This video article is sponsored by Cerebos Pacific Limited. This work is supported by National Medical Research Council Collaborative Research Grant (NMRC-CBRG-0041/2013) and Ministry of Education Academic Research Funding (MOE AcRF- Tier 1 - T1-2012 Oct -02).

נהלי כל החיה אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מהאוניברסיטה הלאומית של סינגפור. 1. הכנת הנוזל השדרתי המלאכותי (ACSF) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ACSF בהיקף של (מ&quot;מ) 124 NaCl, 3.7 KCl, 1.0 MgSO 4 .7H 2 O, 2.5 CaCl 2 .2H 2 O, 1.2 KH 2 PO 4, 24.6 NaHCO 3, ו -10 D-גלוקוז. להבטיח את ה- pH של ACSF הוא בין 7.2-7.4 כאשר בועות לרוויה עם 95% O 2 ו -5% תערובת CO 2 (carbogen). 21 השתמשו ACSF זה עבור שתי הנתיחה, הכנת פרוסה ולזלוף במהלך קלטות אלקטרו. הערה: השתמש במנגנון נקי למדידה ומחזיק ACSF. שימוש במנגנון נקי עלולה להוביל לפתרונות או היווצרות של משקעים מעונן. השתמש במים ללא יונים לכל ההכנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מלאי ACSF 10x 2 L לא כולל NaHCO 3 </sUB&gt; ו- D-גלוקוז בבקבוק נפח. להוסיף חומרים כימיים למים ללא יונים בסדר הבא: NaCl (144.96g), KCl (5.52g), 4 MgSO .7H 2: 0 (4.92g), CaCl 2 .2H 2 0 (ז 7.56), KH 2 PO 4 (3.28 ז) ועליון עד נפח של 2 ל &#39;מערבבים ברציפות לפחות 30 דקות באמצעות stirrer מגנטי כדי להבטיח את כל חומרים כימיים מומסים. אחסן את המניה ב 4 o C ולהשתמש בתוך 2 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הנתיחה והניסויים, לדלל את מניות ACSF בבקבוק נפח יחד עם תוספת הסכומים הנדרשים של NaHCO 3 ו- D-גלוקוז. לפתרון 1 ליטר, לדלל של המניה 100 מיליליטר לליטר 1 לאחר הוספת 2.07 גר &#39;NaHCO 3 ו- D-גלוקוז 1.802 גרם. ACSF צריך להיות פתרון ברור ללא כל משקע או חלקיקים שלא נמס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגניב על 200-300 מיליליטר של ACSF על קרח, לשימוש במהלך נתיחה. ודא שACSF משמש לניתוח הוא בין 2-4 מעלות צלזיוס. השתמש בACSF שנותר לelectropניסויי hysiological. כל פתרונות ACSF בועת הרוויה עם carbogen (5% CO 2, 95% O 2) ברציפות. בזמן ההמתנה לACSF להתקרר, להכין את השטח לנתיחה ותא פרוסה. </li></ol> 2. הכנת ממשק קאמרי הערה: תא פרוסת מוח ממשק, המשמשת לדוגר את הפרוסות ושמירתם במהלך קלטות אלקטרו (איור 2), מורכב משני תאים. התא התחתון מכיל מים מזוקקים שמרו על 32 מעלות צלזיוס על ידי בקר טמפרטורה ומבעבע ברציפות עם carbogen. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את בקר הטמפרטורה ומראש זה ב 32 מעלות צלזיוס. שטוף את החדר העליון במשך 10 עד 15 דקות על ידי הפעלת מים מזוקקים דרך צינור יבוא. ודא שהחדר העליון הוא נקי לפני הנחת הרשת. בדוק שמפלס המים בתא התחתון הוא כ -70% מלאים במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח אתנקי בחדר העליון כדי לספק משטח מנוחה לפרוסות (איור 2 ג). התאם את צינורות יצוא כדי להבטיח שרמת הפתרון מספיק להרטיב את האזור כולו לרשת. מניחים את המכסה מעל הרשת כדי לשמור על אווירת carbogen humidified בתוך התא העליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את קצב הזרימה עד 1 מיליליטר / דקה. לשמור על קצב זרימה זה לאורך כל תקופת הדגירה הפרוסה והניסוי. התחל carbogenating ACSF 1x מוכן הטרי ולטבול את צינורות הזרימה לACSF. לאפשר 20 דקות לACSF להיות רווי בcarbogen ולחדר העליון להיות מלא עם זה. </li></ol> 3. הכנת פרוסות בהיפוקמפוס חריפה הערה: פרוטוקול הנתיחה מורכב (1) להסרת של מוח מבעלי החיים לACSF קר ו( 2) בידוד וחיתוך של ההיפוקמפוס. על מנת שתאי העצב להישאר קיימא, לבודד ולמקם את המוח בACSF הקר במהירות ולהשלים את כלתהליך כולל חיתוך בתוך 3-5 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההסרה של המוח לACSF הקר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הכלים לנתיחה באופן שמוצג באיור 1 א. מסדרים את הכלים על פי סדר שימוש כדי להקל על תהליך הניתוח. לפני שמתחיל, להבטיח את כל הכלים לנתיחה מוכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר סכין גילוח, לנקות עם אתיל אצטט, אתנול מוחלט ומים מזוקקים, על מסוק הרקמה הידני (איור 1), לאבטח אותו בחוזקה ולהבטיח כי חוד החנית מיושר באופן שווה. מבחן קיצוץ פיסת נייר סינון כדי להבטיח שהלהב מאובטח היטב. הגדר את מיקרומטר Vernier הזזה לעמדת המוצא שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיה באמצעות פחמן דו חמצני (CO 2) בתא אינדוקציה ולערוף עם מספריים תחבושת או גיליוטינה. באמצעות מספריים איריס, להסיר את העור ופרווה מעל הגולגולת. לעשות חתך דרך האחורי כדי להסיר את brainstem.Make חתך קטן לאורך הדואר צד ימין של הגולגולת וחתך כבר בצד השמאל. זהירות! הפוך רק חתך קטן בצד שמשמש לניסויים, כדי למנוע פגיעה בו. כאשר מכניסים את המספריים, לוודא כי הכוח ליישם הוא כלפי מעלה, כדי למנוע נזק למוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את הגולגולת עם עצם rongeur מתחיל משמאל לצד ימין של גולגולת כדי לחשוף את הקליפה. שכבה דקה של דורה ניתן גם לראות. מוציא בזהירות את הצלחות חזיתיות עם rongeur. הסר ביותר של הדורה, יחד עם הצלחות הקדמיות. זהירות! היזהר שהדורה לא לחתוך דרך רקמת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הדורה שנותרה, אם בכלל, במיוחד בצומת בין קליפת המוח ובמוח קטן עם הקצה השטוח של מרית. לצעדים 3.1.5 ו3.1.6, לשמור על לחץ כלפי מעלה כלומר, מן המוח, כדי למנוע פגיעה בו. שימוש במרית, בעדינות לגרוף את המוח לתוך צלחת פטרי מלאה ב( 2-4 מעלות צלזיוס) הקרה וACSF carbogenated, PLACED על בלוק קירור אלומיניום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של ההיפוקמפוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל, לעשות חתך ישר להסיר את המוח הקטן וקיצוץ נוסף כדי להסיר את החלק הקדמי של המוח (הרבעון כ אחד). לעשות חתך רדוד לאורך קו האמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את הקליפה עם scaler מגל, החל מקו האמצע כדי לחשוף את ההיפוקמפוס הגבי. להסיר את השכבה של קליפה מעל היפוקמפוס. להשתמש באצבעות או מלקחיים זווית לתמוך במוח. לעשות חתך קטן להשליך בהיפוקמפוס. הוצא בעדינות את ההיפוקמפוס עם scaler המגל החל מההיפוקמפוס הגב באמצעות תנועות מתגלגלות. זהירות! להיות עדין כדי למנוע מתיחה וקריעת היפוקמפוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל קליפת המוח ורקמות חיבור סביב היפוקמפוס המבודד עם scaler המגל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הרקמה בהיפוקמפוס והעברת פרוסות על תא הממשק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פיסת ACSF-נייר ספוג מסנן (כיתה 1, 30 מ&quot;מ) בשלב החיתוך של מבצעה הידני. סקופ ולמקם את הרקמה בהיפוקמפוס על נייר הסינון. הזז את נייר הסינון כדי ליישר את ההיפוקמפוס בכיוון נכון ביחס ללהב של מבצעה, כך שההיפוקמפוס הוא פרוס בזווית של כ -70 o לfimbria. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחוק את הפתרון העודף סביב הרקמה בהיפוקמפוס עם נייר סינון מקופל (1 כיתה, 85 מ&quot;מ) עוזב את ההיפוקמפוס מעט רטובה. להתחיל לחתוך בהיפוקמפוס רוחבי. פרוסה וזורקי רקמה מהקצה הקיצוני של ההיפוקמפוס בי מורפולוגיה פרוסה לא ברורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורסים את הרקמה שנותרה לפרוסות 400 מיקרומטר-עבות. להרים פרוסות בהיפוקמפוס בעדינות מהלהב עם מברשת עם זיפים רכים באמצעות תנועות swiping עדינות ומניחים את הפרוסות לתוך כוס קטנה מלאות ACSF carbogenated הקר. בצע את שלבי 3.3.1-3.3.3 במהירות אפשרית מאז הרקמה בהיפוקמפוס חשופה לאוויר. הערה: באופן כללי שני שלישים של ההיפוקמפוס הוא פרוסים, וניתן להכין 4-6 פרוסות עם מורפולוגיה ברורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הפרוסות בעדינות על גבי הרשת בתא פרוסה בעזרת פיפטה נקייה פסטר מפלסטיק עם קצה רחב (שנעשתה על ידי חיתוך במרחק 2-3 סנטימטר של הקצה). להתאים בזהירות את העמדה של פרוסות ברשת באמצעות מזרק קטן עם קצה מכופף. מקם את הפרוסות באופן שמאפשר מיקום האלקטרודה והקלטה. בדוק כדי לוודא שהפרוסות מוקפות מספיק על ידי ACSF אך אינם שקועות או צף (איור 2C-D). מכסה את תא דגירה את הפרוסות במשך 2-3 שעות. הערה: שכבת התאים פירמידליים בפרוסות הבריאים צריכה להראות קצת שקיפות. </li></ol></li></ol> 4. הקלטה של ​​תגובות CA3-CA1 Synaptic הערה: הגדרת אלקטרופיזיולוגיה משמשת להקלטת פוטנציאל שדה מוצגת באיור 2 א. פארהכלוב היום מומלץ מאוד אם ההפרעה החשמלית היא מעבר לשליטה לאחר ההארקה הנכונה של הגדרות חשמל. סוגים רבים ושונים של תאים שקועים וממשק זמינים מסחרי. עם זאת, תאי ממשק מועדפים כתגובות הסינפטי חזקות יותר תערוכת פרוסות בהם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום של אלקטרודות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעילו את מכשירים החשמליים לשימוש (לגירוי ומגברים). הר ולאבטח את האלקטרודות המגרה והקלטה בבעלי פרספקס של micromanipulators. הערה: אנו משתמשים בmonopolar,, אלקטרודות מצופים לכה נירוסטה של ​​התנגדות 5 MΩ למטרות המגרה והקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש, להכניס אלקטרודות אלה בתוך נימי זכוכית משך ובטוחים עם דבק אפוקסי חושף רק חלק קטן מקצה האלקטרודה (איור 2E). זה נותן כוח לאלקטרודות אחרת דקות ועוזר לאבטח אותם בחוזקה בeleבעלי ctrode. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מודרך מתחת למיקרוסקופ, מקם את האלקטרודה מגרה (ים) בradiatum השכבה של אזור CA1 כדי לעורר את הסיבים בטחונות שפר ואת האלקטרודה ההקלטה באזור הדנדריטים הפסגה של CA1 להקליט תגובות (fEPSP) שדה-EPSP. הערה: מתקרבת פני הנוזל מעל הפרוסה עם אלקטרודות נותנת קול המסייע לאתר במהירות את פני השטח של הפרוסה (בתנאי, המגבר מחובר לרמקול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויי תיוג ולכידה הסינפטי, על פי הצורך של הניסוי, אלקטרודות עמדה שתיים או שלושה גירוי (S1, S2 או S3) משני צדי האלקטרודה ההקלטה כדי לעורר שתיים או יותר עצמאיים אך חופף תשומות. מקם את האלקטרודות המגרה והקלטה על 200 מיקרומטר מלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת צורך, איתור האלקטרודה הקלטה אחרת בשכבת pyramidale השכבה להקלטת ספייק אוכלוסייה (איור 3 א) .When שניאלקטרודות נגעו פרוסה, באמצעות תוכנת הרכישה, לתת גירוי מבחן כדי להבטיח אות fEPSP נכונה. הערה: אנו משתמשים בפולסים biphasic, זרם קבוע (משך דחף 0.1 msec / חצי גל) לגירוי מבחן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שאות fEPSP נכונה מתקבלת, להוריד בזהירות את האלקטרודות על 200 מיקרומטר עמוק באמצעות כפתורי תנועת קנס של מניפולטורים. לאפשר 20 דקות לפרוסות להתאושש. בדוק את עצמאות המסלול עם פרוטוקול סיוע לזווג דופק 27,28. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביחס תשומה-תפוקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את יחס קלט-פלט (גירוי מביא לעומת מדרון fEPSP) עבור כל קלט על ידי מדידת ערך המדרון בטווח של עוצמות הנוכחיות. לבצע את זה בין 20 מיקרו-אמפר עד 100 מיקרו-אמפר. לאחר מכן קבע את עוצמת גירוי לכל קלט להשיג 40% ממדרון fEPSP המרבי. שמור מתמיד לאורך כל הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 15-20 דקות, להתחיל בהקלטה הבסיסית. צג Fמדרון EPSP הדוק בתקופה זו ולאפס את עוצמת הגירוי אם המדרון משתנה יותר מ -10% מהשווי שנקבע ולהתחיל בנקודת ההתחלה חדשה. שיא דקות לפחות 30 או בסיס יציב שעה 1 לפני שימשיכו. הערה: למבחן או הגירוי בנקודת ההתחלה, אנחנו משתמשים בארבעה מטאטא של פולסים 0.2 הרץ biphasic, קבועים הנוכחיים (0.1 msec לקוטביות) ניתנו כל 5 דקות. שיפוע ממוצע של ארבע תגובות אלה נחשב אז כחוזר אחד. האותות מסוננים ומוגברים על ידי מגבר ההפרש, דיגיטציה באמצעות ממיר אנלוגי לדיגיטלי ומעקב באינטרנט עם תוכנה מותאמת אישית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אינדוקציה של LTP / בע&quot;מ באמצעות פרוטוקולי גירוי הערה: שני LTP ו LTD סווג כמוקדם ומאוחר-LTP / בע&quot;מ המבוסס על הדרישות של סינתזת חלבון; התרגום האחרון מחייב ו / או שעתוק לתחזוקה מאוחר [לסקירה ראה 4]. מגוון של פרדיגמות גירוי חשמליות יכול specifically לגרום צורות השונות של LTP ו LTD. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> WTET: 100 הרץ, 21 פעימות זרם קבועות biphasic (0.2 msec לשלב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לא לתקן: שלוש התפרצויות של לשנייה אחת (100 הרץ) כל 10 דקות (Pulse 0.2 msec הרוחב לפאזה) 100 פעימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 900 התפרצויות במשך זמן 15 דקות. פרץ 1 כולל 3 פעימות (0.2 רוחב אלפיות שני) עם מרווח של 50 אלפיות שניים interpulse (20 הרץ). המרווח בין הפרץ הוא 1 שניות (מספר כולל של 2,700 פעימות). </li></ol></li></ol> 5. ניקוי של Slice קאמרי ומערכת זלוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההקלטה נגמרה, לאסוף את פרוסות בהיפוקמפוס לאנליזה ביוכימית נוספת או אחר להשליך כראוי. כבה את אספקת carbogen ובקר טמפרטורה. שטוף את bubbler carbogen במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות את הרשת באופן יסודי עם מברשת ומים מזוקקים. שטוף את האסדה במשך 15-20 דקות במים מזוקקים בקצב זרימה גבוה יותר. פעם ב3-4 ימים, להחליף את המים מזוקקים בתא תחתון של התא וגם נקי הקאמרית באופן קבוע עם 3% מי חמצן פתרון כדי למנוע פטריית צמיחה. </li></ol>

<ol>
	<li>Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synaptic+model+of+memory:+long-term+potentiation+in+the+hippocampus.">A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus.</a> Nature. 361, 31-39 (1993).</li><li>Siegelbaum, S. A., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning-related+synaptic+plasticity:+LTP+and+LTD..">Learning-related synaptic plasticity: LTP and LTD..</a> Current Opinion in Neurobiology. 1, 113-120 (1991).</li><li>Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+and+memory:+an+evaluation+of+the+hypothesis.">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annual review of neuroscience. 23, 649-711 (2000).</li><li>Malenka, R. C., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+and+LTD:+An+Embarrassment+of+Riches.">LTP and LTD: An Embarrassment of Riches.</a> Neuron. 44, 5-21 (2004).</li><li>Krug, M., Lossner, B., Ott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisomycin+blocks+the+late+phase+of+long-term+potentiation+in+the+dentate+gyrus+of+freely+moving+rats.">Anisomycin blocks the late phase of long-term potentiation in the dentate gyrus of freely moving rats.</a> Brain research bulletin. 13, 39-42 (1984).</li><li>Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisomycin+blocks+an+inhibitor+of+protein+synthesis,+blocks+late+phases+of+LTP+phenomena+in+the+hippocampal+CA1+region+in+vitro.">Anisomycin blocks an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro.</a> Brain research. 452, 57-65 (1988).</li><li>Otani, S., Marshall, C. J., Tate, W. P., Goddard, G. V., Abraham, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+long-term+potentiation+in+rat+dentate+gyrus+requires+protein+synthesis+but+not+messenger+RNA+synthesis+immediately+post-tetanization.">Maintenance of long-term potentiation in rat dentate gyrus requires protein synthesis but not messenger RNA synthesis immediately post-tetanization.</a> Neuroscience. 28, 519-526 (1989).</li><li>Frey, U., Frey, S., Schollmeier, F., Krug, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+actinomycin+D,+a+RNA+synthesis+inhibitor,+on+long-term+potentiation+in+rat+hippocampal+neurons+in+vivo+and+in+vitro.">Influence of actinomycin D, a RNA synthesis inhibitor, on long-term potentiation in rat hippocampal neurons in vivo and in vitro.</a> The Journal of physiology. 490 (3), 703-711 (1996).</li><li>Nguyen, P. V., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macromolecular+synthesis-dependent+late+phase+of+long-term+potentiation+requiring+cAMP+in+the+medial+perforant+pathway+of+rat+hippocampal+slices).">A macromolecular synthesis-dependent late phase of long-term potentiation requiring cAMP in the medial perforant pathway of rat hippocampal slices).</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 3189-3198 (1996).</li><li>Manahan-Vaughan, D., Kulla, A., Frey, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+translation+but+not+transcription+for+the+maintenance+of+long-term+depression+in+the+CA1+region+of+freely+moving+rats.">Requirement of translation but not transcription for the maintenance of long-term depression in the CA1 region of freely moving rats.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 20, 8572-8576 (2000).</li><li>Frey, U., Morris, R. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+tagging+and+long-term+potentiation.">Synaptic tagging and long-term potentiation.</a> Nature. 385, 533-536 (1997).</li><li>Frey, U., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weak+before+strong:+dissociating+synaptic+tagging+and+plasticity-factor+accounts+of+late-LTP.">Weak before strong: dissociating synaptic tagging and plasticity-factor accounts of late-LTP.</a> Neuropharmacology. 37, 545-552 (1998).</li><li>Redondo, R. L., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+memories+last:+the+synaptic+tagging+and+capture+hypothesis.">Making memories last: the synaptic tagging and capture hypothesis.</a> Nature reviews. Neuroscience. 12, 17-30 (2011).</li><li>Martin, K. C., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+tagging+--+who's+it?.">Synaptic tagging -- who's it?.</a> Nature reviews. Neuroscience. 3, 813-820 (2002).</li><li>Frey, U., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+tagging:+implications+for+late+maintenance+of+hippocampal+long-term+potentiation.">Synaptic tagging: implications for late maintenance of hippocampal long-term potentiation.</a> Trends in neurosciences. 21, 181-188 (1998).</li><li>Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+tagging+during+synapse-specific+long-term+facilitation+of+Aplysia+sensory-motor+neurons.">Synaptic tagging during synapse-specific long-term facilitation of Aplysia sensory-motor neurons.</a> Neurobiology of learning and memory. 78, 489-497 (2002).</li><li>Shires, K. L., Da Silva, B. M., Hawthorne, J. P., Morris, R. G., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+tagging+and+capture+in+the+living+rat.">Synaptic tagging and capture in the living rat.</a> Nature communications. 3, (2012).</li><li>Ramachandran, B., Frey, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+the+actin+network+and+its+effect+on+long-term+potentiation+and+synaptic+tagging+in+hippocampal+CA1+neurons+in+slices+in+vitro.">Interfering with the actin network and its effect on long-term potentiation and synaptic tagging in hippocampal CA1 neurons in slices in vitro.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 12167-12173 (2009).</li><li>Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+compartment-+and+process-specific+molecules+required+for+'synaptic+tagging'+during+long-term+potentiation+and+long-term+depression+in+hippocampal+CA1.">Identification of compartment- and process-specific molecules required for 'synaptic tagging' during long-term potentiation and long-term depression in hippocampal CA1.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 5068-5080 (2007).</li><li>Sajikumar, S., Navakkode, S., Sacktor, T. C., Frey, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+tagging+and+cross-tagging:+the+role+of+protein+kinase+Mzeta+in+maintaining+long-term+potentiation+but+not+long-term+depression.">Synaptic tagging and cross-tagging: the role of protein kinase Mzeta in maintaining long-term potentiation but not long-term depression.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 5750-5756 (2005).</li><li>Redondo, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+Tagging+and+Capture:+Differential+Role+of+Distinct+Calcium/Calmodulin+Kinases+in+Protein+Synthesis-Dependent+Long-Term+Potentiation.">Synaptic Tagging and Capture: Differential Role of Distinct Calcium/Calmodulin Kinases in Protein Synthesis-Dependent Long-Term Potentiation.</a> The Journal of Neuroscience. 30, 4981-4989 (2010).</li><li>Sajikumar, S., Frey, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late-associativity,+synaptic+tagging,+and+the+role+of+dopamine+during+LTP+and+LTD.">Late-associativity, synaptic tagging, and the role of dopamine during LTP and LTD.</a> Neurobiology of learning and memory. 82, 12-25 (2004).</li><li>Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis-dependent+long-term+functional+plasticity:+methods+and+techniques.">Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques.</a> Current Opinion in Neurobiology. 15, 607-613 (2005).</li><li>Villers, A., Ris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+preparation+and+preservation+of+hippocampal+mouse+slices+for+a+very+stable+and+reproducible+recording+of+long-term+potentiation.">Improved preparation and preservation of hippocampal mouse slices for a very stable and reproducible recording of long-term potentiation.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).</li><li>Pohle, W., Reymann, K., Jork, R., Malisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+experimental+conditions+on+the+morphological+preservation+of+hippocampal+slices+in+vitro.">The influence of experimental conditions on the morphological preservation of hippocampal slices in vitro.</a> Biomedica biochimica acta. 45, 1145-1152 (1985).</li><li>Reymann, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+duration+of+long-term+potentiation+in+the+CA1+region+of+the+hippocampal+slice+preparation.">The duration of long-term potentiation in the CA1 region of the hippocampal slice preparation.</a> Brain research bulletin. 15, 249-255 (1985).</li><li>Sajikumar, S., Korte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+compartments+of+apical+CA1+dendrites+have+different+plasticity+thresholds+for+expressing+synaptic+tagging+and+capture.">Different compartments of apical CA1 dendrites have different plasticity thresholds for expressing synaptic tagging and capture.</a> Learning &amp; Memory. 18, 327-331 (2011).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+Synapses+Strong:+Metaplasticity+Prolongs+Associativity+of+Long-Term+Memory+by+Switching+Synaptic+Tag+Mechanisms.">Making Synapses Strong: Metaplasticity Prolongs Associativity of Long-Term Memory by Switching Synaptic Tag Mechanisms.</a> Cerebral Cortex. 24, 353-363 (2014).</li><li>Sajikumar, S., Frey, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisomycin+inhibits+the+late+maintenance+of+long-term+depression+in+rat+hippocampal+slices+in+vitro.">Anisomycin inhibits the late maintenance of long-term depression in rat hippocampal slices in vitro.</a> Neuroscience Letters. 338, 147-150 (2003).</li><li>Ishikawa, Y., Tamura, H., Shiosaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+neuropsin+(KLK8)-dependent+synaptic+associativity+in+the+hippocampal+pyramidal+neuron.">Diversity of neuropsin (KLK8)-dependent synaptic associativity in the hippocampal pyramidal neuron.</a> The Journal of physiology. 589, 3559-3573 (2011).</li><li>Ishikawa, Y., Horii, Y., Tamura, H., Shiosaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropsin+(KLK8)-dependent+and+-independent+synaptic+tagging+in+the+Schaffer-collateral+pathway+of+mouse+hippocampus.">Neuropsin (KLK8)-dependent and -independent synaptic tagging in the Schaffer-collateral pathway of mouse hippocampus.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 843-849 (2008).</li><li>Sajikumar, S., Morris, R. G. M., Korte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+between+recently+potentiated+synaptic+inputs+reveals+a+winner-take-all+phase+of+synaptic+tagging+and+capture.">Competition between recently potentiated synaptic inputs reveals a winner-take-all phase of synaptic tagging and capture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 12217-12221 (2014).</li><li>Navakkode, S., Sajikumar, S., Frey, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+IV-specific+phosphodiesterase+inhibitor+rolipram+and+its+effect+on+hippocampal+long-term+potentiation+and+synaptic+tagging.">The type IV-specific phosphodiesterase inhibitor rolipram and its effect on hippocampal long-term potentiation and synaptic tagging.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 7740-7744 (2004).</li><li>Kohl, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity.">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nature. 14, 1413-1415 (2011).</li><li>Frey, U., Huang, Y. Y., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cAMP+Simulate+a+Late+Stage+of+LTP+in+Hippocampal+CA1+Neurons.">Effects of cAMP Simulate a Late Stage of LTP in Hippocampal CA1 Neurons.</a> Science. 260, 1661-1664 (1993).</li><li>Erdogdu, G., Uto, A., Hossmann, K. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+global+ischemia+and+recirculation+of+rat+brain+on+protein+synthesis+in+vitro.">The effect of global ischemia and recirculation of rat brain on protein synthesis in vitro.</a> Metab Brain Dis. 8, 199-206 (1993).</li><li>Djuricic, B., Berger, R., Paschen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+and+energy+metabolism+in+hippocampal+slices+during+extended+(24+hours)+recovery+following+different+periods+of+ischemia.">Protein synthesis and energy metabolism in hippocampal slices during extended (24 hours) recovery following different periods of ischemia.</a> Metab Brain Dis. 9, 377-389 (1994).</li><li>Park, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-dependent+long-term+potentiation+comprises+a+family+of+temporally+overlapping+forms+of+synaptic+plasticity+that+are+induced+by+different+patterns+of+stimulation.">NMDA receptor-dependent long-term potentiation comprises a family of temporally overlapping forms of synaptic plasticity that are induced by different patterns of stimulation.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369, 20130131 (2014).</li></ol>

הגישה פתוחה למאמר זה וידאו בחסות Cerebos פסיפיק מוגבל.

פרוסת היפוקמפוס חריפה היא מערכת מודל מצוינת ללימוד LTP ותהליכי פלסטיות תפקודיים אחרים כגון STC ולכידה צולבת. היא שומרת הרבה של הרשת המבנית מינרית של המעגלים בהיפוקמפוס, מאפשר מקומות אלקטרודה מדויקים ומציע לצד, פלטפורמה פתוחה למניפולציה neuropharmacological מהירה ללא מחסום דם-מוח. מאמר זה מתאר את המתודולוגיה להכנת פרוסות בהיפוקמפוס חריפה קיימא מחולדות מבוגרות צעירות ומשתמש בהם כדי לחקור STC ותיוג צולב. המחקרים קודמים הדגישו כי מין וגיל של בעלי החיים הם גורמים חשובים להביא בחשבון לשימוש במחקרי אלקטרופיזיולוגיה. 27,28 בעלי חיים מבוגרים לכן צעירים עם פונקציות ביטוי מלא למבוגרים קולט (חולדות Wistar גברים בגילים 5-7 שבועות) משמשים. 23 סימטריות בקשרים בין ההיפוקמפוס השמאל וימין כבר ציין במכרסמים 29 והבדלים עיקריים בביטוי הקולטן NMDA דווחו גם כן 34. אנחנו השתמשנו בהיפוקמפוס הנכון כדי להיות בקנה אחד עם המחקרים הקודמים שלנו LTP. 23,32 עם זאת, אף אחד מhippocampi יכול לשמש עוד עקביות נשמר. כמו בכל פרוטוקול, זה מאוד חשוב לבצע את הבידוד וטיפול חיתוך נהלים במהירות אבל לוקח שהרקמה לא נמתחה, פגום, שניתנו יבש או חוסר חמצן. השינויים ב- pH, טמפרטורה והרכב יוני של הפתרונות יכולים להיות השפעה עמוקה על יכולת הקיום של הפרוסות ואת התוצאות. לפיכך יש להימנע וריאציות כאלה. זה נצפה כי שחרור סידן גלוטמט קולט-תלוי המתרחש במהלך שלבי הכנה בלתי הפיך יכול להשפיע על סינתזת חלבון ברקמת עצבים 35,36, 37. שימוש slicers רקמות ידני יכול לעזור להקטין את זה כך שהוא מאפשר את התהליך להסתיים מהר מאוד בהשוואה לvibraslicers. עם זאת, מעבדות רבות גם להשתמש ביעילות vibraslicers עם אמצעי זהירות דרוש לשמירה על כדאיות פרוסה. גורם חשוב נוסף שיש לשקול הוא תקופת הדגירה הארוכה לפני תחילת הניסויים. זה כבר ציין להיות באמת חיוני להשגת יציבות ברמות מדינה והפעלת קינאז חילוף חומרים בפרוסות לאחר ההפרעה שנגרמה במהלך ההכנה 23. יציבות זו דרושה לעקביות בהקלטות לטווח ארוך. אנו מדגישים שוב, בתצפית זו ומציעים שעות דגירה הארוכות של שעות על 3. מגוון רחב של פרמטרים גירוי ידוע לגרום LTP, אבל המנגנונים המולקולריים שהושרו בכל מקרה לא יכולים להיות אותו הדבר (לסקירה ראה 38). זה יכול להשפיע על העמידות ומאפיינים אחרים של LTP ש, בתורו, יכול להשפיע על התוצאות של ניסויי תיוג ולכידה הסינפטי. לכן חשוב כדי לאמת את פרדיגמות הגירוי ומאפייניםשל LTP שהושרו בתנאים של המעבדה ביצוע ולשמור על עקביות. בדרך כלל אנחנו לא מחשיבים ניסויים עם מטחי סיבי presynaptic גדולים מאוד ועם fEPSPs המקסימאלי פחות מ -0.5 mV והניסויים הכוללים שינויים משמעותיים במטח הסיבים במהלך ההקלטות גם דחו. יתר על כן, בעת ביצוע ניסויים דו-מסלול או שלושה-מסלול, זה חשוב כדי להבטיח את עצמאות המסלול. זה יכול להתבצע עם פרוטוקול סיוע לזווג דופק 28. חסרון אחד של מערכות הקלטת הממשק הוא ההיווצרות של טיפות התעבות על אלקטרודות בשעות ההקלטה הארוכות בשל הבדלי הטמפרטורה ולחות בין התא והסביבה. טיפות אלה צריכים להיות בזהירות מחקו מעת לעת. אחרת הטיפות יכולות לטפטף על הפרוסות ולגרום הפרעה או אפילו הפסד של אותות. אנחנו בדרך כלל להתמודד עם זה בy סופג מיומנות הטיפות מודרכות תחת מיקרוסקופ באמצעות פתיל נייר סינון דק, בלי לגעת באלקטרודות. עם זאת, הפתרון הטוב ביותר יהיה להשתמש במערכת הסקה מרכזית, כגון מערכת ETC שפותחה על ידי חוקרים מאוניברסיטת אדינבורו. בנימה סיכום, מגוון של שיטות קיימים במעבדות ברחבי העולם, המשמשות להכנת פרוסות בהיפוקמפוס למטרות ניסויים שונות. כל אחד מההליך מציע כמה יתרונות על פני אחרים. אחד צריך לייעל זהירות פרטי הפרטים של הפרוטוקול כדי להתאים למטרת הניסוי. אנו מקווים שמאמר זה מסייע בשיפור היבטים מסוימים של המתודולוגיה ללימוד תהליכים מאוחרים אסוציאטיביים כגון STC ולכידה צולבת.

The encoding and storage of information in the brain still remains the most significant and keenly pursued challenge in neuroscience. Over the years, long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD) have emerged as the leading cellular correlates of memory1,2. These activity dependent changes, which exhibit input specificity and associativity, result in the stabilization of memory traces in the neuronal networks 1,3,4. The maintenance of the two forms of synaptic plasticity requires the synthesis of plasticity-related products (PRPs)5-10. Synapse specificity that involves the interaction of newly synthesized protein only with specific activated synapses expressing LTP or LTD, is critical to memory. This specificity is explained by the concept of &#8216;Synaptic Tagging and Capture&#8217; (STC), where the PRPs interact with recently active, &#8216;tagged&#8217; synapses11,12. The STC process offers a framework for associative properties of memories at the cellular level. It provides us with a conceptual basis of how short-term forms of plasticity are transformed into long-lasting forms of plasticity in an associative and time-dependent manner13.
During the process of STC, a strong tetanization in one input that leads to protein synthesis dependent late-LTP, results in the reinforcement of a protein synthesis independent early-LTP induced in another independent input on to the same population of neurons into a persistent one13. The setting of a local synaptic tag by a transient neural activity and the synthesis of the diffusible PRPs by the strong neural activity are the two key events during STC13,14. The capture of the PRPs by the recently potentiated &#8216;tagged&#8217; synapses is fundamental to the maintenance of long-term potentiation. Many studies have been done to confirm the existence of STC phenomenon15-17 and identify the candidate &#8216;tags&#8217;18 and &#8216;PRPs&#8217;19. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) and extracellular signal-regulated kinase1/2 (ERK1/2); CaMKIV, Protein Kinase M (PKM) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) are some of the candidate molecules for &#8216;tag&#8217; and &#8216;PRP&#8217; respectively19-21. The synaptic tagging model has further been expanded to include the positive associative interactions between LTP and LTD - the &#8220;synaptic cross-tagging&#8221;22. In synaptic cross-tagging, a late LTP/ LTD in one synaptic input transforms the opposite protein synthesis-independent early-LTD/LTP in an independent input into its long-lasting form or vice versa22. 
The hippocampal slice preparation is the most widely used model in the studies of long-term synaptic plasticity23,24. Much of the understanding about the concepts of synaptic tagging and cross- tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the labs are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of rat hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD for extended hours are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging23,25,26. This article describes the detailed experimental procedures for studying long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>I. Dissection Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1. Bandage scissors</td>
			<td>KLS Martin, Germany</td>
			<td>21-195-23-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>B-Braun/Aesculap, Germany</td>
			<td>LX553R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Iris scissors</td>
			<td>B-Braun/Aesculap, Germany</td>
			<td>BC140R,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BC100R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Bone rongeur</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Germany</td>
			<td>14089-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Scalpel</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Germany;</td>
			<td>500236-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>B-Braun/Aesculap, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BB73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5. Scalpel blade#11</td>
			<td>B-Braun/Aesculap, Germany</td>
			<td>BB511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6. Sickle scaler</td>
			<td>KLS Martin, Germany</td>
			<td>38-685-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7. Angled forceps</td>
			<td>B-Braun/Aesculap, Germany</td>
			<td>BD321R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8. Anesthetizing/Induction chamber</td>
			<td>MIP Anesthesia Technologies (Now, Patterson Scientific), Oregon</td>
			<td>AS-01-0530-LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>II. ACSF component chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1. Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4.7H20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5. Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6. Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7. D-Glucose anhydrous (C6H12O6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>III. Electrophysiology Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1. Microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>Model SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Temperature Controller</td>
			<td>Scientific Systems Design Inc. Canada</td>
			<td>PTC03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Differential AC Amplifier</td>
			<td>AM Systems, USA</td>
			<td>Model 1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Isolated Pulse Stimulator</td>
			<td>AM Systems, USA</td>
			<td>Model 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5. Oscilloscope</td>
			<td>Rhode &#38; Schwarz</td>
			<td>HM0722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6. Digital-Analog Converter</td>
			<td>Cambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, UK</td>
			<td>CED-Power 1401-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7. Interface Brain Slice Chamber</td>
			<td>Scientific Systems Design Inc. Canada</td>
			<td>BSC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8. Tubing Pump</td>
			<td>Ismatec, Idex Health &#38; Science, Germany</td>
			<td>REGLO-Analog</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9. Carbogen Flowmeter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>03220-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10. Fiber Light Illuminator</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries</td>
			<td>Fiber Lite MI-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11. Micromanipulators</td>
			<td>Marzhauser Wetzlar, Germany</td>
			<td>00-42-101-0000 (MM-33)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>00-42-102-0000 (MM-32)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12. Electrodes</td>
			<td>AM Systems, USA</td>
			<td>571000 (Stainless steel; 0.010, 5M&#8486;, 8 degree)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of synaptic tagging/capture and cross-capture using acute hippocampal slices from rodents

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

המתודולוגיה שתוארה כבר בשימוש ללמוד צורות ארוכות טווח של LTP / בע&quot;מ והאינטראקציות האסוציאטיביים שלה כגון תיוג הסינפטי ולכידה צולבת מפרוסות בהיפוקמפוס חריפות של חולדות מבוגרות. 23 טכניקה זו הוכחה כיעילה בניסויים עם שני החולדות (Wistar) ועוד מגוון של עכבר זני 30,31. המתודולוגיה ששמשה בהצלחה להקלטות LTP יציבה של עד 8-12 שעות. 32 &#39;התג&#39; שנקבע על ידי tetanization החלש של קלט אחד (S1) לוכד את &#39;PRPs&#39; הנגרמת על ידי tetanization החזק של עוד קלט עצמאי אך חופף, ובכך הופכת את הצורה (S2 איור 3, עיגולים מלאים) אחרת מתפוררת של LTP (מוקדמת -LTP) בS1 לתוך אחד לטווח ארוך (איור 3, חוגים פתוחים) (לשם השוואה של תחילת-LTP הנגרמת על ידי WTET לראות 20,33). PRPs נתפס על ידי חלשתג סט tetanization לא צריך לבוא דווקא מהסוף-LTP מושרה לא לתקן אבל גם יכול להיות מסופק על ידי מאוחר בע&quot;מ המושרה SLFS. סוג זה של אינטראקציה חיובית בין אסוציאטיבית LTP ו LTD נקרא &#39;תיוג צולב / לכידה&#39;. מוקדם LTP המושרה WTET בS1 מקבל חיזוק לסוף-LTP (איור 3 ג, חוגים פתוחים) על ידי לכידת PRPs מסופק על ידי מאוחר בע&quot;מ המושרה SLFS בS2 (איור 3 ג, עיגולים מלאים). סטטיסטית הגברה או דיכאון משמעותי נשמרה בS1 ו- S2 בשני המקרים, בהשוואה לתחילת מחקר משלו (מבחן Wilcoxon; P &lt;0.05). ללהתרחש האינטראקציה התג-PRP, כדי הזמני של שני אירועים (חלש-חזק-לפני / חזק-חלש-לפני) הוא לא קריטי כל עוד חלון הזמן שבין שני האירועים נשאר בטווח של 30-60 דקות. זה יהיה חכם כדי לכלול הסינפטי שלישי, עצמאי אך חופף בלשים ולהשתמש בו כבסיס לשליטה לפקח על היציבות של הקלטות. פרוטוקולי הגירוי החשמליים המשמשים כדי לעודד צורות מוקדמות, ומאוחר של LTP / בע&quot;מ חייבים להיות מאומתים באחת-קלט ניסויים לעקביות ואמינות לפני השימוש בהם בניסויי STC. כמו כן, אנו רוצים להדגיש את החשיבות של המתודולוגיה הכנת פרוסה המתוארת בפרוטוקול מאז ההצלחה של ניסויים אלה מסתמכת במידה רבה על איכות הפרוסות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53008/53008fig1.jpg" /> איור 1. כלים () המשמשים לנתיחה של ההיפוקמפוס: (א) מספריים תחבושת (ב) איריס מספריים (ג) rongeur עצם (ד) מרית דקה, מספר אזמל 11 (ו) scaler מגל (ז) (ה) רכה מברשת צבע -bristle פיפטה פלסטיק פסטר נייר (i) מסנן (85mm) (י) נייר סינון (30mm) (יא) כוסות זכוכית (L) בלוקים קירור אלומיניום כדי שיתאימו למנה וכוסות פטרי (ח)צלחת (מ &#39;) פטרי. מסוק רקמה ידני (B). (א) פלטפורמה (ב) חיתוך זרוע עם להב בעל (ג) Vernier מיקרומטר, רזולוציה 10 מיקרון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53008/53008fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53008/53008fig2.jpg" /> איור 2. אלקטרופיזיולוגיה הגדרה לקלטות שדה-פוטנציאלי בהיקף של גירוי (א) (ב) מגבר ההפרש (ג) אנלוגית לדיגיטלי ממיר (ד) אוסצילוסקופ (ה) מחשב עם תוכנת רכישה (ו) Vibration- טבלה עליונה עמיד מיקרוסקופ (ז) עם 4x הגדלה (ח) תא המוח פרוסה ממשק מקור תאורה (L) מערכת טפטוף לאספקת ACSF וcarbogen (י) בקר טמפרטורה (k) (i) מניפולטורים&gt; עם מחזיקי אלקטרודה. (ב) במוח-פרוסת ממשקקאמרי. (ג) &amp; (ד) פרוסות בהיפוקמפוס בתא הממשק. אלקטרודה פלדה (E) נירוסטה אטומה בנימי זכוכית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53008/53008fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53008/53008fig3.jpg" /> איור 3. ייצוג סכמטי של מיקום פרוסה ואלקטרודה בהיפוקמפוס רוחבי להקלטת שדה-פוטנציאלי (): בייצוג זה, שתי אלקטרודות גירוי (S1 ו- S2) ממוקמות בradiatum השכבה של אזור CA1 כדי לעורר שתי עצמאי אך חופף תשומות הסינפטי על נוירונים הפירמידה CA1. שתי אלקטרודות הקלטה תאית, אחד להקליט שדה-EPSP (פוטנציאל הפוסט-סינפטי מעורר) מהתא הדנדריטי הפסגה ועוד להקליט ספייק אוכלוסייה גופני מתא הפירמידהגופים, נמצאים בradiatum השכבה והשכבה pyramidale בהתאמה. CA1- קורנו ammonis אזור 1, CA3- קורנו ammonis אזור 3, gyrus המשונן DG-, סיבי טחונות SC- שפר, S1- אלקטרודה מגרה 1, אלקטרודה S2-גירוי 2. (ב) חלש לפני הפרדיגמה חזקה ללמוד STC: tetanization החלש (WTET) מוחל S1 (עיגולים פתוחים) לגרימה המוקדם LTP אחרי tetanization החזק (לא לתקן) של S2 (עיגולים מלאים) ב- 30 דקות כדי לגרום לאיחור-LTP. מוקדם LTP בS1 מקבל חיזוק לסוף-LTP מראה תיוג וללכוד אינטראקציה (n = 6) (ג) חלש לפני הפרדיגמה חזקה ללמוד תיוג צולב:. מוקדם LTP הוא מושרה על ידי WTET בS1 (עיגולים פתוחים) ואחרי על ידי האינדוקציה של סוף-בע&quot;מ בS2 (עיגולים מלאים) באמצעות SLFS לאחר 30 דקות. בS1, המוקדם LTP הופך לסוף-LTP שנמשך 6 שעות מראים תיוג צולב ולכידה (n = 6). חץ אחד מייצג tetanization החלש הגיש בקשה לזירוז מוקדם LTP. שלישייה של חיצים מייצגתtetanization החזק גרימת מאוחר LTP. החץ השבור מייצג את נקודת הזמן שבי SLFS היה מוחלת על הקלט הסינפטי הנציג לגרום מאוחר בע&quot;מ. ברים שגיאה מצביעים SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53008/53008fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents at JoVE.com

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

חקירה של Synaptic תיוג / לכידה וצלב-לכידה באמצעות חריפות בהיפוקמפוס פרוסות ממכרסמים

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

investigation-synaptic-taggingcapture-cross-capture-using-acute

Google

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Views.  National University of Singapore. This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

Video: Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

הכנת Oligomeric β עמילואיד 1-42 ו אינדוקציה של ירידת ערך הפלסטיות הסינפטית על Slices בהיפוקמפוס

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

הכנת פרוסות בהיפוקמפוס של חולדות חריפה העכברים הטרנסגניים לחקר שינויים Synaptic במהלך ההזדקנות עמילואיד פתולוגיה

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation של נוירונים בין פרוסות המוח מכרסמים לחקר הילוכים Synaptic ותמונה מסופי Presynaptic

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

תיוג Immunogold לאחר הטבעה של חלבונים בתרבויות Synaptic Slice היפוקמפוס

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

הקלטות תא כל לזווג בפרוסות בהיפוקמפוס Organotypic

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

מדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

הקלטה הפלסטיות הסינפטית בפרוסות בהיפוקמפוס חריפה, בהשתתפות של מיחזור - בנפח מצומצם, זלוף- ומערכת ועלייתו-סוג תא

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

הערכה של צפיפות סינפסה פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other neurodegenerative disorders, this independence might be compromised due to insufficient glutamate clearance and the resulting spill-in and spill-out effects. Altered astrocytic coverage of the presynaptic terminals and/or dendritic spines as well as a reduced size of glutamate transporter clusters at glutamate release sites have been implicated in the pathogenesis of diseases resulting in symptoms of dys-/hyperkinesia. However, the mechanisms leading to the dysfunction of glutamatergic synapses in HD are not well understood. Improving and applying synapse imaging we have obtained data shedding new light on the mechanisms impeding the initiation of movements. Here, we describe the principle elements of a relatively inexpensive approach to achieve single synapse resolution by using the new genetically encoded ultrafast glutamate sensor iGluu, wide-field optics, a scientific CMOS (sCMOS) camera, a 473 nm laser and a laser positioning system to evaluate the state of corticostriatal synapses in acute slices from age appropriate healthy or diseased mice. Glutamate transients were constructed from single or multiple pixels to obtain estimates of i) glutamate release based on the maximal elevation of the glutamate concentration [Glu] next to the active zone and ii) glutamate uptake as reflected in the time constant of decay (TauD) of the perisynaptic [Glu]. Differences in the resting bouton size and contrasting patterns of short-term plasticity served as criteria for the identification of corticostriatal terminals as belonging to the intratelencephalic (IT) or the pyramidal tract (PT) pathway. Using these methods, we discovered that in symptomatic HD mice ~40% of PT-type corticostriatal synapses exhibited insufficient glutamate clearance, suggesting that these synapses might be at risk to excitotoxic damage. The results underline the usefulness of TauD as a biomarker of dysfunctional synapses in Huntington mice with a hypokinetic phenotype.

We present a protocol to evaluate the balance between glutamate release and clearance at single corticostriatal glutamatergic synapses in acute slices from adult mice. This protocol uses the fluorescent sensor iGluu for glutamate detection, a sCMOS camera for signal acquisition and a device for focal laser illumination.