Name: the bioconjugation and radiosynthesis of 89zr-dfo-labeled antibodies
Uploaded: 2015-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies at JoVE.com

המחברים מודים פרופ &#39;תומס ריינר, ד&quot;ר יעקב Houghton, וסרג&#39; ד&quot;ר Lyaschenko לשיחות מועילות.

כל הניסויים בבעלי החיים in vivo תיארו בוצעו על פי פרוטוקול שאושר ולפי ההנחיות האתיות של Memorial Sloan Kettering Cancer Center המוסדי הטיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC). 1. הצמידה של DFO-NCS לJ591 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור microcentrifuge 1.7 מיליליטר, להכין פתרון 2-5 מ&quot;ג / מיליליטר של J591 ב 1 מיליליטר של או מלוח 1x פוספט שנאגרו (pH 7.4) או 0.5 חיץ M HEPES (pH 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר DFO-NCS בDMSO היבש בריכוז שבין 5-10 מ&quot;מ (3.8-7.6 מ&quot;ג / מיליליטר). Sonicate או מערבולת הפתרון ביסודיות על מנת להקל פירוק מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה- pH של תמיסת J591 ל8.8-9.0-ידי הוספת aliquots הקטן (&lt;10 μl) של 0.1 M Na 2 CO 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פתרון הנוגדן הוא בpH הנכון, להוסיף נפח של פתרון DFO-NCS המתאים לעודף טוחנת 3-4 פי של chelator bifunctional. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחינהple, להוסיף 4-5 μl של 10 מ&quot;מ פתרון DFO-NCS (40.4 nmol DFO-NCS) (7.6 מ&quot;ג / מיליליטר) עד 1 מיליליטר של 2 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון נוגדני J591 (13.3 nmol J591). הסכום של DMSO בתערובת התגובה המימית הסופית לא יעלה על 2% v / v. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התגובה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בבלוק חימום התססה ב 350 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעת 1 ב 37 ° C, לטהר את immunoconjugate וכתוצאה מכך באמצעות טור desalting הדרת גודל חד פעמי ארוז מראש עם חתוך 50,000 משקל מולקולרי באמצעות 0.5 חיץ M HEPES (pH 7.4) כeluent. צעד זה יניב פתרון 2 מיליליטר של מבנה J591-DFO הושלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הריכוז של J591-DFO לבנות על ספקטרופוטומטר UV-Vis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ריכוז גבוה יותר של המבנה הוא רצוי, לרכז את פתרון J591-DFO באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי עם חתוך 50,000 משקל מולקולרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הפתרון של immunoconjugate J591-DFO הושלם ב -20 ° C בחושך. </ol> 2. Radiolabeling J591-DFO עם 89 Zr זהירות: בשלב זה של הפרוטוקול כרוך הטיפול ומניפולציה של רדיואקטיביות. לפני ביצוע השלבים הבאים או ביצוע כל עבודה אחרת עם חוקרי רדיואקטיביות צריכה להתייעץ עם מוסד ביתם קרינת מחלקת בטיחות. יש לנקוט את כל הצעדים האפשריים כדי לצמצם את החשיפה לקרינה מייננת. הערה: בריבית של שטר שמירת radiochemical הנכונה, את כמות הרדיואקטיביות במדגם יש למדוד באמצעות כיל מינון ונרשמה לפני ואחרי שלבי 2.2-2.13 בפרוטוקול בהמשך. זה יעזור לך עם הקביעה מדויקת של תשואות radiochemical ופעילויות ספציפיות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של .5-2.0 מ&quot;ג של J591-DFO ב200 μl של 0.5 חיץ M HEPES, pH 7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה נפח של &lt;sup&gt; 89 פתרון Zr 4+ מניות (מסופק בדרך כלל ב1.0 M חומצה אוקסלית) מתאים 1.0-6.0 MCI (37-222 MBq) לתוך צינור microcentrifuge 2 מיליליטר פלסטיק בורג יתר. כוון את עוצמת הקול של פתרון זה בסך 300 μl באמצעות חומצה אוקסלית 1.0 M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה- pH של תמיסת 89 Zr 4+ ל6.8-7.5 באמצעות 1.0 M Na 2 CO 3. בגין על ידי הוספת 250 μl של 1.0 M Na 2 CO 3 לZr 89 4+ פתרון ולאחר מכן להוסיף קטן (&lt;10 μl) aliquots של בסיס כדי להשיג את ה- pH הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את הכמות הרצויה של פתרון מותאם pH 89 Zr 4+ לפתרון J591-DFO מוכן בשלב 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את ה- pH של תערובת תגובת radiolabeling כדי לוודא שהוא נופל בטווח הרצוי של 6.8-7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תגובת radiolabeling במשך 60 דקות ב RT על בלוק חימום התססה ב 350 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 60 דקות של דגירה, למדוד את radiolabeling תשואה של התגובה באמצעות רדיו-TLC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשם כך, במקום 1 μCi של תערובת תגובת radiolabeling על רצועת TLC-ספוג סיליקה. לאפשר aliquot לייבוש, להפעיל את TLC באמצעות eluent של 50 מ&quot;מ DTPA (pH 5.5) ולנתח את רצועת TLC באמצעות סורק הרדיו-TLC. 89 Zr 4+ חייב לבנות J591-DFO יופיע במוצא (R f &lt;0.1), ואילו קטיונים חופשיים 89 Zr 4+ יהיו chelated ידי DTPA וelute עם חזית הממס (ו R&gt; 0.9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את תשואת radiolabeling של התגובה על ידי שילוב radiochromatogram, חלוקת השטח מתחת לעקומה מR f 0.0-.1 על ידי השטח הכולל מתחת לעקומה, והכפלה ב -100. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תשואת radiolabeling מספיקה (בדרך כלל פעילות ספציפית תיאורטית של&gt; 2 MCI / מ&quot;ג), להרוות את התגובה עם 5 μl של 50 מ&quot;מ DTPA, pH 5.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את USI immunoconjugate וכתוצאה מכךng טור מראש ארז גודל חד פעמי desalting הדרה עם חתוך 50,000 משקל מולקולרי באמצעות eluent של 0.9% או תמיסת מלח סטרילית עם 5 מ&quot;ג / מיליליטר חומצת gentisic או 0.25 M נתרן אצטט (pH 5.5) עם 5 מ&quot;ג / מיליליטר חומצת gentisic . צעד זה יניב פתרון 2 מיליליטר של radioimmunoconjugate 89 ZR-DFO-J591 הושלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר טיהור, לאמת את טוהר radiochemical של 89 ZR-DFO-J591 באמצעות רדיו-TLC כפי שמתואר בשלב 2.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את תשואת radiolabeling הכוללת של התגובה על ידי חלוקת הסך של פעילות בתחילה להוסיף את פתרון הנוגדן על ידי כמות הרדיואקטיביות מבודדת עם radioimmunoconjugate 89 ZR-DFO-J591 המטוהר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הפעילות הספציפית הסופית על ידי חלוקת הסך של פעילות מבודדת עם radioimmunoconjugate ZR-DFO-J591 המטוהר 89 על ידי המסה הראשונית של DFO-J591 בתגובת radiolabeling. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ריכוז גבוה יותר הוא רצוי, להתרכז הדואר 89 פתרון ZR-DFO-J591 באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי עם חתוך 50,000 משקל מולקולרי. הערה: חומצת gentisic משמשת בשלב הטיהור הסופי היא רדיו-מגנה מועסק כדי למזער את ההשפלה של הנוגדן בשל radiolysis 46 בעוד האחסון של radioimmunoconjugate ZR-DFO-J591 89 עד 48 שעות על 4 מעלות צלזיוס. אפשר, זה לא מומלץ. אם radioimmunoconjugate הוא להיות מאוחסן, השתמש 0.25 M נתרן אצטט (pH 5.5) עם 5 מ&quot;ג / מיליליטר חומצת gentisic כמאגר אחסון על מנת למזער את הסיכון לradiolysis תיווך היפוכלוריט. 47 </li></ol> 3. בVivo PET הדמיה עם 89 ZR-DFO-J591 זהירות: כמו בסעיף 2 לפרוטוקול, צעד זה של הפרוטוקול כרוך טיפול ומניפולציה של רדיואקטיביות. לפני ביצוע השלבים הבאים חוקרים צריכים להתייעץ עם מוסד ביתם קרינת מחלקת בטיחות. כל possibיש לנקוט צעדי le כדי לצמצם את החשיפה לקרינה מייננת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעכברי זכרי athymic בעירום, שתל תת עורי 5 x 10 תאי סרטן ערמונית LNCaP 6 ולאפשר לגדול אלה לxenograft 100-150 מ&quot;מ 3 (3-4 שבועות לאחר חיסון). 44 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את radioimmunoconjugate 89 ZR-DFO-J591 לריכוז של 1.0 מיליליטר / MCI בשיעור של 0.9% תמיסת מלח סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 200 μl של פתרון 89 ZR-DFO-J591 (200 μCi; 7.4 MBq). לוריד הזנב לרוחב של עכברי נושאי xenograft 48 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודת זמן ההדמיה הרצויה (למשל, 12, 24, 48, 72, 96, או 120 שעות שלאחר הזרקה), להרדים את העכבר עם 2% isoflurane: תערובת גז חמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על המיטה של ​​סורק PET בעלי החיים הקטן, ולשמור על הרדמה במהלך הסריקה באמצעות isoflurane 1%: תערובת גז חמצן. לפני הצבת בעלי החיים על מיטת הסורק, ודא הרדמה בשיטת הבוהן הקמצוץ וApplהמשחה y העיניים לעיניים של העכבר כדי למנוע התייבשות במהלך הרדמה. 49 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש נתונים PET לעכבר באמצעות סריקת סטטי עם מינימום של 40 מיליון אירועים חופפים באמצעות חלון אנרגיה של 350-700 קאב וחלון תזמון מקרי של 6 NSEC. 50 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלים הרכישה של התמונה, לא עוזב את העכבר ללא השגחה ולא למקם אותו בכלוב עם עכברים אחרים עד שהוא חזר להכרה. </li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

בעוד בניית radioimmunoconjugates, הנקרא-ZR-DFO radiolabeling, וההדמיה של 89 הוא בדרך כלל הליך ולא פשוט, זה חשוב לשמור על כמה שיקולים מרכזיים במוח במהלך כל שלב של התהליך. לדוגמא, אולי הסיבה הסבירה ביותר לדאגה במהלך שלב נטיה של ההליך היא הצבירה של הנוגדן בתגובה הצמידה. בעיה זו היא לרוב ?...

בשל רגישותם הראויה לציון, זיקה, וסלקטיביות, נוגדנים כבר מזמן נחשבים וקטורים מבטיחים עבור המשלוח של רדיואיזוטופים לתאים סרטניים. עם זאת, היישום שלהם בטומוגרפיה פליטת פוזיטרונים הדמיה (PET) כבר הקשו על ידי חוסר רדיו-איזוטופי פולטות פוזיטרונים מתאים לתיוג שלהם. 1-3 אחד השיקולים החשובים ביותר בעיצוב של radioimmunoconjugates הוא התאמת הריקבון הפיזי חצי חיים של הרדיו-איזוטופי לin vivo הפרמקוקינטיקה של הנוגדן. באופן ספציפי יותר, לעתים קרובות יש נוגדנים זמן מחצית חיים ביולוגיים ארוכים יחסית, רב היום, ולכן הוא חייב להיות מסומן עם רדיואיזוטופים עם זמן מחצית חיים פיזיים דומים. עבור יישומי הדמיה PET, נוגדנים היו radiolabeled באופן מסורתי עם 64 Cu (t 1/2 = 12.7 שעות), 86 Y (t 1/2 = 14.7 שעות), או 124 אני (t 1/2 = 4.18 ד). 4, 5 עם זאת, כל אחד מרדיואיזוטופים אלה בעל מגבלות משמעותיות שתפגענה בהתאמתם להדמיה קלינית. בעוד radioimmunoconjugates שכותרתו עם 86 Y ו- 64 Cu הוכיח מבטיח בחקירות פרה-קליניים, שני איזוטופים בעלי זמן מחצית חיים פיזיים כי הם קצרים מכדי להיות יעילים עבור הדמיה בבני אדם. 124 אני, לעומת זאת, יש לו זמן מחצית חיים פיזיים כמעט אידיאליים ל הדמיה עם נוגדנים, אבל זה יקר ויש לו מאפייני ריקבון הכי מוצלחים שיובילו לרזולוציה נמוכה יחסית תמונות קליניות. יתר על כן, 124 radioimmunoconjugates שכותרתו אני יכול להיות כפוף לdehalogenation in vivo, תהליך שיכול להוריד את יחסי פעילות גידול לרקע. 6,7 הכונן למצוא רדיו-איזוטופי פולטות פוזיטרונים להחליף 64 Cu, 86 Y, ואני 124 בradioimmunoconjugates הזין את העליות האחרונות במחקר על 89 נוגדני Zr כותרת. 8-12 Tהוא הסיבה להופעתו של 89 Zr היא פשוטה: radiometal בעל כימי כמעט אידיאליים ותכונות פיזיות לשימוש בradioimmunoconjugates PET אבחון 13 89 Zr מופק באמצעות 89 Y (p, n) 89 תגובת Zr על מאיץ חלקיקים באמצעות. זמין מסחרי ויעד Y 89 100% טבעיים בשפע. 14,15 radiometal יש תשואת פוזיטרונים של 23%, דועך עם זמן מחצית חיים של 78.4 שעות, ופולט פוזיטרונים עם האנרגיה נמוכה יחסית של 395.5 keV (איור 1). 13,16,17 זה חשוב לציין כי 89 Zr גם פולט אנרגיה גבוהה, 909 keV γ-ray עם יעילות של 99%. בעוד פליטה זה לא מפריעה במרץ עם 511 פוטונים הנפלטים keV, זה דורש שיקול נוסף בכל קשור לתחבורה, טיפול, וdosimetry. למרות אזהרה זו, מאפיינים אלה ריקבון סופו של דבר אומר שיש 89 Zr h נוח יותר לא רקalf-חיים להדמיה עם נוגדנים מ -86 Y ו- 64 Cu, אלא גם יכול לייצר תמונות ברזולוציה גבוהות יותר מאשר 124 אני, אשר פולט פוזיטרונים עם אנרגיות גבוהות של 687 ו 975 keV כמו גם מספר הפוטונים עם אנרגיות בתוך 100-150 keV של הפוטונים שנוצרו פוזיטרונים 511 קאב. 13 יתר על כן, 89 Zr הוא גם בטוח יותר לטפל, פחות יקר לייצר, וresidualizes בגידולים באופן יעיל יותר מאשר עמיתו יוד רדיואקטיבי. 18,19 אחת הגבלת פוטנציאל של 89 Zr היא שזה לא שיש לי איזוטופולוג טיפולי, למשל, 86 Y (PET) לעומת 90 Y (טיפול). זה מונע את בנייתם ​​של סוכנים זהים מבחינה כימית, פונדקאיות הדמיה שיכולה להיות מועסק כגששים מדי מינון לעמיתים הטיפוליים שלהם. שאמרו, החקירות מצביעות על כך שיש לי פוטנציאלי כממלאי מקום להדמיה 90 א- ו -177 immunoconjugates כותרת Lu 89 נוגדנים Zr שכותרתו.20,21 מבחינה כימית, כמו מתכת הקבוצה IV, 89 Zr קיים כקטיון +4 בתמיסה מימית. יון 4+ Zr טעון מאוד, (רדיוס אפקטיבי יוני = 0.84 א) גדול יחסית, ויכול להיות מסווג כקטיון &quot;קשה&quot;. ככזה, הוא מציג העדפת ligands נושאות עד שמונה תורמי חמצן קשים, אניוני. בקלות chelator הנפוץ ביותר בשימוש בradioimmunoconjugates 89 שכותרתו Zr הוא desferrioxamine (DFO),, chelator אציקליים-נגזר siderophore נושאת שלוש קבוצות hydroxamate. יגנד ביציבות מרכז את קטיון Zr 4+ במהירות ובצורה נקיה ב RT ברמות pH רלוונטיים מבחינה ביולוגית, ומורכב ZR-DFO וכתוצאה מכך נותר יציב במהלך מספר ימים במלח, בסרום דם, וכל דם. 22 מחקרים חישובית ממליצים שDFO טפסים מורכב hexacoordinate עם Zr 4+ בי מרכז המתכת מתואם לneut שלושRAL ושלושה תורמי anionic חמצן של יגנד, כמו גם שתי מולקולות מים אקסוגניים (איור 2). 23,24 ההתנהגות של radioimmunoconjugates העסקת פיגום נטיית 89 ZR-DFO in vivo באופן כללי היה מצוין. עם זאת, במקרים מסוימים, הדמיה ומחקרי biodistribution חריפים חשפו רמות גבוהות פעילות בעצמות של עכברים שהוזרקו עם 89 נוגדני Zr שכותרתו, נתונים שמצביעים על כך שosteophilic 89 Zr 4+ קטיון הוא שוחרר מchelator in vivo ולאחר מכן mineralizes בעצמות. 25 לאחרונה, מספר החקירות לתוך הפיתוח של רומן 89 chelators Zr 4+ במיוחד ligands עם שמונה תורמי חמצן הופיעו בספרות. 24,26,27 עם זאת, כיום, DFO הוא chelator המועסק באופן נרחב ביותר ב -89 ZR-כותרת radioimmunoconjugates בהפרש גדול. מגוון שונהאסטרטגיות bioconjugation להיות מועסקים לצרף DFO לנוגדנים, כוללים כימיה bioorthogonal לחץ, התגובה של DFO תיאול-reactive בונה עם cysteines בנוגדן, והתגובה של מופעל DFO נושאי אסתר בונה עם lysines בנוגדן. 4,28- 30 בקלות את האסטרטגיה הנפוצה ביותר, עם זאת, היו השימוש בנגזרי isothiocyanate נושאות של DFO, DFO-NCS (איור 2). 22 chelator bifunctional זמין מסחרי חסונה זה ובאמינות יוצרת קשרים עם lysines של יציבים, thiourea קוולנטיים נוגדן (איור 3). במהלך השנים האחרונות, במגוון רחב של 89 radioimmunoconjugates כותרת ZR-DFO דווח בספרות. חקירות פרה-קליניים היו שופעות במיוחד, הכוללות נוגדנים הנעים בין ידוע יותר cetuximab, bevacizumab, וtrastuzumab לנוגדנים אזוטריים יותר כמו T מיקוד CD105RC105 וfPSA מיקוד 5A10. 30-36 לאחרונה, מספר קטן של ניסויים קליניים בשלבים המוקדמים באמצעות 89 נוגדנים שכותרתו ZR-DFO צמחו בספרות. ניסויים באופן ספציפי, קבוצות בהולנד פרסמו העסקת 89 U36 ZR-DFO-cmAb, 89 tiuxetan ZR-DFO-ibritumomab, ו -89 ZR-DFO-trastuzumab. 21,32,37 בנוסף, מגוון רחב של ניסויים קליניים אחרים עם 89 radioimmunoconjugates כותרת ZR כרגע בעיצומו, ובכלל זה חקירות כאן בMemorial Sloan Kettering Cancer Center באמצעות 89 ZR-DFO-J591 PSMA מיקוד הדמיה סרטן הערמונית וZR-89 DFO-trastuzumab מיקוד HER2 הדמיה סרטן השד. 23, 30 בנוסף, בעוד נוגדני radiolabeled יישארו 89 הרדיואקטיביות Zr כותרת הנפוצה ביותר, radiometal גם יותר ויותר הועסק עם וקטורים אחרים, כוללים פפטידים, חלבונים, וננו. 38-43 </sup&gt; המודולריות של המתודולוגיה תיוג ZR-DFO זה 89 היא נכס אדיר. הרפרטואר של נוגדני מיקוד סמן ביולוגי הוא המתרחב, והעניין בביצוע בתחום ההדמיה PET vivo באמצעות המבנים הללו צומח במהירות. כתוצאה מכך, אנו מאמינים כי הפיתוח של יותר שיטות ופרוטוקולים סטנדרטיים יכול להועיל השדה. פרוטוקול ניסוי נכתב מצוין לנטיית DFO-NCS וradiolabeling 89 Zr כבר פורסם על ידי Vosjan, et al. 22 אנו חשים כי ההפגנה החזותית הניתנת על ידי עבודה זו יכולה לעזור לחוקרים חדשים לטכניקות אלה. בפרוטוקול ביד, J591 נוגדן אנטיגן קרום המיקוד ספציפי לערמונית ישמש כמערכת מודל להמחשה (1) bioconjugation של chelator bifunctional DFO-isothiocyanate לנוגדן, (2) radiosynthesis והטיהור של 89 radioimmunoconjugate ZR-DFO-מב,ו- (3) in vivo ההדמיה PET עם radioimmunoconjugate ZR-DFO-מב 89 במודל עכברי של הסרטן. 23,44,45

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-SCN-Bn-DFO</td><td>Macrocyclics</td><td>B-705</td><td>Store at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;89&lt;/sup&gt;Zr]Zr-oxalate</td><td>Various, including Perkin-Elmer</td><td></td><td>Caution: Radioactive material</td></tr><tr><td>PD-10 Desalting Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01&amp;nbsp;</td><td>Store at room temperature</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC805024</td><td>Store at room temperature</td></tr><tr><td>Silica Gel Impregnated RadioTLC Paper</td><td>Agilent Technologies</td><td>SGI0001</td><td>Cut into strips 0.5 cm wide</td></tr></tbody></table>

the bioconjugation and radiosynthesis of 89zr-dfo-labeled antibodies

הזיקה, סגוליות, והסלקטיביות יוצאות דופן של נוגדנים להפוך אותם וקטורים בצורה יוצאת דופן אטרקטיביים לרדיואקטיביות PET-ממוקד של גידול. בשל זמן מחצית החיים הביולוגיים רב-היום שלהם, נוגדנים חייבים להיות מסומנים עם radionuclides פולטות פוזיטרונים עם זמן מחצית חי ריקבון פיזי ארוכים יחסית. באופן מסורתי, איזוטופים פולטות פוזיטרונים 124 אני (t 1/2 = 4.18 ד), 86 Y (t 1/2 = 14.7 שעות), ו- 64 Cu (t 1/2 = 12.7 שעות) שימשו לתייג נוגדנים ל ההדמיה PET. לאחרונה, עם זאת, השדה יש עדים עלייה דרמטית בשימוש בradiometal 89 Zr פולטות פוזיטרונים בסוכני הדמיה PET מבוסס נוגדן. 89 Zr הוא רדיו-איזוטופי כמעט אידיאלי להדמית PET עם immunoconjugates, כפי שהיא בעל מחצית פיזית -life (t 1/2 = 78.4 שעות), כי הוא תואם את הפרמקוקינטיקה in vivo של נוגדנים ופולט ENE נמוכה יחסיתפוזיטרונים rgy שמייצר תמונות ברזולוציה גבוהות. יתר על כן, נוגדנים יכולים להיות מתויגים בצורה ישירה עם 89 Zr באמצעות desferrioxamine-נגזר siderophore chelator (DFO). בפרוטוקול זה, J591 נוגדן אנטיגן קרום המיקוד ספציפי לערמונית ישמש כמערכת מודל להמחשה (1) bioconjugation של chelator bifunctional DFO-isothiocyanate לנוגדן, (2) radiosynthesis והטיהור של 89 Zr- radioimmunoconjugate DFO-מב, ו (3) in vivo הדמיה PET עם radioimmunoconjugate ZR-DFO-מב 89 במודל עכברי של הסרטן.

הצעד הראשון בפרוטוקול זה נטיה של DFO-NCS לנוגדן הוא בדרך כלל די חזק ואמין. באופן כללי, ניתן לקבל immunoconjugate המטוהר,-שונה chelator בתשואה&gt; 90%, ובאמצעות 3 שווה טוחנת של DFO-NCS בתגובת נטיה הראשונית תניב דרגה של תיוג של chelator של כ 1.0-1.5 DFO / מב. 89 Zr צעדי radiolabeling וטיהור של ההליך הם גם פש...

Watch this Scientific Journal Video about The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies at JoVE.com

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

Bioconjugation וRadiosynthesis של<sup&gt; 89</sup&gt; נוגדנים שכותרתו ZR-DFO

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

the-bioconjugation-and-radiosynthesis-of-89zr-dfo-labeled-antibodies

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Chemistry

Unit 1

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Fundamentals of Chemistry

SCIENTISTS IN ACTION

17.1K Views.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described. 

Video: The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 &plusmn; 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (&gt;99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

A detailed procedure for the synthesis of a 125I-labeled azide and the radiolabeling of dibenzocyclooctyne (DBCO)-group-conjugated, 13-nm-sized gold nanoparticles using a copper-free click reaction is described.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור Radiolabeling היעיל של חלקיקי זהב על ידי שימוש<sup&gt; 125</sup&gt; שכותרתו לי אזיד תותבת קבוצה

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

הכנה והערכה של<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc שכותרתו Tridentate chelates לחינוך קדם-מיקוד שימוש Bioorthogonal לכימיה

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...

Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a 64Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with 64Cu or 89Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a 64Cu-labeled radioligand.

רתימת ביקוש Bioorthogonal הפוך אלקטרונים דילס-Alder cycloaddition לPretargeted PET הדמיה

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for ...

Bioengineering

Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction

While radioimmunotherapy (RIT) is a promising approach for the treatment of cancer, the long pharmacokinetic half-life of radiolabeled antibodies can result in high radiation doses to healthy tissues. Perhaps not surprisingly, several different strategies have been developed to circumvent this troubling limitation. One of the most promising of these approaches is pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). PRIT is predicated on decoupling the radionuclide from the immunoglobulin, injecting them separately, and then allowing them to combine in vivo at the target tissue. This approach harnesses the exceptional tumor-targeting properties of antibodies while skirting their pharmacokinetic drawbacks, thereby lowering radiation doses to non-target tissues and facilitating the use of radionuclides with half-lives that are considered too short for use in traditional radioimmunoconjugates. Over the last five years, our laboratory and others have developed an approach to in vivo pretargeting based on the inverse electron-demand Diels-Alder (IEDDA) reaction between trans-cyclooctene (TCO) and tetrazine (Tz). This strategy has been successfully applied to pretargeted positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) imaging with a variety of antibody-antigen systems. In a pair of recent publications, we have demonstrated the efficacy of IEDDA-based PRIT in murine models of pancreatic ductal adenocarcinoma and colorectal carcinoma. In this protocol, we describe protocols for PRIT using a 177Lu-DOTA-labeled tetrazine radioligand ([177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz) and a TCO-modified variant of the colorectal cancer targeting huA33 antibody (huA33-TCO). More specifically, we will describe the construction of huA33-TCO, the synthesis and radiolabeling of [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz, and the performance of in vivo biodistribution and longitudinal therapy studies in murine models of colorectal carcinoma.

This protocol describes the synthesis and characterization of a trans-cyclooctene (TCO)-modified antibody and a 177Lu-labeled tetrazine (Tz) radioligand for pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). In addition, it details the use of these two constructs for in vivo biodistribution and longitudinal therapy studies in a murine model of colorectal cancer.

Radioimmunotherapy pretargeted התגובה תגובת דילס-אלדר דרישה אלקטרון הופכי

While radioimmunotherapy (RIT) is a promising approach for the treatment of cancer, the long pharmacokinetic half-life of radiolabeled antibodies can ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

סינתזה, Bioconjugation של תיול-תגובתי ריאגנטים עבור הקמת האתר באופן סלקטיבי שונה Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Positron Emission Tomography Imaging of Cell Trafficking: A Method of Cell Radiolabeling

Stem cell and chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies are emerging as promising therapeutics for organ regeneration and as immunotherapy for various cancers. Despite significant progress having been made in these areas, there is still more to be learned to better understand the pharmacokinetics and pharmacodynamics of the administered therapeutic cells in the living system. For noninvasive, in vivo tracking of cells with positron emission tomography (PET), a novel [89Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN)-mediated cell radiolabeling method has been developed utilizing 89Zr (t1/2 78.4 h). The present protocol describes a [89Zr]Zr-DBN-mediated, ready-to-use, radiolabeling synthon for direct radiolabeling of variety of cells, including mesenchymal stem cells, lineage-guided cardiopoietic stem cells, liver regenerating hepatocytes, white blood cells, melanoma cells, and dendritic cells. The developed methodology enables noninvasive PET imaging of cell trafficking for up to 7 days post-administration without affecting the nature or the function of the radiolabeled cells. Additionally, this protocol describes a stepwise method for the radiosynthesis of [89Zr]Zr-DBN, biocompatible formulation of [89Zr]Zr-DBN, preparation of cells for radiolabeling, and finally the radiolabeling of cells with [89Zr]Zr-DBN, including all the intricate details needed for the successful radiolabeling of cells.

Presented here is a protocol to radiolabel cells with a positron emission tomography (PET) radioisotope, 89Zr (t1/2 78.4 h), using a ready-to-use radiolabeling synthon, [89Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN). Radiolabeling cells with [89Zr]Zr-DBN allows noninvasive tracking and imaging of administered radiolabeled cells in the body with PET for up to 7 days post-administration.

טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים הדמיה של סחר בתאים: שיטה של תיוג רדיו תאים

Stem cell and chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies are emerging as promising therapeutics for organ regeneration and as immunotherapy for ...

Cancer Research

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used in cancer treatment and imaging due to increased cellular accumulation over current ACs. During early AC in vitro development, fluorescence techniques and radioimmunoassays are sufficient for determining intracellular localization, accumulation efficiency, and target cell specificity. Currently, there is no consensus on standardized methods for preparing cells for evaluating AC intracellular accumulation and localization. The initial testing of ACs modified with virus-derived peptides is critical especially if several candidates have been constructed. Determining intracellular accumulation by fluorescence can be affected by background signal from ACs at the cell surface and complicate the interpretation of accumulation. For radioimmunoassays, typically treated cells are fractionated and the radioactivity in different cell compartments measured. However, cell lysis varies from cell to cell and often nuclear and cytoplasmic compartments are not adequately isolated. This can produce misleading data on payload delivery properties. The intravenous injection of radiolabeled virus-derived peptide-modified ACs in tumor bearing mice followed by radionuclide imaging is a powerful method for determining tumor targeting and payload delivery properties at the in vivo phase of development. However, this is a relatively recent advancement and few groups have evaluated virus-derived peptide-modified ACs in this manner. We describe the processing of treated cells to more accurately evaluate virus-derived peptide-modified AC accumulation when using confocal microscopy and radioimmunoassays. Specifically, a method for trypsinizing cells to remove cell surface bound ACs. We also provide a method for improving cellular fractionation. Lastly, this protocol provides an in vivo method using positron emission tomography (PET) for evaluating initial tumor targeting properties in tumor-bearing mice. We use the radioisotope 64Cu (t1/2 = 12.7 h) as an example payload in this protocol.

Viral-derived peptides coupled to antibody-conjugates (ACs) is an approach gaining momentum due to the potential of delivering molecular payloads with increased tumor cell accumulation. Utilizing common methods to evaluate peptide conjugation, AC and payload intracellular accumulation, and tumor targeting, this protocol helps researchers during the key initial development phases.

ההערכה הראשונית של נוגדן-conjugates שונה עם פפטידים ויראלי-derived הגדלת לצבירה התאית ושיפור הגידול מיקוד

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte cell culture and 64Cu-antibody receptor targeting of the cells. In vitro evaluation of the radiolabel and non-invasive in vivo cell tracking in an animal model of an airway delayed-type hypersensitivity reaction (DTHR) by PET/CT are described.
In detail, the conjugation of a mAb with the chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) is shown. Following the production of radioactive 64Cu, radiolabeling of the DOTA-conjugated mAb is described. Next, the expansion of chicken ovalbumin (cOVA)-specific CD4+ interferon (IFN)-&#947;-producing T helper cells (cOVA-TH1) and the subsequent radiolabeling of the cOVA-TH1 cells are depicted. Various in vitro techniques are presented to evaluate the effects of 64Cu-radiolabeling on the cells, such as the determination of cell viability by trypan blue exclusion, the staining for apoptosis with Annexin V for flow cytometry, and the assessment of functionality by IFN-&#947; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, the determination of the radioactive uptake into the cells and the labeling stability are described in detail. This protocol further describes how to perform cell tracking studies in an animal model for an airway DTHR and, therefore, the induction of cOVA-induced acute airway DHTR in BALB/c mice is included. Finally, a robust PET/CT workflow including image acquisition, reconstruction, and analysis is presented.
The 64Cu-antibody receptor targeting approach with subsequent receptor internalization provides high specificity and stability, reduced cellular toxicity, and low efflux rates compared to common PET-tracers for cell labeling, e.g.64Cu-pyruvaldehyde bis(N4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Finally, our approach enables non-invasive in vivo cell tracking by PET/CT with an optimal signal-to-background ratio for 48 h. This experimental approach can be transferred to different animal models and cell types with membrane-bound receptors that are internalized.

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Following the preparation of a 64Cu-modified monoclonal antibody binding to a transgenic murine T cell receptor, T cells are radiolabeled in vivo, analyzed for viability, functionality, labeling stability and apoptosis, and adoptively transferred into mice with an airway delayed-type hypersensitivity reaction for non-invasive imaging by positron emission tomography/computed tomography (PET/CT).

Murine לימפוציטים תיוג ידי<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-נוגדן קולטן מיקוד עבור<em&gt; In vivo</em&gt; סחר Cell על ידי PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Immunology and Infection

Determining Binding Affinity (KD) of Radiolabeled Antibodies to Immobilized Antigens

Determining binding affinity (KD) is an important aspect of the characterization of radiolabeled antibodies (rAb). Typically, binding affinity is represented by the equilibrium dissociation constant, KD, and can be calculated as the concentration of antibody at which half the antibody binding sites are occupied at equilibrium. This method can be generalized to any radiolabeled antibody or other protein and peptide scaffolds. In contrast to cell-based methods, the choice of immobilized antigens is particularly useful for validating binding affinities after long-term storage of antibodies, distinguishing binding affinities of fragment antigen-binding region (Fab) arms in bispecific antibody constructs, and determining if there is variability in antigen expression between different cell lines. This method involves immobilizing a fixed amount of antigen to specified wells on a breakable 96-well plate. Then, nonspecific binding was blocked in all wells with bovine serum albumin (BSA). Subsequently, the rAb was added in a concentration gradient to all wells. A range of concentrations was chosen to allow the rAb to reach saturation, i.e., a concentration of antibody at which all antigens are continuously bound by the rAb. In designated wells without immobilized antigen, nonspecific binding of the rAb can be determined. By subtracting nonspecific binding from total binding in the wells with immobilized antigen, specific binding of the rAb to the antigen can be determined. The KD of the rAb was calculated from the resulting saturation binding curve. As an example, binding affinity was determined using radiolabeled amivantamab, a bispecific antibody for epidermal growth factor receptor (EGFR) and cytoplasmic mesenchymal-epithelial transition (cMET) proteins.

Determining Binding Affinity KD of Radiolabeled Antibodies to Immobilized Antigens

Here, a method is described to determine the binding affinity (KD) of radiolabeled antibodies to immobilized antigens. KD is the equilibrium dissociation constant that can be determined from a saturation binding experiment by measuring the total, specific, and nonspecific binding of a radiolabeled antibody at various concentrations to its antigen.

קביעת זיקה מחייבת (KD) של נוגדנים בעלי תווית רדיו לאנטיגנים משותקים

Determining binding affinity (KD) is an important aspect of the characterization of radiolabeled antibodies (rAb). Typically, binding affinity is ...

Medicine

Pretargeted Radioimmunotherapy: A Method for Targeted Delivery of Therapeutic Radionuclides to Tumors

Source: Membreno, R., et al. <a href="https://www.jove.com/v/59041"> Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the technique of pretargeted radioimmunotherapy or PRIT, in which immunoconjugates followed by radioligands are administered for treating tumors. This radioimmunotherapy reduces radiation doses to healthy tissues and utilizes radionuclides with very low half-lives incompatible with antibody-based vectors.

רדיואימונותרפיה ממוקדת מראש: שיטה להעברה ממוקדת של רדיונוקלידים טיפוליים לגידולים

Source: Membreno, R., et al.  Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction. J. Vis. Exp. (2019).
This video ...

Bioconjugation וRadiosynthesis של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

פרוטוקול אופטימיזציה עבור Radiolabeling היעיל של חלקיקי זהב על ידי שימוש

הכנה והערכה של