We thank Matt Raymond for editorial assistance. This work was supported by funds from the National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221, and P51 RR000167) and The Charlotte Geyer Foundation.

1. הכנות וירוס וצירופי גורם שעתוק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות עם פלסמיד ביטוי lentiviral pSIN-EF1α מכיל DNA המקודדים חלבונים לETV2, GATA1, GATA2, TAL1 וLMO2 (טבלת 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הריכוז וטוהר הכנות פלסמיד המשמשות לייצור lentiviral על ידי הקלטת קליטת UV עם ספקטרופוטומטר ב 230 ננומטר, 260 ננומטר, ו -280 ננומטר. הערה: הכנות DNA A260 / 280 וA260 / 230 ערכי הוכחה גדולים יותר מאשר 1.8 נחשבים בדרך כלל באיכות טובה. A260 / 280 ערכים נמוכים עלולים להצביע על זיהום חלבון, בעוד A260 / 230 ערכים נמוכים מצביעים על זיהומים עם מלחים או כמה כגון פנול הממס. ריכוז פלסמיד מומלץ הוא 1-3 מיקרוגרם / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצר lentiviruses לtransductions כפי שתואר בפרוטוקולים שפורסמו בעבר 11. אינדוקציה שלו עם פוטנציאל פאן-מיאלואידית דורשת שיתוף ביטוי של ETV2 וGATA1, או ETV2 וGATA2.אינדוקציה שלו עם פוטנציאל erythro- וmegakaryocytic דורשת GATA2 וTAL1. התוספת של LMO2 משפרת באופן משמעותי את התשואה של תאי erythro-megakaryocytic מhPSCs בנוכחות GATA2 וTAL1 10. </li></ol> 2. hPSCs תרבות פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאי גזע pluripotent במושבות הדוקות עם קצוות חדים לconfluency 70-80% לפני subculturing. מארק ולהסיר הבדיל מושבות באופן ספונטני לפני passaging תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל ג&#39;ל המסחרי תאי מטריצה ​​(ראה טבלה 2) על פי הוראות היצרן וצלחות מעיל 6-גם הלילה ב 4 ° C, או לפחות שעה אחת על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. לפני passaging תאים, לשאוב את המטריצה, להוסיף 2 מיליליטר של culturemedium המלא המסחרי הטרי (ראה טבלה 2) ולשמור על צלחות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד התאים מוכנים לזריעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hPSCs מעבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ASPIRAבינוני te מטוב אחד ומחוברות של 6-גם צלחת עם hPSCs ולהוסיף 1.5 מיליליטר של תמיסת Dispase השני מראש חימם (2 מ&quot;ג / מיליליטר בDMEM / F12, מעוקר על ידי סינון דרך 0.22 מיקרומטר מסננים). דגירה 5-7 דקות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד הקצוות של מושבות להתחיל להרים מהמשטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון לשאוב Dispase השני ובזהירות לשטוף את המושבות פעמיים על ידי הוספה ולאחר מכן aspirating 2 מיליליטר של מדיום DMEM / F12 הטרי. לאחר מכן, באמצעות פיפטה זכוכית סרולוגיות 5 מיליליטר, לנתק hPSCs עם 3 מיליליטר של מדיום תרבות השלמה מסחרי טרי (ראה טבלה 2) על ידי pipetting השעיה תא למעלה ולמטה מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר של השעיה תא היטב בכל צלחת 6-היטב המכילה 1.5 מיליליטר של מדיום תרבות השלמה המסחרי (ראה טבלה 2). להתסיס את צלחת קדימה ואחורה וזכות מספר פעמים שמאלי כדי להבטיח חלוקת תא אחידה כאשר למקם את הצלחת לתוך החממה. שמור את התאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ל18-24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי היום הבינוני הבאה למדיום תרבות השלמה מסחרי טרי (ראה טבלה 2) ולבחון את מורפולוגיה hPSCs. תוצאות passaging מוצלחות במושבות קטנות, מצורפים היטב שמירת מורפולוגיה hPSC. hPSCs חייב להיות מוזן עם 2.5-3 מיליליטר freshmedium לכל גם על בסיס יומי וpassaged כל 4-5 ימים בלא יותר ממפגש 70-80%. הערה: אם hiPSCs נשמרו על fibroblasts העכבר העוברי (MEFs), הם צריכים להיות מועברים לתנאים ללא מזין וpassaged 2-3 פעמים לפני שהתמרה כדי להבטיח בידול יעיל. </li></ol></li></ol> 3. אינדוקציה של Hematoendothelial Pprecursors מhPSCs (יום 0, התמרה של hPSCs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום תגובה לשלב 1.3 מיליליטר של מדיום סרום ללא שלם מסחרי (ראה טבלה 2), וירוס, polybrene, ומעכב Y27632 ROCK (טבלת 1): להוסיף 1.3 μl של מעכבי ROCK 10 מ&quot;מ 1.3 מיליליטר בינוני עד Concentra סופיtion של 10 מיקרומטר, וpolybrene למיקרוגרם / מיליליטר ריכוז 6 סופי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כמות מתאימה של תרכיז נגיפי (ים) בריכוז סופי של 0.5-1.0 משרד הפנים (ריבוי של זיהום) של כל וירוס לכל תא. שמור בינוני תגובה על קרח או על 4 מעלות צלזיוס עד ההשעיה התא הבודד מוכנה. הערה: אותו הסכום של משרד הפנים לכל וירוס בGATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1, ותערובות GATA2 / TAL1 / תגובת LMO2 הוא אופטימלית לאינדוקציה של בידול. תרבויות עם זאת, בETV2 / GATA2 transduced הכפלת משרד הפנים לGATA2, ביחס לETV2, משפרת בידול. לכן, לתרבויות אלה, יחס 1: 2 למשרד פנים של ETV2 ומשרד הפנים של 1 GATA2 מומלץ (למשל, אם להתרכז ויראלי מוערך בכ 6.8 x 10 7 מיליליטר / חלקיקים, להוסיף 10 μl של ETV2 ו -20 μl של תרכיזים נגיפיים GATA2 ל 0.68 x 10 6 תאים לכל תגובת ETV2 / GATA2 אחד בבאר 35 מ&quot;מ של צלחת 6-היטב). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן hPSCs בתליוני תא בודדיםension. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול hPSCs בתנאים ללא מזין כפי שתואר בסעיף 2. ביום 4 בעקבות המעבר האחרון, להתבונן צפיפות תאים ומורפולוגיה תחת מיקרוסקופ הפוכה. hPSCs צריך לגדול במושבות הדוקות עם קצוות חדים ללא התמיינות ספונטנית ולהגיע ~ confluency 60-70% ביום של התמרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני לשאוב, להוסיף 1.5-2 מיליליטר של מגיב תא דיסוציאציה המסחרי (טבלה 1) לכל היטב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 5-7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים לכמויות שווה של מדיום שלם מסחרי (ראה טבלה 2) עם 10 מיקרומטר של מעכבי ROCK, לספור את התאים ולקבוע את הכדאיות. תאים גלולה על ידי צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות ולאחר מכן resuspend תאים בינוניים שלם מסחרי עם 10 מיקרומטר של מעכבי ROCK לריכוז של 3.4-5 x 10 6 תאים לכל מיליליטר. הערה: כדאיות תא היא קריטיות עבור התמרה ויראלי מוצלחת ובידול שלאחר מכן.בדרך כלל, כדאיות תא לפני התמרה יעלה על 90%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של ההשעיה התא, המכיל תאי .68-1 x10 6, ל1.3 מיליליטר של מדיום התגובה שהוכן ב3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון המטריצה ​​מצלחת 6-היטב מצופה הלילה הערוך 2.2., להעביר את תערובת התגובה לטובה אחד של צלחת 6-היטב ולהפיץ תאים באופן שווה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות לפחות 80% מהתאים צריכים להיות מחוברים למטריצה. </li></ol> 4. אינדוקציה של Hematoendothelial מבשרי מhPSCs (יום 1-7) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר התמרה-, להסיר בינוני המכיל וירוס ולשטוף תאים מצורפים עם מדיום תרבות תא שלם מסחרי (ראה טבלה 1) ולאחר מכן להוסיף 3 מ&quot;ל לכל טוב של מדיום תרבות תא שלם מסחרי המכילים ציטוקינים hematopoietic: SCF 100 ng / ml, TPO 50 מיליליטר ng /, bFGF 20 ng / ml (להלן כ3F-בינוני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף בינוני מוחלט עם 3F-בינוני טרי בימים 2, 3 ויום 4 להסרת תאים מתים ופסולת. לאחר יום 4, כאשר תאי hematopoietic צפים הם מתעוררים, להחליף מחצית מ3F-הבינוני בכל יום אחר, תוך השמירה על הנפח הכולל ב 4 מיליליטר. הערה: פלסמידים ביטוי lentiviral pSIN-EF1α לשלב גן התנגדות puromycin ובכך לאפשר לסלקציה חיובית של תאי transduced. 1 מיקרוגרם / מיליליטר של puromycin ניתן להוסיף עד בינוני במהלך 1-2 הימים הראשונים של בידול לחסל את כל hPSCs מובחן שייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב מורפולוגיה תא ביום 4 תחת מיקרוסקופ הפוכה: אשכולות צפופים של תאים עם מורפולוגיה האנדותל טיפוסית מתחילים להופיע (2A דמויות, 3A). תאי דם עגולים מופיעים מיום 5 ליום 7 של בידול, ואילו באזורים מסוימים עשויים לשמור מורפולוגיה hPSCs. לנתח הוא ובידול hematopoietic כמתואר להלן. הערה: שונה hematoendothelial מוצלחiation תוצאות בייצור של תאי דם המופיעים תאים עגולים refractile כפי שצורף לתאי האנדותל שטוחים בסיס רופף. תאים אלה באופן פעיל להתרבות יוצרים אגרגטים קטנים, וסופו של דבר לנתק ולצוף (2A דמויות ו3A). תאי דם בשידור חי יכולים להיות מכובדים מבחינה ויזואלית מהתאים המתים וגוססים מבוססים על היכולת שלהם כדי לשקף את האור ולהרחיב בתנאי תרבות. </li></ol> 5. ניתוח של שלב האנדותל (HE) Hemogenic של בידול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי היווצרות HE בין ימים 3 ו -4 של בידול על ידי תצפית מיקרוסקופית של תאים עם מורפולוגיה האנדותל. אין תאי דם צפים בתרבות, בשלב זה של בידול. נוכחות שהוא יכול להיות מאושר על ידי צביעת immunofluorescent וזרימת ניתוח cytometric באמצעות נוגדני VE-cadherin, CD73, CD226 וCD43. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך היווצרותו על ידי תאי שימוש ניתוח התזרים cytometric ביום 3ויום 4 מניסוי אחד. איסוף תאים על ידי דוגרים של תרבויות עם מגיב תא דיסוציאציה מסחרי (ראה טבלה 1) למשך 5-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולאחר מכן להשתמש עד 1 x 10 5 תאים לכל תגובה מכתימה (cytometry זרימת ההליך מכתים המתוארים ב 12). הערה: VE-cadherin + HE תאים לרכוש ביטוי של CD226 סמן hematopoietic מוקדם, אבל חוסר הביטוי של CD73 וCD43 6. לעומת זאת, תאים שאינם HE להביע (2B דמויות, 3B) CD73. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים immunofluorescence כי הוא נגזר hPSC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את monolayer המצורף של תאים עם מי מלח פוספט (PBS) ולאחר מכן לתקן תאים בparaformaldehyde 4% 30-60 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את תאים שוב עם PBS ולאחר מכן Permeabilize באמצעות 0.1% Triton X-100 ב PBS במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בPBS שני שלוש פעמים ולאחר מכן דגירה בחסימת מאגר בהיקף של PBS עם 10% בסרום שור עוברי (FBS), למשך 30 עד 120 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מכתים, המכיל את שני נוגדנים ראשוניים (1: 1,000 דילול) CD43 אנטי אנושי בעכבר וארנב אנטי אנושי VE-cadherin בPBS עם FBS 5%, (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את מאגר החסימה מהתאים ולהוסיף 1 מיליליטר לכל טוב של חיץ מכתים עם הנוגדנים העיקריים הוסיפו; דגירה 3 שעות בטמפרטורת חדר, או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים שלוש פעמים על ידי הוספת 2 מיליליטר של PBS עם 5% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ מכתים שני, המכיל נוגדנים משני בשעת 1: 500 דילול ב PBS עם 5% FBS: חמור נגד ארנב מצומדות עם צבע ירוק ניאון, ואנטי עכבר מצומדות עם צבע אדום ניאון (טבלת 1). הוסף 1 מיליליטר לכל טוב של חיץ מכתים המשני ודגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם PBS ללא סרום. תאי כתם עם 300 ננומטר DAPI עובד פתרון ב DH2 O במשך 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS פעמיים ולהוסיף 2-3 מיליליטר של PBS לתוך היטב עם תאים מוכתמים. שים לב הקרינה עם מסנני מיקרוסקופ ירוקים, אדום וכחול. </li></ol></li></ol> 6. ניתוח של מבשרי Hematopoietic המושרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על תרבויות בידול עד תאים צפים להרחיב באופן משמעותי, עד 10-14 ימים, שינוי מחצית 3F-הבינוני, כפי שתוארו בסעיף 3.1, בכל יומיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק ולאסוף ההבחנה monolayers של תאים על ידי טיפול בתאים עם מגיב תא דיסוציאציה המסחרית (ראה טבלה 1) למשך 5-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע cytometry זרימה באמצעות אנטי VE-cadherin-, נוגדני CD43 וCD45 להעריך hematopoiesis בתרבויות 12. שים לב שחלק גדול של תאים, עד 40% מתאי ETV2 וGATA2 transduced, שיתוף מבטא VE-CAD וCD43. הנוגדנים הבאים יכולים לשמש כדי לזהות שושלות תאים ספציפיות הבאים דוארxpansion או בידול של אבות דם מושרה: CD235a (תאי erythroid), CD41a (megakaryocytic), CD32 (כל סוגי תאי מיאלואידית), CD66b (נויטרופילים) וCD163 (מקרופאגים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע CFC-assay באמצעות מדיום מסחרי clonogenic (טבלת 1) על פי הוראות היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 1-2 x 10 4 תאים לתוך 3 מיליליטר של מדיום clonogenic המסחרי (ראה טבלה 3) כדי להעריך את מספר תאי מושבה יוצרים וסוגים של מושבות hematopoietic. צפיפות זריעה אופטימלית מאפשרת זיהוי והבידוד של מושבות אחת שגדלות בנפרד זה מזה ואינו חופף. צפיפות זריעה עשויה להשתנות בין ניסויים בהתאם ליעילות בידול, אבל לא תעלה על 1 x 10 4 תאים לכל 1 מיליליטר של מדיום clonogenic המסחרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים תאים בינוניים clonogenic המסחרי על ידי vortexing העדין, ולהעביר 3 מיליליטר של השעיה לשני מנות של 35 מ&quot;מ מצורף נמוכות במיוחדעבור assay CFC, 1.5 מיליליטר של השעיה לכל מנה. להפיץ בינוני באופן שווה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 14 יום. להימנע מלהפריע המנות; להתבונן הקמת מושבה ביום 7 ויום 10 של assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות ולספור מושבות hematopoietic לפי המורפולוגיות ביום 14. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Zape, J. P., Zovein, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemogenic+endothelium:+origins,+regulation,+and+implications+for+vascular+biology.">Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology.</a> Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).</li><li>Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short+history+of+hemogenic+endothelium.">A short history of hemogenic endothelium.</a> Blood Cells, Mol &amp; Dis. 51, 206-212 (2013).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures.">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2, 1722-1735 (2012).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+and+hematopoietic+cell+fate+of+human+embryonic+stem+cells+originates+from+primitive+endothelium+with+hemangioblastic+properties.">Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties.</a> Immunity. 21, 31-41 (2004).</li><li>Rafii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ESC-derived+hemogenic+endothelial+cells+undergo+distinct+waves+of+endothelial+to+hematopoietic+transition.">Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition.</a> Blood. 121 (5), 770-780 (2012).</li><li>Choi, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+hemogenic+endothelial+progenitor+and+its+direct+precursor+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures.">Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2, 553-567 (2012).</li><li>Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukosialin+(CD43)+defines+hematopoietic+progenitors+in+human+embryonic+stem+cell+differentiation+cultures.">Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures.</a> Blood. 108, 2095-2105 (2006).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+inhibition+enhances+the+generation+of+hematopoietic+progenitors+from+human+ES+cell-derived+hemogenic+endothelial+cells+using+a+stepwise+strategy.">TGFbeta inhibition enhances the generation of hematopoietic progenitors from human ES cell-derived hemogenic endothelial cells using a stepwise strategy.</a> Cell Res. 22, 194-207 (2012).</li><li>Uenishi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenascin+C+promotes+hematoendothelial+development+and+T+lymphoid+commitment+from+human+pluripotent+stem+cells+in+chemically+defined+conditions.">Tenascin C promotes hematoendothelial development and T lymphoid commitment from human pluripotent stem cells in chemically defined conditions.</a> Stem Cell Rep. 3, 1073-1084 (2014).</li><li>Elcheva, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+induction+of+haematoendothelial+programs+in+human+pluripotent+stem+cells+by+transcriptional+regulators.">Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators.</a> Nat Commun. 5, 4372 (2014).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).</li><li>Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoendothelial+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 23, Unit 23.6 (2007).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gene-transfer+efficiency+in+human+embryonic+stem+cells.">Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells.</a> Mol Imgn and Biol. 12, 15-24 (2010).</li></ol>

IS היא בעל מניות מייסדים ויועץ לCynata.

השיטה מתוארת לעיל לבידול hematopoietic של hPSCs ידי ביטוי יתר של TFS, מייצגת גישה מהירה ויעילה לייצור הוא ואבות מיאלואידית וerytho-magakaryocytic מhESCs וiPSCs, ובכך לאפשר את ייצור תאי דם עד 30 מיליון מ תאי גזע pluripotent מיליון 10. שיטה זו הציגה בידול עקבי בקווי hESC וiPSCs מרובים 10. במהלך ביד...

היכולת הייחודית של תאי גזע pluripotent האנושיים (hPSCs) לעצמית לחדש ולהתמיין לתאים של שלוש השכבות נבט, כוללים דם, לגרום להם כלי רב ערך עבור המחקרים מכניסטית של פיתוח hematopoietic, מודלים של מחלות דם, הקרנת סמים, מחקרים רעילים, והפיתוח של טיפולים סלולריים. בגלל היווצרות דם בתמורת העובר מהאנדותל hemogenic (HE) דרך מעבר hematopoietic אנדותל 1,2, הדור של HE בתרבויות תהיה חיוני כדי ללמוד את המנגנונים המולקולריים המסדירים את המעבר לאנדותל hematopoietic ומפרט hematopoietic. שיטות נוכחי ללימודים של HE מבוססות על האינדוקציה של בידול hematoendothelial באגרגטים (EBS) עם התוספת של ציטוקינים hematopoietic 3-5, וcoculture של hPSCs עם תאי סטרומה hematopoiesis-תומך 6,7 או בתרבויות דו ממדים עם תאי מטריצות וגytokines 8,9. שיטות הבחנה הקלאסיות אלה מבוססות על ההיכרות של אותות חיצוניים הפועלים על פני השטח של התאים וייזום מפלי מסלולים מולקולריים שסופו של דבר יובילו להפעלה של תכנית תעתיק המנחה פיתוח hematoendothelial. לפיכך, את היעילות של בידול hPSCs במערכות אלה מסתמך על אינדוקציה יעילה של אותות אלה, הולכים אותות לגרעין, והפעלה של רגולטורי תעתיק ספציפיים וכתוצאה מכך. בנוסף, המחקר של HE בתרבויות בידול קונבנציונליים דורש צעד נוסף של בידוד HE תאים באמצעות מיון תא. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט לזירוז הישיר שלו ודם על ידי ביטוי יתר של גורמי שעתוק hematopoietic. שיטה זו מאפשרת לאינדוקציה היעילה של HE בצלחת ותצפית ישירה של האנדותל למעבר hematopoietic ללא הצורך בבידוד של HE באמצעות הליך מיון תא מסורבל. היווצרות הוא והדם מתאי גזע pluripotent אנושיים יכולים להיגרם ביעילות על ידי overexpressing רק כמה גורמי שעתוק (TFS). שילוב האופטימלי של TFS מסוגל גרימת hematopoiesis פאן-מיאלואידית החזקה מhPSCs כולל וGATA1 או GATA2 ETV2. לעומת זאת, שילוב של GATA2 וTAL1 גורם erythromegakaryocytopoiesis 10. תכנות hPSCs דרך ביטוי יתר של גורמים אלה מבדיל hPSCs ישירות לVE-CAD + CD43 - CD73 - הוא תאים שירכשו את הפנוטיפ hematopoietic שהוגדר על ידי הביטוי של CD43 סמן hematopoietic מוקדם 7 בהדרגה. שיטה זו מבוססת על lentiviral לתכנות הישיר של שיטת תאי גזע pluripotent האנושית היא ישימה עבור הדור שלו ותאי דם למחקרים מכניסטית, מחקרים של האנדותל למעבר דם, ורגולצית תעתיק של פיתוח ומפרט hematopoietic. למרות גפרוטוקול urrent מתאר ייצור דם באמצעות ביטוי מכונן של transgenes, ניתן להשיג תוצאות דומות באמצעות mRNA שונה 10.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot; fo:keep-together.within-page=&quot;1&quot; fo:keep-with-previous.within-page=&quot;always&quot;&gt;&lt;strong&gt;Table 1.&lt;/strong&gt; &lt;strong&gt;Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61061</td><td>Lentiviral Vector</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61063</td><td>Lentiviral Vector</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61062</td><td>Lentiviral Vector</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61062</td><td>Lentiviral Vector</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61064</td><td>Lentiviral Vector</td></tr><tr><td>Hexadimethrine bromide (Polybrene)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td>Cationic polymer used to increase the efficiency of infection</td></tr><tr><td>Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td>RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html&quot;&gt;Life Technologies&lt;/a&gt;</td><td>A11105-01</td><td>Cell Dissociation Reagent</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incomplete (growth factor- free) culture medium&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; mTeSR1 Custom formulation&amp;nbsp;</td><td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td><td>MCF</td><td>&lt;a name=&quot;RANGE!D12&quot;&gt;Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>human SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td>Premium grade</td></tr><tr><td>human TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>Research grade</td></tr><tr><td>human FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Premium grade</td></tr><tr><td>CD144 (VE-cad) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>560411</td><td>Endothelial marker (FACS)</td></tr><tr><td>CD226 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>338305</td><td>Hematopoietic (FACS)</td></tr><tr><td>CD43 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>560199</td><td>Hematopoietic (FACS)</td></tr><tr><td>CD73 APC</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB5795A</td><td>Endothelial marker (FACS)</td></tr><tr><td>CD45 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555485</td><td>Hematopoietic (FACS)</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Life Technologies</td><td>A1310</td><td>Live/Dead assay (FACS)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Cell fixation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML&amp;nbsp;</td><td>Permeabilization&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003</td><td>Fetal bovine serum</td></tr><tr><td>Mouse anti-human CD43</td><td>BD Biosciences</td><td>551457</td><td>Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining</td></tr><tr><td>Rabbit anti-human VE-cadherin</td><td>BenderMedSystem</td><td>BMS158</td><td>Primary (IF)</td></tr><tr><td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated</td><td>JacksonResearch</td><td>715-486-152</td><td>Secondary (IF)</td></tr><tr><td>Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated</td><td>JacksonResearch</td><td>715-516-150&amp;nbsp;</td><td>Secondary (IF)</td></tr><tr><td>DAPI nucleic acid stain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html&quot;&gt;Life Technologies&lt;/a&gt;</td><td>D1306&amp;nbsp;</td><td>Live/Dead assay (IF)</td></tr><tr><td>Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>4435</td><td>CFC-assay</td></tr><tr><td>Wright Stain solution</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>32857</td><td>Staining cytospins</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot; fo:keep-together.within-page=&quot;1&quot; fo:keep-with-previous.within-page=&quot;always&quot;&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot; fo:keep-together.within-page=&quot;1&quot; fo:keep-with-previous.within-page=&quot;always&quot;&gt;&lt;strong&gt;Table 2.&lt;/strong&gt; &lt;strong&gt;hPSCs culture.&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)&amp;nbsp;</td><td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td><td>hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells</td><td>hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers</td></tr><tr><td>Complete serum-free medium for culture of hPSCs&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; mTeSR1 media&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td><td>M500&amp;nbsp;</td><td>Serum-free&amp;nbsp; medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences/ Corning&amp;nbsp;</td><td>356234</td><td>Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, powder&amp;nbsp;</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html&quot;&gt;Life Technologies&lt;/a&gt;</td><td>12500-062</td><td>Basal Medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco&#039;s PBS powder</td><td>Fisher Scientific</td><td>dSH30013.04</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Dispase II, powder</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html&quot;&gt;Life Technologies&lt;/a&gt;</td><td>17105-041</td><td>Neutral protease, Cell dissociation</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot; fo:keep-together.within-page=&quot;1&quot; fo:keep-with-previous.within-page=&quot;always&quot;&gt;&lt;strong&gt;Table 3.&lt;/strong&gt; &lt;strong&gt;Primers for detection of virus genomic integration.&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Primer&#039;s Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Forward (Fwd)&amp;nbsp; 5&amp;rsquo; --&gt;3&amp;rsquo;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Reverse (Rev) 5&amp;rsquo;--&gt;3&amp;rsquo;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Discription&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>pSIN EF1a Fwd</td><td>TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA</td><td>--</td><td>EF1a promoter sequence</td></tr><tr><td>GATA1 Rev</td><td>--</td><td>TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC</td><td>&amp;nbsp;Coding Region&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>GATA2 Rev</td><td>--</td><td>GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG</td><td>&amp;nbsp;Coding Region&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TAL1 Rev</td><td>--</td><td>AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT</td><td>&amp;nbsp;Coding Region&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LMO2 Rev</td><td>--</td><td>GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC</td><td>&amp;nbsp;Coding Region&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ETV2 Rev</td><td>--</td><td>GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Coding Region&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

direct induction of hemogenic endothelium and blood by overexpression of transcription factors in human pluripotent stem cells

במהלך פיתוח, תאי hematopoietic נובעים ממשנה מיוחד של תאי האנדותל, האנדותל hemogenic (HE). פיתוח מודלים הוא במבחנה הוא חיוני למחקרים מכניסטית של מעבר אנדותל-hematopoietic ומפרט hematopoietic. כאן, אנו מתארים שיטה לזירוז יעיל של HE מתאי אנושיים pluripotent גזע (hPSCs) בדרך של ביטוי יתר של קבוצות שונות של גורמי שעתוק. השילוב של ETV2 וGATA1 או GATA2 TFS משמש כדי לגרום לו עם פוטנציאל פאן-מיאלואידית, תוך שילוב של GATA2 וגורמי שעתוק TAL1 מאפשר לייצורו עם erythroid ופוטנציאל megakaryocytic. התוספת של LMO2 לGATA2 ושילוב TAL1 משמעותית מאיצה בידול ומגבירה את ייצור תאי erythroid וmegakaryocytic. שיטה זו מספקת אמצעי יעיל ומהיר של האינדוקציה HE מhPSCs ומאפשרת לתצפית של האנדותל-hematopoietiמעבר ג בצלחת תרבות. הפרוטוקול כולל נהלי התמרה hPSCs וניתוח שלאחר התמרה-שלו ואבות דם.

התרשים סכמטי של הוא ואינדוקצית דם מhPSCs ידי ביטוי יתר של גורמי שעתוק מוצג באיור 1. ETV2 עם שילוב GATA1 או GATA2 גורם hematopoiesis פאן-מיאלואידית, בעוד GATA2, TAL1 +/- שילוב LMO2 גורם hematopoiesis בעיקר erythro-megakaryocytic. שני שילובי TF ישירות מושרה תאיו שהפכו בהמשך לאבות דם עם ספקטרום שונה של ביד...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

אינדוקציה ישירה של Hemogenic האנדותל ודם על ידי יתר של גורמי שעתוק בתאי גזע pluripotent האדם

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

direct-induction-hemogenic-endothelium-blood-overexpression

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.5K Views.  University of Wisconsin-Madison. This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors. 

Video: Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to primary human adult neural cultures raises unique challenges. Recent developments in induced pluripotent stem cells (iPSC) provides an alternative approach to derive neural cultures from skin fibroblasts through patient specific iPSC, but this process is labor intensive, requires special expertise and large amounts of resources, and can take several months. This prevents the wide application of this technology to the study of neurological diseases. To overcome some of these issues, we have developed a method to derive neural stem cells directly from human adult peripheral blood, bypassing the iPSC derivation process. Hematopoietic progenitor cells enriched from human adult peripheral blood were cultured in vitro and transfected with Sendai virus vectors containing transcriptional factors Sox2, Oct3/4, Klf4, and c-Myc. The transfection results in morphological changes in the cells which are further selected by using human neural progenitor medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The resulting cells are characterized by the expression for neural stem cell markers, such as nestin and SOX2. These neural stem cells could be further differentiated to neurons, astroglia and oligodendrocytes in specified differentiation media. Using easily accessible human peripheral blood samples, this method could be used to derive neural stem cells for further differentiation to neural cells for in vitro modeling of neurological disorders and may advance studies related to the pathogenesis and treatment of those diseases.

A method was developed to directly derive human neural stem cells from hematopoietic progenitor cells enriched from peripheral blood cells.

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent state. Now, reprogramming is done with various types of adult somatic cells: keratinocytes, urine cells, fibroblasts, etc. Early experiments were usually done with dermal fibroblasts. However, this required an invasive surgical procedure to obtain fibroblasts from the patients. Therefore, suspension cells, such as blood and urine cells, were considered ideal for reprogramming because of the convenience of obtaining the primary cells. Here, we report an efficient protocol for iPSC generation from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). By plating the transduced PBMCs serially to a new, matrix-coated plate using centrifugation, this protocol can easily provide iPSC colonies. This method is also applicable to umbilical cord blood mononuclear cells (CBMCs). This study presents a simple and efficient protocol for the reprogramming of PBMCs and CBMCs.

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

נייד דור גזע מושר מתאי דם באמצעות וירוס Sendai ו צנטריפוגה

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

דור של תאי גזע מושרים אינטגרציה נטולה מן אדם הדם ההיקפי mononuclear תאי שימוש וקטורי Episomal

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

הומוגניים אנדותל בידול מתאי גזע האדם Pluriפוטנטי במזין-ו-Xeno-תנאי מוגדר חינם

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human HSC emergence in vitro are required to overcome limitations in studying this complex developmental process. Here, we describe a protocol to generate hematopoietic stem and progenitor-like cells from human dermal fibroblasts employing a direct cell reprogramming approach. These cells transit through a hemogenic intermediate cell-type, resembling the endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) characteristic of HSC specification. Fibroblasts were reprogrammed to hemogenic cells via transduction with GATA2, GFI1B and FOS transcription factors. This combination of three factors induced morphological changes, expression of hemogenic and hematopoietic markers and dynamic EHT transcriptional programs. Reprogrammed cells generate hematopoietic progeny and repopulate immunodeficient mice for three months. This protocol can be adapted towards the mechanistic dissection of the human EHT process as exemplified here by defining GATA2 targets during the early phases of reprogramming. Thus, human hemogenic reprogramming provides a simple and tractable approach to identify novel markers and regulators of human HSC emergence. In the future, faithful induction of hemogenic fate in fibroblasts may lead to the generation of patient-specific HSCs for transplantation.

This protocol demonstrates the induction of a hemogenic program in human dermal fibroblasts by enforced expression of the transcription factors GATA2, GFI1B and FOS to generate hematopoietic stem and progenitor cells.

הומוגניים מתיכנות מראש של האדם פיברותקיעות על ידי ביטוי שנאכף של גורמים שעתוק

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial cells, which line blood vessel lumens, from human pluripotent stem cells is crucial for a multitude of tissue engineering and regeneration applications. In vivo, primordial endothelial cells are derived from the mesodermal lineage and are specified toward specific subtypes, including arterial, venous, capillary, hemogenic, and lymphatic. Hemogenic endothelial cells are of particular interest because, during development, they give rise to hematopoietic stem and progenitor cells, which then generate all blood lineages throughout life. Thus, creating a system to generate hemogenic endothelial cells in vitro would provide an opportunity to study endothelial-to-hematopoietic transition, and may lead to ex vivo production of human blood products and reduced reliance on human donors. While several protocols exist for the derivation of progenitor and primordial endothelial cells, generation of well-characterized hemogenic endothelial cells from human stem cells has not been described. Here, a method for the derivation of hemogenic endothelial cells from human embryonic stem cells in approximately 1 week is presented: a differentiation protocol with primitive streak cells formed in response to GSK3&#946; inhibitor (CHIR99021), then mesoderm lineage induction mediated by bFGF, followed by primordial endothelial cell development promoted by BMP4 and VEGF-A, and finally hemogenic endothelial cell specification induced by retinoic acid. This protocol yields a well-defined population of hemogenic endothelial cells that can be used to further understand their molecular regulation and endothelial-to-hematopoietic transition, which has the potential to be applied to downstream therapeutic applications.

Presented here is a simple protocol for the directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells in approximately 1 week.

התמיינות מכוונת של תאי אנדותל המוגניים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

דור של תאים אנושיים מושרים pluripotent גזע מדם היקפי באמצעות STEMCCA lentiviral הווקטור

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Biology

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study defined aspects of that organ in a tissue culture dish. The breadth and application of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived organoid research have advanced significantly to include the brain, retina, tear duct, heart, lung, intestine, pancreas, kidney, and blood vessels, among several other tissues. The development of methods for the generation of human microvessels, specifically, has opened the way for modeling human blood vessel development and disease in vitro and for the testing and analysis of new drugs or tissue tropism in virus infections, including SARS-CoV-2. Complex and lengthy protocols lacking visual guidance hamper the reproducibility of many stem cell-derived organoids. Additionally, the inherent stochasticity of organoid formation processes and self-organization necessitates the generation of optical protocols to advance the understanding of cell fate acquisition and programming. Here, a visually guided protocol is presented for the generation of 3D human blood vessel organoids (BVOs) engineered from hPSCs. Presenting a continuous basement membrane, vascular endothelial cells, and organized articulation with mural cells, BVOs exhibit the functional, morphological, and molecular features of human microvasculature. BVO formation is initiated through aggregate formation, followed by mesoderm and vascular induction. Vascular maturation and network formation are initiated and supported by embedding aggregates in a 3D collagen and solubilized basement membrane matrix. Human vessel networks form within 2-3 weeks and can be further grown in scalable culture systems. Importantly, BVOs transplanted into immunocompromised mice anastomose with the endogenous mouse circulation and specify into functional arteries, veins, and arterioles. The present visually guided protocol will advance human organoid research, particularly in relation to blood vessels in normal development, tissue vascularization, and disease.

This protocol describes the generation of self-organizing blood vessels from human pluripotent and induced pluripotent stem cells. These blood vessel networks exhibit an extensive and connected endothelial network surrounded by pericytes, smooth muscle actin, and a continuous basement membrane.

יצירת אורגנואידים של כלי דם אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...