This work was supported in part by grants from NHRI (CS-104-PP-06 to B.L.Y.).

הסכמת המטופל הודיעה כפי שאושרו על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי יש לקבל לשימוש בתאים אנושיים. 1. בידוד צפיפות צבע של תאים ההיקפיים אדם הדם mononuclear (PBMCs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 מיליליטר heparinized כל דם לתוך צינור 50 מיליליטר על ידי פיפטה 25 מיליליטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תאים עם 25 מיליליטר של פוספט שנאגרו מלוח (PBS). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 15 מיליליטר של שיפוע צפיפות Ficoll-Paque לתוך צינור 50 מיליליטר חדש, ותוך הטיית הצינור, מאוד לאט ובזהירות להוסיף 25 מיליליטר בהשעית התא המדולל מעל שיפוע הצפיפות כך שאין ערבוב של כל הדם עם שיפוע הצפיפות, כלומר., אין הפרעה של ממשק שיפוע דם בצפיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה מהצעד 1.2 בז × 400 במשך 30 עד 40 דקות בהרוטור מתנדנד-דלי טמפרטורה מבוקרת ללא בלם ב 20 ° C. שים לב: שלוש שכבות נפרדות צריכה להיות ברורות לאחר צנטריפוגה: הדואר פלזמה יצור שכבה העליונה; השכבה התחתונה ברורה ששיפוע צפיפות Ficoll-Paque; ושכבה דקה, בינונית סלולרית להיות PBMCs </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק את השכבה העליונה על ידי שאיבה עם פיפטה פסטר, בזהירות שלא להפריע את שכבת הביניים של תאי mononuclear (כלומר, לימפוציטים, מונוציטים, וטסיות דם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף בזהירות שכבת תאי mononuclear זה עם פיפטה 10 מיליליטר לצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הצינור עם 20 מיליליטר של PBS, מערבב היטב, וצנטריפוגות ב g × 300 עבור 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant לחלוטין לאחר צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 20 מיליליטר של PBS ו צנטריפוגות ב 200 × גרם במשך 10-15 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant לחלוטין לאחר צנטריפוגה. הערה: צעד זה מסיר את טסיות הדם-שהם לא רצויים-בPBMCs; ניתן לחזור על שלב זה כדי להבטיח הסרת מלאה טסיות הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אין בחירה של אוכלוסיות ספציפיות היארצוי, resuspend תא גלולה במדיום מלא לויקוציטים (10% בסרום שור עוברי (FBS), 1% L- גלוטמין, ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין במדיום RPMI-1640) עבור culturing לאחר ביצוע ספירת תאי 16 להשעות 1 מיליליטר של בינוני לכל 10 7 PBMCs לפני שתמשיך לשלב הבא. </li></ol> 2. תיוג מגנטי של אוכלוסיות יקוציט (דלג לשלב 4 אם אין בחירה של אוכלוסיות ספציפיות נדרש) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשעיה צנטריפוגה PBMC בז × 300 במשך 10 דקות ולשאוב supernatant לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תא הגלול ב 80 μl של PBS לכל 10 7 תאים כולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של חרוזים מגנטיים שצוינו (כלומר, חרוזים מגנטיים CD14 לבידוד של מונוציטים, חרוזים מגנטיים CD4 לבידוד של לימפוציטים מסוג T) לכל 10 7 תאים כולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות ב2 עד 8 מעלות צלזיוס במקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1-2 מיליליטר של PBS לכל 10 7 תאים לשטוף, ו צנטריפוגותבז × 300 במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant לחלוטין וresuspend עד 10 8 תאים ב500 μl של PBS. </li></ol> 3. בחירה מגנטית של אוכלוסיות יקוציט הערה: מגוון רחב של מפרידי חרוז מגנטיים ועמודות זמינים לבידודה של אוכלוסייה הספציפית של לויקוציטים ידי סמן תא שטח ממספר היצרנים. בידוד יכול להיות על ידי בחירה חיובית המבוססת על סמנים אחד או כמה חיוביים או על ידי בחירה שלילית לאחר הדלדול של אוכלוסיות לא רצויות. גישה כללית של ביצוע סלקציה חיובית באמצעות סמן אחד (כלומר, מסוג CD4 לימפוציטים T מסייע, או CD14 למונוציטים) מפורטת להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ומפריד מגנטי ראש כולל טור הפרדה על פי הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל צינור המכיל המדגם של PBMCs שכותרת. לספק שני 15 מיליליטר צינורות צנטריפוגה לאיסוף וסר התווית שכותרתו חיוביתשברים אד תא, הבאים הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאי מספר 15 וresuspend לויקוציטים חיובי שנבחר (כלומר, לימפוציטים מסוג CD4 + T או CD14 + תאים) במדיום מלא לויקוציטים, באמצעות 1 מיליליטר של מדיום לכל 10 7 תאים. </li></ol> 4. CFSE הכתמה של לויקוציטים להערכה של הפצת נשק הערה: CFSE כבר בשימוש נרחב בחקירות חיסוניות, לשניהם in vivo ובניסויים במבחנה. הפרוטוקול שלנו כבר מותאם למחקר במבחנה של MSC / PBMC (או לויקוציטים אחרים) אינטראקציות. בעוד מעורבים בניהול במבחנה תיוג CFSE הצעדים הכלליים דומים, שעשוי להיות הבדלים במינון ובעיתוי הספציפיים של הפרוטוקול 14. זה יכול להיות בגלל מספר הגורמים, כלומר, סוג תא המסוים בשימוש, מספרים סלולריים המשומשים שסביר יכול להשפיע על עוצמת אות ניאון CFSE. <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את פתרון CFSE מניות (10 מ&quot;מ) ב- PBS לריכוז העבודה הרצוי של 10 מיקרומטר (פתרון CFSE-עבודה). הכן 10 7 תאים (כלומר, PBMCs או תאי T) לתיוג עם פתרון CFSE-העבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g × 300 במשך 10 דקות כדי להשיג תא גלולה ולשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בעדינות ב 1 מיליליטר של פתרון מחומם מראש (37 ° C) CFSE-עבודה ודגירת התאים במשך 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשטוף את CFSE העודף, לדלל את ההשעיה התא עם 10x (לפי נפח) של precooled (4 ° C) בינוני RPMI המכיל 10% FBS. משקעי התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות וזורקים supernatant. שטוף את התא גלולה באופן זה עוד פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה-מחדש את התאים על ידי צנטריפוגה וספירת תאי מספר 15. Resuspend 10 7 תאים (או PBMCs או תאי T) במדיום מלא יקוציט prewarmed 1 מיליליטר טרי. </li></ol> 5. עמית תרבות Mמאמנים עם לויקוציטים והפעלה של לויקוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני MSC טרום החם מלא (10% FBS (שנבדק מראש לצמיחה אופטימלית MSC), 1% L- גלוטמין, ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין במדיום גלוקוז DMEM נמוך) עד 37 מעלות צלזיוס במשך לא יותר מ -30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MSCs זרע ב50,000 תאים ב 1 מיליליטר של מדיום מלא MSC בלוחות 24 גם (צפיפות MSC: 25,000 תאים / 2 סנטימטר) לO המצורף / N בחממה 37 ° C, המאפשרים לתאי הגזע כדי להגיע למפגש 80%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני לשאוב, ומבוסס על מספרי MSC זרע, להוסיף PBMCs כותרת CFSE (שכותרתו בבקשה בעבר מתייחס לשלב פרוטוקול 4 לעיל) לתאי גזע בתרבית (שנזרע ביום הקודם בלוחות 24 גם) ב 1 מיליליטר של מדיום מלא לויקוציטים ב 01:10 (יחס תא) יחס שיתוף תרבות של תאי גזע לPBMCs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את phytohemagglutinin mitogen (PHA), activator יקוציט שאינו ספציפי, לריכוז סופי של 10 מיליליטר / ק&quot;ג בנפח כולל של מדיום מלא יקוציט 1 מיליליטר לכל טוב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Alternativאיליי, כדי לעורר להפעלה של לימפוציטים מסוג T במיוחד: להשתמש α-CD3 / 28 microbeads ולהוסיף לשיתוף תרבות שני התאים כדי להשיג יחס הלימפוציטים חרוז לT של 1: 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לביקורת שלילית, צלחת 500,000 PBMCs / טובה (או אוכלוסיית יקוציט מפעיל מסוימת; צפיפות תאים: 250,000 לויקוציטים / 2 סנטימטר) בצלחת 24 גם עם בינוני מלא יקוציט רק 1 מיליליטר; לביקורת חיובית, בנוסף לציפוי אותו המספר של PBMCs / טוב, להוסיף PHA לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב -3 ויום 5 בניסוי שיתוף התרבות, להעריך התפשטות של לויקוציטים כותרת CFSE (ממוקם בצינורות עגולים התחתון) על ידי ניתוח התזרים cytometric 17 עם מסנני 488 עירור ננומטר ופליטה מתאימים להעמסה. הערה: מכתים ציטוקינים תאיים לניתוח התזרים cytometric יכול להתבצע גם לויקוציטים כותרת CFSE אלה בשלב זה להעריך לשינויים בפרופיל ביטוי ציטוקינים יקוציט כמוdulated ידי MSCs. מאז CFSE מוערך עם מסנן מתאים להעמסה, הנוגדנים שנבחרו להעריך ציטוקינים שונים צריכים להיות מצומדת לfluorochromes האחר מאשר העמסה או ספקטרום דומה (כלומר, Phycoerythrin, peridinin מורכב חלבון כלורופיל (PerCP)). </li></ol> 6. וריאציה: מגנטי Assay דיכוי מפעיל חרוזים נבחר, MSC-induced המערכת החיסוני Leukocytes על הופעל תאי מפעיל CD4 + T שכותרת CFSE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MSCs זרע ב250,000 תאים ב 3 מיליליטר של מדיום שלם MSC ב6-גם צלחות (צפיפות MSC: 25,000 תאים / 2 סנטימטר) לO המצורף / N בחממה 37 ° C, המאפשרים לתאי הגזע כדי להגיע למפגש 80%. לפחות 3 6-גם צלחות נחוצות כדי להבטיח PBMCs MSC-cocultured מספיק לבחירה תת-אוכלוסייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני לשאוב, ולהוסיף PBMCs מופרד לפי שלב 1 אבל ב6-גם צלחות על 2.5 x 10 6 תאים / טוב (צפיפות תאים: 250,000 leukocytes / 2 סנטימטר) עם 3 מיליליטר של מדיום מלא לויקוציטים. שיתוף תרבות ל48-72 שעות בחממה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגנטי חרוז-לבחור אוכלוסייה ספציפית של לויקוציטים המושרה MSC המערכת החיסונית (כלומר, CD14 + תאים) לפי סעיפים 2-3. הערות: מכתים ציטוקינים תאיים לניתוח התזרים cytometric יכולות להתבצע בשלב זה להעריך לשינויים בפרופיל ציטוקינים יקוציט ביטוי, כלומר, ביטוי של interleukin-10-כמווסת על ידי MSCs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כותרת CFSE תאי CD4 + T אלוגנאית שנוצרו כאמור בסעיף 2-4 בלוחות 24 גם ב 1 מיליליטר של (צפיפות תאי T: 250,000 תאים / 2 סנטימטר) יקוציט שלמה בינוניים לויקוציטים המושרה MSC-נבחר חרוז ביחסים שונים , כלומר, 01:10, 1: 5, 1: 2, ו- 1: 1 (תא לתא) יחסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעורר תאי CD4 + T, להוסיף α-CD3 / 28 microbeads מצומדות לקבל יחס חרוז אל התא של 1: 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לביקורת שלילית, צלחת 500,000 תאי CD4 + T / גם ב( צפיפות תאי T: 250,000 תאים / 2 סנטימטר) 24 גם צלחת עם בינוני מלא יקוציט רק 1 מיליליטר; לביקורת חיובית, בנוסף לציפוי אותו המספר של תאי CD4 + T / טוב, להוסיף α-CD3 / 28 microbeads מצומדות לקבל יחס חרוז אל התא של 1: 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3 בשיתוף התרבות, להעריך התפשטות של תאי שכותרתו CFSE CD4 + T (ממוקמים בצינורות עגולים התחתון) על ידי ניתוח cytometric זרימה 16 עם מסנני 488 עירור ננומטר ופליטה מתאימים להעמסה. </li></ol>

<ol>
	<li>Friedenstein, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursor+cells+of+mechanocytes.">Precursor cells of mechanocytes.</a> Int Rev Cytol. 47, 327-359 (1976).</li><li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells.">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284, 143-147 (1999).</li><li>Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow+stromal+cells+as+stem+cells+for+nonhematopoietic+tissues.">Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues.</a> Science. 276, 71-74 (1997).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Eng. 7, 211-228 (2001).</li><li>Yen, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+multipotent+cells+from+human+term+placenta.">Isolation of multipotent cells from human term placenta.</a> Stem Cells. 23, 3-9 (2005).</li><li>Erices, A., Conget, P., Minguell, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+progenitor+cells+in+human+umbilical+cord+blood.">Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood.</a> Br J Haematol. 109, 235-242 (2000).</li><li>Bartholomew, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+suppress+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+prolong+skin+graft+survival+in+vivo.">Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo.</a> Exp Hematol. 30, 42-48 (2002).</li><li>Chang, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placenta-derived+multipotent+cells+exhibit+immunosuppressive+properties+that+are+enhanced+in+the+presence+of+interferon-gamma.">Placenta-derived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-gamma.</a> Stem Cells. 24, 2466-2477 (2006).</li><li>Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+in+health+and+disease.">Mesenchymal stem cells in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 8, 726-736 (2008).</li><li>Chen, P. M., Yen, M. L., Liu, K. J., Sytwu, H. K., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+properties+of+human+adult+and+fetal+multipotent+mesenchymal+stem+cells.">Immunomodulatory properties of human adult and fetal multipotent mesenchymal stem cells.</a> J Biomed Sci. 18, 49-59 (2011).</li><li>Muul, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+proliferative+responses+of+cultured+lymphocytes.">Measurement of proliferative responses of cultured lymphocytes.</a> Curr Protoc Immunol. , (2011).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li><li>Chen, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+immunomodulatory+monocytes+by+human+mesenchymal+stem+cell-derived+hepatocyte+growth+factor+through+ERK1/2.">Induction of immunomodulatory monocytes by human mesenchymal stem cell-derived hepatocyte growth factor through ERK1/2.</a> J Leukoc Biol. 96, 295-303 (2014).</li><li>Oughton, J. A., Kerkvliet, N. I., Costa, L. G., Davila, J. C., Lawrence, D. A., Reed, D. J., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UNIT+18.8+Immune+cell+phenotyping+using+flow+cytometry.">UNIT 18.8 Immune cell phenotyping using flow cytometry.</a> Curr Protoc Toxicol. , 18.8.1-18.8.24 (2005).</li><li>Phelan, M. C., Lawler, G., Robinson, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APPENDIX+3A+Cell+counting.">APPENDIX 3A Cell counting.</a> Curr Protoc Cytom. , A.3A.1-A.3A.4 (2001).</li><li>Gebler, A., Zabel, O., Seliger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunomodulatory+capacity+of+mesenchymal+stem+cells.">The immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells.</a> Trends Mol Med. 18, 128-134 (2012).</li><li>Le Blanc, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+treatment+of+steroid-resistant,+severe,+acute+graft-versus-host+disease:+a+phase+II+study.">Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study.</a> Lancet. 371, 1579-1586 (2008).</li><li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+therapy+with+autologous+mesenchymal+stem+cells+in+living-related+kidney+transplants:+a+randomized+controlled+trial.">Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial.</a> JAMA. 307, 1169-1177 (2012).</li><li>Le Blanc, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+inhibit+and+stimulate+mixed+lymphocyte+cultures+and+mitogenic+responses+independently+of+the+major+histocompatibility+complex.">Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex.</a> Scand J Immunol. 57, 11-20 (2003).</li><li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+in+vitro+impairs+the+immunosuppressive+activity+of+mesenchymal+stem+cells+on+T+cells.">Long-term culture in vitro impairs the immunosuppressive activity of mesenchymal stem cells on T cells.</a> Mol Med Rep. 6, 1183-1189 (2012).</li><li>Moll, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+display+impaired+immunomodulatory+and+therapeutic+properties?.">Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties?.</a> Stem Cells. 32, 2430-2442 (2012).</li><li>Ho, P. J., Yen, M. L., Tang, B. C., Chen, C. T., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2O2+accumulation+mediates+differentiation+capacity+alteration,+but+not+proliferative+decline,+in+senescent+human+fetal+mesenchymal+stem+cells.">H2O2 accumulation mediates differentiation capacity alteration, but not proliferative decline, in senescent human fetal mesenchymal stem cells.</a> Antioxid Redox Signal. 18, 1895-1905 (2013).</li></ol>

We have nothing to disclose.

Increasingly, the immunomodulatory properties of MSCs are being translated into clinical use more rapidly than the multilineage capacity of these stem cells18-20. Thus, co-culture techniques of MSCs with leukocytes and assays to evaluate immune function are important to further delineate the specific mechanisms involved in these properties for optimizing effective therapeutic application. 
One of the most critical technical aspects for success in these assays is having adequate PBMC...

תאים אנושיים גזע mesenchymal (MSCs) הם אבות גופניים שיכול להתמיין שושלות mesodermal הפרקסיאלית של עצם, סחוס, ורקמת שומן 1-4, כמו גם לכמה שושלות extramesodermal 5. בודד לראשונה ממח העצם המבוגר, אבות multilineage אלה עכשיו נמצאו במספר רב של רקמות 6-8 ו, באופן בלתי צפוי, הראה את תכונות המערכת החיסונית חזקות שמופיעות נוח מאוד ליישום קליני 9-12. מנגנונים מפורטים המעורבים בהשפעות המערכת החיסונית באופן פעיל נחקרים על יישום יעיל בגופים מחלה ספציפיים. אחת הדרכים פשוטות ביותר להערכת תפקוד מערכת חיסון הוא על ידי הערכה לדיכוי התפשטות יקוציט מפעיל 13. רוב לויקוציטים מפעיל כגון לימפוציטים מסוג T ומונוציטים להתרבות להפליא כאשר מגורה או הופעל. פונקצית המערכת החיסונית ניתן להעריך מתי דיכויעדות לכך היא התפשטות. באופן מסורתי, התפשטות יקוציט מפעיל הוערכה על ידי איתור של [3 H] התאגדות thymidine לתוך ה- DNA. עם זאת, בשיטה זו יש חסרונות משמעותיים עקב החששות של קרינה ורשות דואר לשימוש, כמו גם הציוד המורכב דרוש. אמנם יש מבחני לא רדיואקטיבי להעריך התפשטות תאים, יש assay succinimidyl אסתר carboxyfluorescein (CFSE) יתרונות אחרים כגון המאפשר זיהוי של אוכלוסיות סלולריות ספציפיות, שהוא שימושי במיוחד בניסויי שיתוף התרבות מעורבים סוגי תאים מרובים. CFSE הוא צבע סלולארי ניאון שניתן להעריך על ידי ניתוח התזרים cytometric. כתאים מתחלקים, עוצמת תווית סלולרית זה היא ירד באופן יחסי; זה לא רק מאפשר קביעת התפשטות תאים כוללת, אלא גם מאפשר להערכה על מספר חלוקות תא עד 8 חטיבות לפני הקרינה הופכת להיות קשה Detect נגד אות רקע. יתר על כן, יציבות CFSE הניאון מאפשרת מעקב in vivo של תאים שכותרתו כך שניתן דמיינו את תאים לחודשים רבים 14. assay זה יכול גם להיות מגוון כדי להעריך סוגים מסוימים של כדוריות דם לבנות מפעיל או פונקצית המערכת החיסונית של אוכלוסיות ספציפיות של MSC-induced לויקוציטים-כגון המערכת החיסונית כinterleukin-10 (IL-10) בהפקת CD14 + מונוציטים 15 על ידי ביצוע בחירת סמן משטח מגנטי חרוז של אוכלוסיות תאים של עניין לפני או אחרי שיתוף תרבות כמתאים. הפרוטוקול שלנו מתאר את assay הבסיסי של הערכת השפעות המערכת החיסונית של תאי גזע בלויקוציטים מפעיל (תרשים זרימה שמוצג באיור 1) ווריאציה על assay הבסיסי זה להערכת תפקוד מערכת חיסון יקוציט מושרה MSC בלימפוציטים מסוג T מסוג CD4 + מפעיל אלוגנאית (מוצג תרשים זרימה באיור 4).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1205">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:276px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td style="width:259px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">71-7167-00 AG</td>
			<td style="width:549px;">Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE)</td>
			<td style="width:259px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">V12883</td>
			<td>Cellular label for detection of cell division</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:276px;">Phytoagglutinin (PHA)</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td>L8902</td>
			<td>Activation of human PBMCs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Dynabeads Human T-Activator CD3/28</td>
			<td style="width:259px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">111.32D</td>
			<td style="width:549px;">Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells,etc.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">autoMACS&#8482; Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:121px;">autoMACS&#8482; Separator</td>
			<td>Magnetic based cell separator</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">autoMACS&#174; Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-021-101</td>
			<td>separation columns</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:276px;">CD14 microbeads, human&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td style="width:549px;">For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:276px;">CD4 microbeads, human&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:121px;">130-045-101</td>
			<td style="width:549px;">For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:276px;">RPMI 1640 Medium</td>
			<td style="width:259px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">11875</td>
			<td>Human PBMC/leukocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:276px;">DMEM, Low glucose, pyruvate</td>
			<td style="width:259px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">11885</td>
			<td style="width:549px;">Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:276px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:259px;">Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Supplementation for MSC complete medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:276px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:259px;">Life Technologies</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:276px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:259px;">1) Hyclone, for MSC culture&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations)</td>
			<td style="width:121px;">1) SH30070.03M 2) 10091-148</td>
			<td>Pre-test lots for support of MSC in vitro culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:276px;">24-well cell culture plate</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td>COR3524</td>
			<td>Co-culture plate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:276px;">50 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:121px;">430291</td>
			<td>Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:276px;">15 mL centrifuge tube&#160;</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:121px;">430766</td>
			<td>Collection of the labeled and unlabeled cell fractions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Round-bottom tubes</td>
			<td style="width:259px;">BD Falcon&#160;</td>
			<td style="width:121px;">352008</td>
			<td>Collection of cells for flow cytometric analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the immunomodulatory properties of human mesenchymal stem cells (mscs)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.

איור 1 מציין את הסכימה הכוללת של הניסוי, ואיור 2 מדגים את המראה של תנאי תרבית תאים השונים כמו דמיינו ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד הפוך. MSCs הם תאים חסיד עם fibroblastic, מורפולוגיה דמוית כישור, ואילו PBMCs ולויקוציטים הם תאים שאינם חסיד עגולים קטנים. שני סוגי התאים שונים מורפ?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs at JoVE.com

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

תכונות המערכת החיסונית של תאים האנושיים mesenchymal גזע (MSC) מופיעות רלוונטיות יותר ויותר ליישום קליני. באמצעות מערכת שיתוף התרבות של תאי גזע ולויקוציטים דם ההיקפי מראש צבעונית עם succinimidyl אסתר carboxyfluorescein צבע הניאון (CFSE), אנו מתארים את ההערכה במבחנה של תפקוד מערכת חיסון MSC על התפשטות יקוציט מפעיל ותת-אוכלוסיות ספציפיות.

הערכה של מאפייני המערכת החיסוניים של תאי גזע mesenchymal האדם (MSCs)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

assessment-immunomodulatory-properties-human-mesenchymal-stem-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

12.1K Views.  National Health Research Institutes (NHRI).  תכונות המערכת החיסונית של תאים האנושיים mesenchymal גזע (MSC) מופיעות רלוונטיות יותר ויותר ליישום קליני. באמצעות מערכת שיתוף התרבות של תאי גזע ולויקוציטים דם ההיקפי מראש צבעונית עם succinimidyl אסתר carboxyfluorescein צבע הניאון (CFSE), אנו מתארים את ההערכה במב?...

Video: Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

הרחבה, טיהור, והערכה תפקודית של האדם תאים דם היקפיים NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true quantitative analysis of cellular inflammation. Flow cytometry is a quick alternative method to quantify immune cells in the injured brain or spinal cord tissue. Historically, flow cytometry has been used to quantify immune cells collected from blood or dissociated spleen or thymus, and only a few studies have attempted to quantify immune cells in the injured spinal cord by flow cytometry using fresh dissociated cord tissue. However, the dissociated spinal cord tissue is concentrated with myelin debris that can be mistaken for cells and reduce cell count reliability obtained by the flow cytometer. We have advanced a cell preparation method using the OptiPrep gradient system to effectively separate lipid/myelin debris from cells, providing sensitive and reliable quantifications of cellular inflammation in the injured spinal cord by flow cytometry. As described in our recent study (Beck &amp; Nguyen et al., Brain. 2010 Feb; 133 (Pt 2): 433-47), the OptiPrep cell preparation had increased sensitivity to detect cellular inflammation in the injured spinal cord, with counts of specific cell types correlating with injury severity. Critically, novel usage of this method provided the first characterization of acute and chronic cellular inflammation after SCI to include a complete time course for polymorphonuclear leukocytes (PMNs, neutrophils), macrophages/microglia, and T-cells over a period ranging from 2 hours to 180 days post-injury (dpi), identifying a surprising novel second phase of cellular inflammation. Thorough characterization of cellular inflammation using this method may provide a better understanding of neuroinflammation in the injured CNS, and reveal an important multiphasic component of neuroinflammation that may be critical for the design and implementation of rational therapeutic treatment strategies, including both cell-based and pharmacological interventions for SCI.

Quantification of cellular inflammation in the injured/pathological CNS by flow cytometry is complicated by lipid/myelin debris that can have similar size and granulation to cells, decreasing sensitivity/accuracy. We have advanced a cell preparation method to remove myelin debris and improve cell detection by flow cytometry in the injured spinal cord.

הערכה כמותית של תאים חיסוניים רקמות חוט השדרה נפגע על ידי זרימת cytometry: השתמש חדשנית שיטת טיהור Cell

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, transmission of antibiotic resistant bacteria between animals and humans, and the high cost of treating infections.
In this study, we disclose a new strategy that may be effective in preventing implant-associated infection based on the potential antimicrobial properties of platelet-rich plasma (PRP). Due to its well-studied properties for promoting healing, PRP (a biological product) has been increasingly used for clinical applications including orthopaedic surgeries, periodontal and oral surgeries, maxillofacial surgeries, plastic surgeries, sports medicine, etc.
PRP could be an advanced alternative to conventional antibiotic treatments in preventing implant-associated infections. The use of PRP may be advantageous compared to conventional antibiotic treatments since PRP is less likely to induce antibiotic resistance and PRP's antimicrobial and healing-promoting properties may have a synergistic effect on infection prevention. It is well known that pathogens and human cells are racing for implant surfaces, and PRP's properties of promoting healing could improve human cell attachment thereby reducing the odds for infection. In addition, PRP is inherently biocompatible, and safe and free from the risk of transmissible diseases.
For our study, we have selected several clinical bacterial strains that are commonly found in orthopaedic infections and examined whether PRP has in vitro antimicrobial properties against these bacteria. We have prepared PRP using a twice centrifugation approach which allows the same platelet concentration to be obtained for all samples. We have achieved consistent antimicrobial findings and found that PRP has strong in vitro antimicrobial properties against bacteria like methicillin-sensitive and methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Group A Streptococcus, and Neisseria gonorrhoeae. Therefore, the use of PRP may have the potential to prevent infection and to reduce the need for costly post-operative treatment of implant-associated infections.

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

Implant-associated infection is a significant clinical complication. This study describes an approach using platelet-rich plasma (PRP) to prevent implant-associated infections, presents the protocol for preparing PRP with constant platelet concentration, and reports the newly identified antimicrobial properties of PRP and related protocols for examining such antimicrobial properties in vitro.

PRP כגישה חדשה למניעת זיהום: הכנה ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מאפיינים מיקרוביאלית של PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

פיתוח תאי גזע שמקורם אנטיגן ספציפי תקינים בתאי T נגד אוטואימוניות

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

לתוספי משפר את היעילות התמרה חושית Lentiviral של תאי NK העיקרי מאתר ואנושי

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode larvae of the genus Trichinella. The most important sources of human infections worldwide are game meat and pork or pork products. In many countries, the prevention of human trichinellosis is based on the identification of infected animals by means of the artificial digestion of muscle samples from susceptible animal carcasses.
There are several methods based on the digestion of meat but the magnetic stirrer method is considered the gold standard. This method allows the detection of Trichinella larvae by microscopy after the enzymatic digestion of muscle samples and subsequent filtration and sedimentation steps. Although this method does not require special and expensive equipment, internal controls cannot be used. Therefore, stringent quality management should be applied throughout the test. The aim of the present work is to provide detailed handling instructions and critical control points of the method to analysts, based on the experience of the European Union Reference Laboratory for Parasites and the National Reference Laboratory of Germany for Trichinella.

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

The prevention of human trichinellosis in many countries worldwide is based on the laboratory examination of muscle samples from susceptible animals by methods of digestion, of which the magnetic stirrer method is considered the gold standard.

סטירר שיטה מגנטית לצורך זיהוי של<em&gt; Trichinella</em&gt; זחלים בדגימות שריר

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

וזמינותו Cytotoxicity מבוססי Cytometry זרימה להערכה של פעילות תאי NK אנושי

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

הערכת ציטוטוקסיות ואפקטים Immunomodulatory של חומרים אמבריולוגיה דיוק-לחתוך פרוסות

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

הערכה של הממשק סינפטית של תאי T האנושי העיקרי של דם היקפיים ורקמות הלימפה

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where immune cells reside and therefore contribute to mucosal immunity in the intestine. A complete understanding of how M cells differentiate in the intestine as well as the molecular mechanisms of antigen uptake by M cells is lacking. This is because M cells are a rare population of cells in the intestine and because in vitro models for M cells are not robust. The discovery of a self-renewing stem cell culture system of the intestine, termed enteroids, has provided new possibilities for culturing M cells. Enteroids are advantageous over standard cultured cell lines because they can be differentiated into several major cell types found in the intestine, including goblet cells, Paneth cells, enteroendocrine cells and enterocytes. The cytokine RANKL is essential in M cell development, and addition of RANKL and TNF-&#945; to culture media promotes a subset of cells from ileal enteroids to differentiate into M cells. The following protocol describes a method for the differentiation of M cells in a transwell epithelial polarized monolayer system of the intestine using human ileal enteroids. This method can be applied to the study of M cell development and function.

This protocol describes how to induce the differentiation of M cells in human stem cell-derived ileal monolayers and methods to assess their development.

המושרה בידול של תאים כמו תא בתאי גזע האדם-הנגזר הנגזרת מונאואיד Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...