמש בתצוגה חי IR כדי למצוא את השטח של עניין. אם לוקח בפסיפס, במרכז בשידור החי באמצע השטח של עניין. לחץ על &#39;אוקיי&#39;. עבור לכרטיסייה &#39;האלקטרוניקה&#39; והקלד את מספר הסריקות לשתף להוסיף (בדרך כלל ערך בין 2 ל 16 סריקות לרקמות). לחץ על &quot;סרוק&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את תמונת FT-IR שנאסף על המסך כדי להבטיח שזה נראה ממוקד. לחץ על התמונה כדי להעלות את ספקטרום IR ממיקום זה ולבדוק שזה נראה לי אות מקובלת על רעש. אקימחדש תמונה נראית לעין של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את התמונה ולייצא אותו לפורמט הנדרש, כגון ENVI-IDL. </li></ol> 2. התאמת מיקרוסקופ FT-IR ליכולות גבוהה הגדרה הערה: רוב מערכות FT-IR מצוידות במטרה כ הגדלה 15X ו 0.5 צמצם מספרי (NA). לתמונה במצב בהבחנה גבוהה, IR אובייקטיבי 36x או 74X תואם ניתן להשתמש כדי לתת עקיפת יכולות הדמיה מוגבלות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר אובייקטיבי 15X של המערכת על-ידי שחרור נגד כיוון השעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בורג באו אובייקטיבי 36x או 74X במקומו. יישר את המטרה לפני השימוש. השתמש בצינורות ארכה העדשה להביא את המטרה קרובה מספיק למדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח רקמה תחת המטרה החדשה ולהתמקד באמצעות אור נראה או באמצעות המשקפת או תכנית לכידת לדוגמא. הערה: הדמיה גבוהה הגדרה חייב להיעשות במצב שידור. מרחק העבודה קרוב מאוד שליעדי se (1-2 מ&quot;מ) ועומק רדוד מאוד של מוקד דורשים התמקדות לאט ובזהירות, לוקחים זמן להוריד את המטרה בלי לגעת במדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר הוראות 1.6-1.11. הערה: בשל היותו באופן משמעותי קשה יותר להתמקד והרבה פחות אור מגיע לגלאי, הפרוטוקול הבא מותאם המבוסס על 1.14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במצב שידור, לחץ על &#39;גלם&#39;. באמצעות ג&#39;ויסטיק שליטת במה וצופה בתצוגה החיה של תמונת FT-IR interferogram (תמונה עליונה מימין), לעבור לרקמות ולהתמקד (באופן אידיאלי על קצה). הערה: זה עלול להיות קשה, ולכן להתאים את &quot;החום&quot; ואפשרויות &#39;ניגודיות&#39; כדי לעזור ליצור תמונה כדי לשפר את המיקוד (האפשרויות הללו לא ישפיעו על נתוני IR). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתמקד, באמצעות ג&#39;ויסטיק שליטת השלב ומהלך תצוגת IR החי לאזור נקי של השקופית. התאם את זמן אינטגרציה לכ -8,000 ספירה. התאם את תחתית התמקדות אובייקטיבית ללהגדיל את מספר הספירות למקסימום שלה. התאם את זמן האינטגרציה שוב לכ -8,000 ספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הבמה כדי למצוא פיסת הרקמה עם מבנה, רצוי קצה רקמה, ולשכלל את המיקוד של התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם mosaicking תמונה ברזולוציה גבוהה, להתאים את הבמה כדי לאפשר תנועה נכונה הנדרשת על פני מרחקים לmosaicing מדויקת. כדי לשנות את הגדרות מרחק הבמה, ללכת &quot;שלב התקנה &#39;בלנסר בקרה ולהתאים את הגדרות יישור אופקית ואנכיות כדי לאפשר mosaicking הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מהלך ג&#39;ויסטיק שליטת שלב לאזור נקי של השקופית. לחץ על הכפתור &#39;כייל &quot;. ודאו מטווח ערך (Oor) ​​הוא פחות מ -50 בשני 36x ו74X יעדים. להבטיח את ההבדל בין השטף הגבוה והערכים נמוכים שטף הוא לפחות 1,000 ספירה למטרת 74X ו2,000 ספירה למטרת 36x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך 1.19-1.27. מספר הסריקות ב1.23 ו1.25 יצטרכו להיות מותאמים בשל אות מופחתת בכ -256 סריקות לתמונת הרקע ו16-128 סריקות לתמונת הרקמה. </li></ol> 3. מערכי נתוני Spectral לדמיין סיווג IR הערה: בסעיף זה, נדון כיצד לחזות ולחלץ נתונים מתמונות רפאים באמצעות עיבוד תמונת גיאו-מרחבים וניתוח תוכנה כגון ENVI + IDL, אולם התהליך דומה מאוד לכל תוכנה חלופית כגון MATLAB, תוכנה חופשית כגון CytoSpec , או תוכנה של מפתחי המכשיר. יש כמה טכניקות עיבוד רפאים שונות שניתן לבצע על נתוני IR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיבוד תמונת גיאו-מרחבים פתוח ותוכנה לניתוח ולטעון את קובץ נתוני IR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל אלגוריתם תיקון בסיס לנתונים IR על ידי בחירה &quot;כלים Spectral&quot; ולגלול למטה ולחץ על &quot;ספקטרום ספיג&quot;. שים לב בתפריט מוקפץ ובחר &quot;קור Baselinection &quot; הערה: תיקון Baseline יסיר מדרון לקזז בסיס מנתונים בשל פיזור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע נורמליזציה Spectral, על ידי ratioing נתונים לשיא מסוים רפאים (בדרך כלל אמיד אני (1,650 -1 סנטימטר) או אמיד השני (1,550 -1 סנטימטר)) או באזור תחת אזור מוגדר של הספקטרום. עושה זאת על ידי בחירה באפשרות &quot;רגיל ספקטרום&quot; תחת אפשרויות תפריט &quot;הספיגה ספקטרה&quot;. הערה: הנורמליזציה Spectral מבוצעת כך שהבדלים בספקטרום הבדלים אמיתיים ביוכימי ולא בשל עובי או הבדלי צפיפות בין דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באלגוריתם הפחתת רעש להסיר רעש מהספקטרום אם 28 דרושים. הערה: ישנן גישות זמינות מרובות שבו ניתן להשיג תיקון בסיס, נורמליזציה רפאים והפחתת רעש, עם רוב התוכנות שיש אלגוריתמים אוטומטיים שנבנו בכמו כן, יש מספר עולה של גישות שתתקנה ל.סטיות רפאים, אשר נדונו בפירוט 29-42; עם זאת, הקהילה עדיין אינה מסכימה על איזה מאלה יש צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב רשימה של כל תדרי IR שנאספו בתוך התמונה (בדרך כלל של טווח ספקטרום 900 ל -4,000 -1 סנטימטר). לחץ על התדרים שמתאימים למולקולות ביולוגיות ספציפיות להתבונן תמונה של הרקמה בתדר שנבחר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמא, לחץ על להקת 1,650 -1 סנטימטר להתבונן ההפצה של חלבונים במדגם. לחלופין, לחץ על להקת 1,080 -1 סנטימטר להתבונן ההפצה של חומצות גרעין במדגם. השתמש wavenumber 1,650 -1 סנטימטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור תמונות נוספות על ידי חישוב יחס רפאים שיא גובה, יחסי שיא שטח וכו &#39;שיאפשר להדמיה של רכיבי biomolecular שונים. לחץ על &quot;כלים Spectral &#39;ולאחר מכן בחר&#39; יחסי גובה שיא&quot; או &quot;חישוב שטח תמונה &#39;כדי ליצור תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את סעיף הרקמות הסמוך המקביל שמוכתם באמצעות מערכת תרמי שקופיות שלמה נפרדת שלוכדת תמונות brightfield. לצד תמונת IR, להציג את התמונה הדיגיטלית של הרקמה הצבעונית עם תכנית תמונה גלויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ לחיצה ימנית על התמונה באזור של עניין ובחר פרופיל Z &quot;. זה ייתן לי המידע ספקטרלי בפיקסל נבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תסתכל על ספקטרום IR של פיקסלים מרובים מכיתות מרובות, כגון השוואה בין סוגי תאים, מצבי מחלה. פיקסלים מארק ספציפיים בתמונה באמצעות כלי &#39;האזורים של עניין &quot;(ROI). כדי לבצע את זה, לחץ לחיצה ימנית על התמונה ובחר &#39;כלי ROI &quot;. צור כיתות הלהיות מתויגות, למשל נורמלים, דיספלזיה, ושיעורי סרטן. לאחר מכן, בחר, &quot;סוג ROI &#39;-&#39; נקודה &#39;. לאחר מכן בחר את הכיתה כדי לבחור פיקסלים וללצייר על פיקסלים המתאימים בתמונת IR. לגזור את f הספקטרום הממוצעאו כל אחת מכיתות השימוש באפשרות &#39;ROI הממוצע &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקלו את הספקטרום נגזר על ידי התוויית בתוכנת גרפים. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

FT-IR הוא שיטה המתעוררות להדמיה ביוכימיים ללא תווית של קטעי רקמה, עם הפוטנציאל יש תפקיד חשוב בשיפור הרמה הנוכחית של אבחון בפתולוגיה. תקן הזהב הנוכחי לפתולוגיה דורש רקמות לביופסיה, קבוע בפורמלין, משובץ בפרפין, מחולק מספר פעמים, ומוכתמות בכתמים מרובים. פתולוג מאומן יש להעריך באופן סובייקטיבי חזותי מבנה הרקמות ומורפולוגיה תאית כדי לקבוע אבחנה. כאן אנו מראים כיצד לאסוף תמונות IR ברזולוציה גבוהה מאותו הסוג של חלקים ודנו בכמה מהגישות חישוביות לבחינת הבדלים כימיים בין סוגי תאים ומצבי מחלה. השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה הם על מנת להבטיח כי הרקמות מתמקדות מאוד בזהירות וכי המערכת מכוילת היטב כדי להבטיח נתונים ספקטרוסקופיות באיכות גבוהה מאוד. הטיפול בעת הגדרת המערכת במיוחד criti<html> cal בעת עבודה עם יעדי ההגדלה גבוהים. כדי לסייע בפתרון בעיות, ברשימה שלהלן מכסה חלק מהקשיים הפוטנציאליים נתקלו; בעיה: עוצמת IR נמוכה כאשר הדמיה בהשתקפות. פתרון: בדוק נטייה שקופיות IR כציפוי רעיוני עשוי להיות בצד הלא נכון של השקופית. בעיה: אות נמוכה / תמרור אזהרה אדומה בלנסר בקרה. פתרון: גלאים מגניבים עם LN2. חנקן נוזלי דרוש לגלאי FPA לתפקד ודורש מעת לעת שעקף את. שגיאות שגיאה / תנועת מהירות: בעיה. פתרון: איפוס ספקטרומטר ולצמצם את התנודות. תנודות יגרמו המראה נע בinterferometer שיפריעו. בעיה: קוצים אדי מים בנתונים. פתרון: להגדיל את הטיהור במערכת ולהגן על מדגם מאוויר. בעיה: centerburst לא חוקי. פתרון: מצא centerburst שוב. e_content &quot;&gt; בעיה:. הבדל שטף נמוך בשידור, למרות שהתמקד פתרון:. התאם הקבל תחתון זה יתרחש כאור IR לא להיות ממוקד לנקודה במדגם. במאמר זה, יש לנו התמקד בשאלה כיצד לרכוש בחדות גבוהה תמונות IR של רקמות באו שידור או מצב transflectance. הטבע של ההדמיה FT-IR, הם שיש שינויים רבים שניתן לעשות לרכישת נתונים, כגון, סוג של מצע, טכניקת קיבוע, עובי מדגם, רזולוציה רפאים, מהירות מראה interferometer וכו &#39;השפעתם של פרמטרים אלה יש נדון בפירוט רב לאחרונה 4,5,17,51. ישנם מספר של שינויים שניתן לעשות במערכת ההדמיה כולל הדמיה במצב 10,24,26 ATR ותוך שימוש בגישות תרמית בקנה מידה ננומטרי 52,53 כדי לאפשר הדמיה IR ברזולוציה גבוהה. המגבלה העיקרית עם ההדמיה IR ברזולוציה גבוהה היא שtiחייב להיות מוכן ssues בזהירות ורזה מספיק IR לעבור (בדרך כלל עובי 4 מיקרומטר). בנוסף, הולכה והחזרת ההדמיה FT-IR דורשת דגימות להיות יבש בשל הספיגה של IR על ידי מים. עם זאת, יש הדמיה FT-IR יתרונות משמעותיים על פני שיטות אחרות, בכך שהוא יכול שטחים גדולים מאוד במהירות תמונה של רקמות תוך ביסוס מידע ביוכימי עשיר ומפורט. טכניקות דומות אחרות הנובעות מידע ביוכימיים באופנה ללא תווית כוללות ספקטרוסקופיית ראמאן, אולם בעת רכישת נתונים היא הרבה יותר איטית לרכוש תמונות. גישות הדמיה החדשה ראמאן הם מתעוררים כוללים פיזור ראמאן המאולץ (SRS) ופיזור קוהרנטית Antistokes ראמאן (CARS); עם זאת, יש להם טווח ספקטרום מוגבל גישה או הדמיה תדר אחד. ההתקדמות במהירות של רכישת נתונים, ברזולוציה מרחבית, וזמינות של גישות חישוביות הייתה בעל ערך עצום בקבלת מתאר לעצמי FT-IR<html> ing גישה ריאלי יותר לתרגום ככלי הדמיה חדש בפתולוגיה. ההתקדמות שחלה באחרונה ברזולוציה מרחבית הייתה חשובה במיוחד לפתולוגיה רקמה בשל סוגי תאים עיקריים שאינו פתיר באמצעות מערכות הדמיה FT-IR קונבנציונליות. המאמר האחרון על ידי אל Reddy et. הראה כיצד מודל מערכת אידיאלית להשיג הרזולוציה מרחבית האופטימלית של מערכת הדמיה FT-IR 5. דוגמא רקמת הכליה שהוצגה במאמר זה מדגימה את החשיבות של החלטות מרחבית גבוהות יותר כדי לחלץ מידע ביוכימיים ממבני גלומרולריות (איור 3 ואיור 5). בעתיד, התקדמות חדשה במקורות אור IR כבהירים מאוד לייזרי אשד קוונטית 54-57, הדמיה 3D רפאים 58, ופריצות דרך בתחום טכנולוגיות ננו IR 52,53,59,60 להחזיק אפיקים חדשים מרגשים של מחקר שעשויה להיות לי השלכות עצומות בעתיד של הדמיה רקמות. התחת = &quot;jove_content&quot;&gt; יש לנו הצגנו דוגמאות ליישומים בכבד ובמחלת כליות שבו יש צורך במידע ביוכימיים נוסף שיכול להיות בעל ערך לאבחון. המעבדה לפתולוגיה Spectral במחלקה לפתולוגיה באוניברסיטת אילינוי בשיקגו מתמקדת בתרגום של טכנולוגיות ההדמיה IR לשיפור אבחון מחלה ושיפור חיזוי של תוצאת מטופל. ההדמיה FT-IR יכולה להתגבר על חלק מהמגבלות הנוכחיות בפועל פתולוגיה שבו מידע כמותי ואובייקטיבי נדרש. בפרט, עבודה בעתיד מתמקדת בזיהוי התחומים בפועל פתולוגיה הנוכחית שבו טכניקות הנוכחיות אינן מספקות רגישות אבחון נאותה או לספק מידע מוגבל. צורך ברור קיים בשיפור הפרקטיקה הנוכחית של פתולוגיה וכלפי נותן מידע נוסף לפתולוג על מצב המחלה של מטופל, שעשויה להיות בר השגה באמצעות ההדמיה FT-IR בחדות גבוהה.

ספקטרוסקופיה IR כבר כלי אנליטי זמין בצורה כלשהי מאז 1930; עם זאת, הוא היה רק ​​בתוך העשור האחרון כי השטח של הדמיה רקמות עם FT-IR התפוצץ. ההתקדמות בFT-IR עבור הדמיה רקמות היו מונעת בחלקו גדול על ידי שלוש התפתחויות מרכזיות: 1) מהירות מוגברת של רכישת נתונים בשל הזמינות של מערך מישור מיקוד גדול (FPA) גלאים אשר בדרך כלל יש אלפי גלאים רגישים IR 1 , 2 פיתוח, 2) של אלגוריתמים לעיבוד מתקדמים וכוח חישוב לטיפול בנתונים היפרספקטרלית גדולים קובע 3, ו 3) מודלים של מערכות ההדמיה FT-IR על מנת למקסם את הרזולוציה מרחבית 4,5. יש כבר רב באיכות גבוהה ומאמרים נרחבים מאוד סוקרים תחום ספקטרוסקופיה FT-IR לאחרונה 6-16, בנוסף לנייר טבע פרוטוקולים המפרט את האמצעים לקבלת ספקטרום נקודה או מפות מרקמות 17. במאמר זה, אנו נתמקד בprotocol כדי להשיג תמונות של רקמות באמצעות 128 x 128 גלאים FPA במערכת FT-IR שונה עם יכולות גבוהה הגדרה. ההדמיה FT-IR הוצע ארוכה כדי להיות כלי פוטנציאלי רצוי לתא ורקמת הדמיה בשל היכולת להשיג תמונות שבו כל פיקסל יש שפע של מידע ביוכימי. ההדמיה FT-IR מבוססת על העיקרון שמולקולות ביולוגיים שונות במדגם כמותית לספוג אזורים שונים של אמצע אינפרא אדום-; זה מאפשר לגזירה של &#39;טביעת אצבע ביוכימי &quot;. טביעת אצבע זה הוכחה במחקרים רבים לשנות בין סוגי תאים שונים ומצבי מחלה. שלא כמו בתרגול פתולוגיה הקונבנציונלי שבו כתמים וסמני immunohistochemical צריכים לשמש כדי לחזות ולזהות סוגי תאים ורקמות מבנים המשמשים כדי להנחות את אפשרויות אבחון וטיפול, התמונות מFT-IR נוצרות מבוססות על ביוכימיה הטבעית של הרקמה. Techniq הנוכחיue של רקמת צביעה לאבחון הוא זמן רב, הרסני, מייגע, ודורש מומחיות הסובייקטיבית של פתולוג, ואילו FT-IR מציע את הפוטנציאל להפוך את התהליך הזה מהיר, שאינו הרסני, מאוד אוטומטי, ואובייקטיבי יותר. בנוסף, FT-IR מציע מסלול חדשני לקבלת מידע ביוכימיים נוסף שעשויות לא להיות נגיש בקלות באמצעות טכניקות צביעה קונבנציונליות. אחד השיפורים המרגשים ביותר בשנים האחרונות היה הזמינות של גישות הדמיה ברזולוציה גבוהות שיכול כעת להרשות להדמיה והאפיון של סוגי תאים ורקמות מבנים שהם קריטיים לאבחון מחלה מקיף. אחת מן הטכניקות הללו הוא מוחלשות סה&quot;כ ההחזרה (ATR) FT-IR אשר משלב עדשה מוצקה טבילה (SIL) של מקדם שבירה גבוהה המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה 18, עם מחקרים רבים מראים מאוד מרגשים היישומים שלה 19-25. בנוסף, זה wכפי שהודגם לאחרונה כי הרזולוציה מרחבית המוגברת הדמיה ATR יכולה לאפשר להדמיה והסיווג של אנדותל ותאי myoepithelial ברקמת שד אשר מהווים מרכיב מרכזי באבחון סרטן השד 26. בעוד ההדמיה ATR היא מאוד שימושית, טכניקה זו דורשת SIL ליצור קשר עם הרקמה ליצירת תמונות FT-IR; לכן, השימוש בו מוגבל במידה מסוימת לפתולוגיה הרקמה שבו אזורים גדולים של רקמות חייבים להיות צילמו במהירות. גישה שנייה הודגמה על ידי צימוד אובייקטיבי ההגדלה גבוהה למערכת FT-IR קיים המשתמשת בסינכרוטרון כמקור בהיר של IR, אפשר להאיר באופן מלא FPA ותמונה עם גודל פיקסל אפקטיבי של 0.54 x 0.54 מיקרומטר. זה אפשר לנו לחזות מבנים מרכזיים ברקמות שד וערמונית שאינם פתירה באמצעות מערכות FT-IR קונבנציונליים 4. בעוד עליות הדרמטיות אלה בresolutio המרחבית תמונת IRn היה מרגשים, השימוש בו נותר מוגבל בשל צורך בסינכרוטרון. בהמשך לכך, מערכת אופטימלית תוכננה שיכול גם לאפשר ליכולות גבוהה הגדרת הדמיה עם גודל פיקסל של 1.1 x 1.1 מיקרומטר ללא הדרישה של מקור סינכרוטרון אלא באמצעות מקור IR globar מסורתי 5. במאמר זה, אנו מראים כיצד לשנות מערכת הקיימת מסחרית FT-IR הדמיה כדי לאפשר הדמיה IR המוגבל עקיפה של רקמות עם אות מקובלת על יחס רעש באמצעות יעדים מרובים IR (15X, 36x, ו74X). גודל פיקסל האפקטיבי עם שלוש המטרות הוא 5.5 x 5.5 מיקרומטר (15X), 2.2 x 2.2 מיקרומטר (36x) ו -1.1 x 1.1 מיקרומטר (74X). לאחר מכן, אנו נותנים כמה דוגמאות לחשיבות של הרווחים ברזולוציה מרחבית לגילוי מחלה בביופסיות של כבד וכליות 27.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1102">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Cary 600 Series FT-IR system</td>
			<td style="width:308px;">Agilent</td>
			<td style="width:192px;">Multiple configurations&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Alternate FT-IR imaging systems exist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Adjustable ReflX Objective 74X/0.65NA IR</td>
			<td style="width:308px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:192px;">66-592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adjustable ReflX Objective 36X/0.5NA IR</td>
			<td style="width:308px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:192px;">66-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">MirrIR slide</td>
			<td style="width:308px;">Kevley Technologies</td>
			<td style="width:192px;">CFR</td>
			<td>For FT-IR reflection-mode measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Barium Fluoride slides</td>
			<td style="width:308px;">International Crystal Laboratories</td>
			<td style="width:192px;">Multiple sizes</td>
			<td>For FT-IR transmission-mode measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Calcium Fluoride slides</td>
			<td style="width:308px;">International Crystal Laboratories</td>
			<td style="width:192px;">Multiple sizes</td>
			<td>For FT-IR transmission-mode measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Dry Nitrogen/Dry Air gas</td>
			<td style="width:308px;">Multiple gas suppliers</td>
			<td style="width:192px;">Multiple sizes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Hexane</td>
			<td style="width:308px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:192px;">Multiple sizes</td>
			<td>For deparafinizing tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:308px;">Multiple cryogenic liquid suppliers</td>
			<td style="width:192px;">Multiple sizes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">ENVI-IDL software</td>
			<td style="width:308px;">Exelis-Vis</td>
			<td style="width:192px;"></td>
			<td>Other software packages available</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:336px;">Whole slide Imager</td>
			<td style="width:308px;">Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu)</td>
			<td style="width:192px;"></td>
			<td>To image stained slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-definition fourier transform infrared (ft-ir) spectroscopic imaging of human tissue sections towards improving pathology

פורייה בהבחנה גבוהה להפוך אינפרא אדום (FT-IR) הדמיה ספקטרוסקופיות היא גישה המתעוררות כדי להשיג תמונות מפורטות שקשרו מידע ביוכימי. ההדמיה FT-IR של רקמה מבוססת על העיקרון כי אזורים שונים של אמצע אינפרא אדום נספגים על ידי קשרים כימיים שונים (לדוגמא, C = O, CH, NH) בתוך תאים או רקמות, כי אז יכול להיות קשורה לנוכחות והרכב של מולקולות ביולוגיות (למשל, שומנים, DNA, גליקוגן, חלבון, קולגן). בתמונת FT-IR, כל פיקסל בתמונה מורכב מספקטרום אינפרא אדום (IR) שלם שיכול לתת מידע על המצב ביוכימי של התאים כי אז יכול להיות מנוצלים לתא מסוג או סיווג מחלה מהסוג. במאמר זה, אנו מציגים: איך להשיג תמונות IR מרקמות אנושיות באמצעות מערכת FT-IR, כיצד לשנות מכשור הקיים, כדי לאפשר יכולות הדמיה בחדות גבוהה, ואיך לדמיין תמונות FT-IR. לאחר מכן, אנו מציגים כמה יישומים של FT-IRלפתולוגיה באמצעות הכבד וכליות כדוגמאות. ההדמיה FT-IR מחזיקה יישומים מרגשים במתן מסלול רומן כדי להשיג מידע ביוכימיים בתאים ורקמות במסלול הלא-perturbing לחלוטין ללא תווית כלפי נותן תובנה חדשה שינויי biomolecular כחלק מתהליכי המחלה. בנוסף, מידע ביוכימי זה עלול לאפשר לניתוח אובייקטיבי ואוטומטי של היבטים מסוימים של אבחון מחלה.

ההדמיה FT-IR מאפשרת הגזירה של תמונות IR של רקמה שיכול לתת לי ניגודים שונים בהתאם לתדר IR של עניין. בנוסף, בתמונת IR, כל פיקסל מורכב מכל קשת IR, עם פסגות שונות המתאימות למולקולות ביולוגיות שונות שיכול לתת מידע על התכונות הביוכימיות של סוגי תאים או מצבי מחלה (איור 1). הנה, יש לנו לראות איך להשוות חתימות רפאים בין מעמדות, סיווג אוטומטי זאת יותר מתקדם אפשרי באמצעות אלגוריתמים נוספים 3,43-50, כגון סיווג בייס, אקראי יערות, ברשתות עצביות מלאכותיות, והיררכי Cluster ניתוח יכול להתבצע על נתונים. גישות סיווג בפיקוח תאפשר לבניית מסווג שניתן לאמן כדי לאפשר להכרה אוטומטית של סוגי תאים או מצבי מחלה. גישות סיווג ללא השגחה יכולות לשמש כדי לחפש באופן טבעי DIFferences ברקמה או תאים עקב שונות ביוכימיים. מכשור FT-IR התפתח במהלך העשורים האחרונים, מהמדידה בנקודה / מצב מיפוי בודד באמצעות פתחים אטומים IR למצב הדמיה באמצעות יעדי Cassegrain, או באמצעות אובייקטיבי מאיר יחד עם מטרת איסוף בשידור-מצב או מטרה אחת כי הן נדלקת ואוסף בהשתקפות של מצב (איור 2). לאחרונה הודגם כי מטרת האיסוף במצב שידור יכולה להיות כיבתה להגדלה גבוהה יותר ואובייקטיבי צמצם מספרי כדי לאפשר הדמיה עקיפה מוגבלת IR, שמובילה לעלייה ניכר ברזולוציה מרחבית של תמונות IR שנאספו 4,5. ההתקדמות ברזולוציה מרחבית להדמית רקמות הייתה חשיבות קריטית כפי שאנו יכולים כעת לזהות סוגי תאים ומבני רקמות, למשל היחידות פונקציונליות של הכליות, glomeruli, באמצעות מותאמת בביתמערכות FT-IR (איור 3). ההדמיה FT-IR בחדות גבוהה מאפשרת לתמונות מפורטות של רקמות לבדיקה כדי לזהות אזורים חריגים ולזהות הבדלים ביוכימיים בין סוגי תאים שונים. בליבת רקמת כבד, אפשר לדמיין hepatocytes ואזורים של הסתננות סיסטיק שחלק שני תחומים נפרדים של דיספלזיה ושחמת כבד שאינו dysplastic (איור 4). אנחנו עובדים כדי לנצל את זה לקראת ביצוע כלי אבחון אוטומטי לשימוש במקרים קשים של מחלת כבד. חשוב לציין, ברזולוציה מרחבית המוגברת יכולה כעת מאפשרת לנו לבודד את התכונות מבניות ספציפיות שעשויים להיות שינוי כימי במחלה לפני שינויים היסטולוגית ניכרים. לדוגמא, אנו מתמקדים בזיהוי שינויים ביוכימיים במבני גלומרולרי הכליות כגון כמוסה של באומן, מזנגיום, קרום במרתף גלומרולרי וקרום במרתף צינורי, לפני<html> שינויים שזוהו על ידי פתולוג ניתן לצפות (איור 5). בפרט, אנו מעוניינים בזיהוי שינויים הקשורים להתקדמות נפרופתיה סוכרתית ודחייה כרונית בחולים שעבר השתלה, שבו טכניקות הנוכחיות אינן מצליחות לזהות שינויים באופנה מספיק מוקדם להתערבות מוצלחת. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig1.jpg" /> איור 1. תמונות FT-IR וקשת מליבה כבד. תמונה של (A) H &amp; E מוכתמת ליבה מביופסיה של כבד ותמונות של ספיגת IR סעיף סדרתי של אותה הליבה ב( B) 3286 -1 סנטימטר ו- (ג) 2,603 -1 סנטימטר, אשר הדגיש תכונות מבניות שונות. ספקטרום IR אופייני של רקמה (ד &#39;), עם פסגות חשובות שכותרת. בר סולם = 100 מיקרומטר.&quot;Target =&quot; fig1large.jpg _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig2.jpg" /> איור אופטיקה 2. מצבי פעולה סכמטית המפרטים מיקרוסקופ FT-IR. (א) במצב הולכה, המדגם מואר דרך האובייקטיבית התחתון, והאור עובר דרך הדגימה שנאסף על ידי המטרה העליונה. (ב) במצב השתקפות, המטרה העליונה משמשת גם כדי להאיר את המדגם ולאסוף את האור מוחזר. המטרה התחתונה היא לא בשימוש. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig3.jpg" /> איור 3. השוואה של בידוליעדי t מיקרוסקופ על תמונות FT-IR של glomerulus כליות ב2,925 -1 סנטימטר. מטרה () 15X איסוף עם NA = 0.5 (גודל 5.5 x 5.5 מיקרומטר פיקסל). אובייקטיבי (B) 36x איסוף עם NA = 0.5 (גודל 2.2 x 2.2 מיקרומטר פיקסל). (C) 74X איסוף אובייקטיבי עם NA = 0.65 (גודל 1.1 x 1.1 מיקרומטר פיקסל). בר סולם = 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig4.jpg" /> איור 4. הבדלים בין Spectral סיסטיק וhepatocytes בליבה כבד. (א) H &amp; E מוכתמת ליבה מביופסיה של כבד. (ב) תמונה של ליבה סידורי סעיף הסרוק בFT-IR (הגדרה אובייקטיבית 36x). (ג) נציגספקטרום resentative של hepatocytes וסיסטיק, שנלקח מהאזורים של רקמה מסומנת בחצים ב (א) ו- (ב). סרגל = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig5.jpg" /> בידול איור 5. תכונות ביופסית רקמת הכליה באמצעות ההדמיה FT-IR בחדות גבוהה. סעיף (א) תקופתי חומצה שיף מוכתם בתכונות להיעקר שכותרת. High-Definition תמונת FT-IR של 2 אזור CH סימטרי המתיחה (36x הגדרה אובייקטיבית) של סעיף סדרתי של אותה הרקמה (B). (C) תכונות שכותרתו ב() הופק באמצעות תמונת FT-IR ב( B) כדי להיות מסוגל כימי DIFferentiate ארבע התכונות של הרקמות. בר סולם = 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology at JoVE.com

High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.

פורייה בהבחנה גבוהה להפוך אינפרא אדום (FT-IR) Spectroscopic הדמיה של סעיפים רקמה אנושיים לשיפור פתולוגיה

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

high-definition-fourier-transform-infrared-ft-ir-spectroscopic

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Electrical Engineering

Medicine

Unit 1

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

z-Transform

SCIENTISTS IN ACTION

33.0K Views.  University of Illinois at Chicago. Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis. 

Video: High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Technique and Considerations in the Use of 4x1 Ring High-definition Transcranial Direct Current Stimulation (HD-tDCS)

High-definition transcranial direct current stimulation (HD-tDCS) has recently been developed as a noninvasive brain stimulation approach that increases the accuracy of current delivery to the brain by using arrays of smaller "high-definition" electrodes, instead of the larger pad-electrodes of conventional tDCS. Targeting is achieved by energizing electrodes placed in predetermined configurations. One of these is the 4x1-ring configuration. In this approach, a center ring electrode (anode or cathode) overlying the target cortical region is surrounded by four return electrodes, which help circumscribe the area of stimulation. Delivery of 4x1-ring HD-tDCS is capable of inducing significant neurophysiological and clinical effects in both healthy subjects and patients. Furthermore, its tolerability is supported by studies using intensities as high as 2.0 milliamperes for up to twenty minutes.
Even though 4x1 HD-tDCS is simple to perform, correct electrode positioning is important in order to accurately stimulate target cortical regions and exert its neuromodulatory effects. The use of electrodes and hardware that have specifically been tested for HD-tDCS is critical for safety and tolerability. Given that most published studies on 4x1 HD-tDCS have targeted the primary motor cortex (M1), particularly for pain-related outcomes, the purpose of this article is to systematically describe its use for M1 stimulation, as well as the considerations to be taken for safe and effective stimulation. However, the methods outlined here can be adapted for other HD-tDCS configurations and cortical targets.

Technique and Considerations in the Use of 4x1 Ring High-definition Transcranial Direct Current Stimulation HD-tDCS

High-definition transcranial direct current stimulation (HD-tDCS), with its 4x1-ring montage, is a noninvasive brain stimulation technique that combines both the neuromodulatory effects of conventional tDCS with increased focality. This article provides a systematic demonstration of the use of 4x1 HD-tDCS, and the considerations needed for safe and effective stimulation.

טכניקה ושיקולים בשימוש ב4x1 טבעת גירוי מקומי ישיר Transcranial בהבחנה גבוהה (HD-tDCS)

High-definition transcranial direct current stimulation (HD-tDCS) has recently been developed as a noninvasive brain stimulation approach that increases ...

Tissue-simulating Phantoms for Assessing Potential Near-infrared Fluorescence Imaging Applications in Breast Cancer Surgery

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery (BCS). Optical imaging, in particular near-infrared fluorescence (NIRF) imaging, might reduce the frequency of positive surgical margins following BCS by providing the surgeon with a tool for pre- and intraoperative tumor localization in real-time. In the current study, the potential of NIRF-guided BCS is evaluated using tissue-simulating breast phantoms for reasons of standardization and training purposes.
Breast phantoms with optical characteristics comparable to those of normal breast tissue were used to simulate breast conserving surgery. Tumor-simulating inclusions containing the fluorescent dye indocyanine green (ICG) were incorporated in the phantoms at predefined locations and imaged for pre- and intraoperative tumor localization, real-time NIRF-guided tumor resection, NIRF-guided evaluation on the extent of surgery, and postoperative assessment of surgical margins. A customized NIRF camera was used as a clinical prototype for imaging purposes.
Breast phantoms containing tumor-simulating inclusions offer a simple, inexpensive, and versatile tool to simulate and evaluate intraoperative tumor imaging. The gelatinous phantoms have elastic properties similar to human tissue and can be cut using conventional surgical instruments. Moreover, the phantoms contain hemoglobin and intralipid for mimicking absorption and scattering of photons, respectively, creating uniform optical properties similar to human breast tissue. The main drawback of NIRF imaging is the limited penetration depth of photons when propagating through tissue, which hinders (noninvasive) imaging of deep-seated tumors with epi-illumination strategies.

Near-infrared fluorescence (NIRF) imaging may improve therapeutic outcome of breast cancer surgery by enabling intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status. Using tissue-simulating breast phantoms containing fluorescent tumor-simulating inclusions, potential clinical applications of NIRF imaging in breast cancer patients can be assessed for standardization and training purposes.

רקמות המדמים מטוסי פנטום להערכת יישומי דימות פלואורסצנטי קרוב אינפרא אדום פוטנציאליים בכירורגיה סרטן השד

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery ...

Cerenkov Luminescence Imaging of Interscapular Brown Adipose Tissue

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely related to metabolism and energy expenditure, and its dysfunction is one important contributor for obesity and diabetes. Contrary to previous belief, recent PET/CT imaging studies indicated the BAT depots are still present in human adults. PET imaging clearly shows that BAT has considerably high uptake of 18F-FDG under certain conditions. In this video report, we demonstrate that Cerenkov luminescence imaging (CLI) with 18F-FDG can be used to optically image BAT in small animals. BAT activation is observed after intraperitoneal injection of norepinephrine (NE) and cold treatment, and depression of BAT is induced by long anesthesia. Using multiple-filter Cerenkov luminescence imaging, spectral unmixing and 3D imaging reconstruction are demonstrated. Our results suggest that CLI with 18F-FDG is a practical technique for imaging BAT in small animals, and this technique can be used as a cheap, fast, and alternative imaging tool for BAT research.

In this video report, we show the application of Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for interscapular brown adipose tissue in mice under activated and depressed conditions.

Cerenkov הארת ההדמיה של רקמות Interscapular בראון שומן

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

עבודה עם רקמות אנושיות לחקר סרטן Translational

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of stroke than relying on indirect measurements, and will be a potent and robust vascular research tool. We use an optical imaging approach that labels thrombi with a molecular imaging thrombus marker&#160;&#8212; a Cy5.5 near-infrared fluorescent (NIRF) probe that is covalently linked to the fibrin strands of the thrombus by the fibrin-crosslinking enzymatic action of activated coagulation factor XIIIa during the process of clot maturation. A micro-computed tomography (microCT)-based approach uses thrombus-seeking gold nanoparticles (AuNPs) functionalized to target the major component of the clot: fibrin. This paper describes a detailed protocol for the combined in vivo microCT and ex vivo NIRF imaging of thromboemboli in a mouse model of embolic stroke. We show that in vivo microCT and fibrin-targeted glycol-chitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) can be used for visualizing both in situ thrombi and cerebral embolic thrombi. We also describe the use of in vivo microCT-based direct thrombus imaging to serially monitor the therapeutic effects of tissue plasminogen activator-mediated thrombolysis. After the last imaging session, we demonstrate by ex vivo NIRF imaging the extent and the distribution of residual thromboemboli in the brain. Finally, we describe quantitative image analyses of microCT and NIRF imaging data. The combined technique of direct thrombus imaging allows two independent methods of thrombus visualization to be compared: the area of thrombus-related fluorescent signal on ex vivo NIRF imaging vs. the volume of hyperdense microCT thrombi in vivo.

This protocol describes the application of combined near-infrared fluorescent (NIRF) imaging and micro-computed tomography (microCT) for visualizing cerebral thromboemboli. This technique allows the quantification of thrombus burden and evolution. The NIRF imaging technique visualizes fluorescently labeled thrombus in excised brain, while the microCT technique visualizes thrombus inside living animals using gold-nanoparticles.

משולב האינפרה-אדום הקרוב הדמיה פלורסנט וטומוגרפיה-מחושב מיקרו ישירות חזותי מוחין Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS images are constructed from calibrated freehand 2D B-mode ultrasound images, which are positioned into a voxel array. Ultrasound (US) imaging allows quantification of muscle size, fascicle length, and angle of pennation. These morphological variables are important determinants of muscle force and length range of force exertion. The presented protocol describes an approach to determine volume and fascicle length of m.&#160;vastus lateralis and m.&#160;gastrocnemius medialis. 3DUS facilitates standardization using 3D anatomical references. This approach provides a fast and cost-effective approach for quantifying 3D morphology in skeletal muscles. In healthcare and sports, information on the morphometry of muscles is very valuable in diagnostics and/or follow-up evaluations after treatment or training.

3D ultrasound imaging (3DUS) allows fast and cost-effective morphometry of musculoskeletal tissues. We present a protocol to measure muscle volume and fascicle length using 3DUS.

אולטראסאונד תלת-ממד הדמיה: Morphometry מהירה וחסכונית של רקמת שריר-שלד

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Skeletal Muscle Neurovascular Coupling, Oxidative Capacity, and Microvascular Function with 'One Stop Shop' Near-infrared Spectroscopy

Exercise represents a major hemodynamic stress that demands a highly coordinated neurovascular response in order to match oxygen delivery to metabolic demand. Reactive hyperemia (in response to a brief period of tissue ischemia) is an independent predictor of cardiovascular events and provides important insight into vascular health and vasodilatory capacity. Skeletal muscle oxidative capacity is equally important in health and disease, as it determines the energy supply for myocellular processes. Here, we describe a simple, non-invasive approach using near-infrared spectroscopy to assess each of these major clinical endpoints (reactive hyperemia, neurovascular coupling, and muscle oxidative capacity) during a single clinic or laboratory visit. Unlike Doppler ultrasound, magnetic resonance images/spectroscopy, or invasive catheter-based flow measurements or muscle biopsies, our approach is less operator-dependent, low-cost, and completely non-invasive. Representative data from our lab taken together with summary data from previously published literature illustrate the utility of each of these end-points. Once this technique is mastered, application to clinical populations will provide important mechanistic insight into exercise intolerance and cardiovascular dysfunction.

Skeletal Muscle Neurovascular Coupling, Oxidative Capacity, and Microvascular Function with &#039;One Stop Shop&#039; Near-infrared Spectroscopy

Here, we describe a simple, non-invasive approach using near-infrared spectroscopy to assess reactive hyperemia, neurovascular coupling and skeletal muscle oxidative capacity in a single clinic or laboratory visit.

צימוד נוירו-וסקולריים שרירי השלד, קיבולת חמצוני, ופועלים Microvascular עם 'אחד עצור חנות' ספקטרוסקופיית אינפרא אדום

Exercise represents a major hemodynamic stress that demands a highly coordinated neurovascular response in order to match oxygen delivery to metabolic ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

אפיון של תאים חיסוניים בתוך רקמת שומן אנושי באמצעות Cytometry זרימה

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, the fundamental physical diffraction limit prevents interrogation of nanoscale anatomy and subtle pathological changes when using conventional optical imaging approaches. Here, we describe a simple and inexpensive protocol, called expansion pathology (ExPath), for nanoscale optical imaging of common types of clinical primary tissue specimens, including both fixed-frozen or formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue sections. This method circumvents the optical diffraction limit by chemically transforming the tissue samples into tissue-hydrogel hybrid and physically expanding them isotropically across multiple scales in pure water. Due to expansion, previously unresolvable molecules are separated and thus can be observed using a conventional optical microscope.

Nanoscale imaging of clinical tissue samples can improve understanding of disease pathogenesis. Expansion pathology (ExPath) is a version of expansion microscopy (ExM), modified for compatibility with standard clinical tissue samples, to explore the nanoscale configuration of biomolecules using conventional diffraction limited microscopes.

הדמיה nanoscopic של מקטעים רקמות האדם באמצעות הרחבה גופנית איזוטרופית

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...

DIPLOMA Approach for Standardized Pathology Assessment of Distal Pancreatectomy Specimens

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most lethal malignant cancers. A minority (20%) of PDACs are found in the pancreatic body and tail. Accurate pathology assessment of the pancreatic specimen is essential for providing prognostic information and it may guide further treatment strategies. The recent 8th edition of the American Joint Committee on Cancer/Union for International Cancer Control (AJCC/UICC) staging system for pancreatic tumors has incorporated significant changes to tumor (pT) stage, which is predominantly based on tumor size. This change emphasizes the importance of careful block selection. Owing to the greater prevalence of tumors in the head of the pancreas, efforts are made to standardize the assessment of pancreatoduodenectomy specimens. However, consensus regarding the macroscopic assessment of distal (i.e., left) pancreatectomy specimens is lacking. The DIPLOMA approach includes the standardized measurement of pancreas and other resected organs, inking of relevant surgical margins and anatomical surfaces without removing covering layers of fat, measurement of tumor size (for T-stage), together with assessment of splenic vessel involvement (and other organs if present). All relevant margins are assessed, and relevant blocks are selected to confirm these parameters microscopically. The current protocol describes a standardized approach to the macroscopic assessment of distal pancreatectomy specimens. This approach was developed during several meetings with pathologists and surgeons during the preparation phase for an international multicenter trial (DIPLOMA, ISRCTN44897265), which focuses on radicality of distal pancreatectomy for pancreatic ductal adenocarcinoma. This standardized approach can be instrumental in the design of studies and will uniform reporting on the outcomes of distal pancreatectomy. The described technique is used in the DIPLOMA trial for pancreatic ductal adenocarcinoma but may also be useful for other indications.

The current study highlights a standardized approach to the macroscopic assessment of distal pancreatectomy specimens for pancreatic ductal adenocarcinoma, with special emphasis on the measurement of pancreatic dimensions and those of other organs, inking of margins, measurement of tumor size and proximity to margins, lymph node sampling and block selection.

הגישה דיפלומה עבור הערכה מפתולוגיה סטנדרטית של מריתה דגימות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most lethal malignant cancers. A minority (20%) of PDACs are found in the pancreatic body and tail. ...