Name: culturing human pluripotent and neural stem cells in an enclosed cell culture system for basic and preclinical research
Uploaded: 2016-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לצוות Biospherix על עזרתם ללמוד להשתמש במערכת תרבית תאים סגורים Xvivo, במיוחד מאט פרימן; צוות של חברת בניית Miles &amp; קלי, Inc עבור עבודתם בהקמת תשתית המעבדה, במיוחד ראס יוז; הצוות של בית החולים לילדים של מחלקת אורנג &#39;קאונטי של מתקנים ושירותים תמיכה עבור עבודתם בתיאום לשפץ מעבדה, במיוחד אדם Lukhard ודווין Hugie; הצוות של בית החולים לילדים של מחלקת Orange County של מערכות מידע על עזרתם בהקמת התשתית לניהול נתונים וגישה מרחוק, במיוחד וייט טראן; בית החולים של צוות הניהול הבכיר של מחוז אורנג &#39;של ילדים לתמיכה ארוכת השנים שלהם של הפרויקט, במיוחד ד&quot;ר מריה Minon וברנט Dethlefs. עבודה זו מומנה על ידי בית החולים לילדים של מחוז אורנג &#39;המכון בקליפורניה הרגנרציה רפואהדואר דרך TR3-05476 מענק PHS. כל המחברים תרמו באופן שווה על עבודה זו.

<ol>
	<li>Brick, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Autism+Spectrum+Disorders+Stem+Cell+Resource+at+Children's+Hospital+of+Orange+County:+Implications+for+Disease+Modeling+and+Drug+Discovery.">The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery.</a> Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).</li><li>Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+by+lentiviral+transduction.">Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction.</a> Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).</li><li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+HIF1alpha+repress+the+differentiative+effects+of+BMPs+in+high-grade+glioma.">Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma.</a> Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).</li><li>Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+controls+the+expansion+of+human+CNS+precursors+and+the+generation+of+astrocytes+and+oligodendrocytes.">Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes.</a> Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).</li><li>Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+non-viable+airborne+particles+correlates+with+airborne+colonies+and+represents+an+acceptable+surrogate+for+daily+assessment+of+cell-processing+cleanroom+performance.">Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance.</a> Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).</li><li>Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+stem+cell+therapies+for+neurological+diseases.">The potential of stem cell therapies for neurological diseases.</a> Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapies+for+the+lysosomal+storage+diseases+-+the+quintessential+neurodegenerative+diseases.">Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases.</a> Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture.">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).</li><li>Stover, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process-based+expansion+and+neural+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+for+transplantation+and+disease+modeling.">Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling.</a> J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).</li><li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging.">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).</li><li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

תאים שגודלו בתוך ע.מ. רואים שום שינויים בריכוזים דו חמצן או פחמן, כאשר הם עוברים מן החממה כדי עיבוד בתא עד מיקרוסקופ חדר ובחזרה. זה קריטי, כי תנאים בתא אחד מותאמים בחממה המסוימת שבה התאים נשמרים לפני התאים יוסרו מן החממה. האווירה בתוך המנגנון היא ברציפות HEPA-מסוננת ניתן להתאמה אישית בכל נוגע ריכוזי דו תחמוצת חמצן ופחמן. תאים ניתן לגדל בריכוזי תקן PSCs או NSCs, 5% ו -9%, בהתאמה; או ניתן לבחור ריכוזים חלופיים תאים מסוגים שונים או עבור ניסויים ספציפיים. לפיכך, המנגנון מסופק עם מקורות מתמידים של חמצן כיתה רפואית, פחמן דו חמצני, חנקן (איור 4). כל שלושה גזים אלה מסופקים על ידי מערכות סעפת ספציפית-גז המבטיחות אספקה ​​מתמדת. המנגנון מסופק גם עם תערובת גז כיול מורכבת10% (± 0.01%) פחמן דו חמצני לחמצן. מערכות סעפת שוכנות מחוץ למתקן ייצור תאים והגזים נשמעים ברקע לתוך המתקן דרך התקרה. גז הכיול שוכן בתוך המתקן. המנגנון מסופק גם עם ואקום הבית, גם דרך התקרה. באמצעות מערכת ניטור אלקטרונית ואלחוטי יחידות שליחה, לחצי הפלט של כל הסעפות מנוטרים באופן קבוע. במקרה שכל לחץ נופל מחוץ לטווח, מפעילי מתקן ייצור תאים הם טלפנו באופן אוטומטי הודעה כזו פעולה מתאימה ניתן לקחת. דרישות הכח של המנגנון שלו ממומנות על ידי שישה 120 ייעודי V מעגלים יורדים מהתקרה ומחוברות מחוללי הגיבוי של בית החולים על מנת להבטיח אספקה ​​קבועה. מבצע של המנגנון נשלט באמצעות תוכנה במחשב PC המבוסס מופעל באמצעות אספקת חשמל פסק. הסדרי כוח ומחשב אלהלהבטיח כי פונקציות המערכת ברציפות גם במקרה של כשל במערכת חשמל ציבורי. תוכנת השליטה במנגנון בעלת ממשק גרפי ידידותי למשתמש (איור 1) אשר מאפשר השליטה הריכוזית דו תחמוצת חמצן והפחם וכן טמפרטורה, לחות, ולחצים קאמריים. הערכים של כל הפרמטרים הללו נרשמים באופן רציף על מנת ליצור רשום מצטבר של כל פרמטרי המנגנון. נתונים אלה מגובים על גבי שרת מרוחק מדי לילה כדי להגן על שלמותם. המחשב והתוכנות ניתן לגשת מרחוק על ידי משתמשים מנהליים להעריך ו / או לשנות כל פרמטר. בנוסף, המחשב ותוכנות ניתן לגשת מרחוק, המאפשרים הערכה אינטראקטיבית של פרמטרי מנגנון ופתרון בעיות עם משתמשים מקומיים. יחידת שליחת אזעקה נוספת מחובר למנגנון כזה מפעילי מתקן ייצור תאים מקבלים הודעה על כל out-of-טווח במצב של המנגנון. ג הגישה מרחוקapabilities לאפשר להתחבר והעריך את הפרטים של המצב מחוץ לטווח. המנגנון נועד כמערכת מודולרית הן מאקרו ותחושה מיקרו. מודולים תרבית תאים בודדים, כגון חממות ותאי עיבוד, יכול להיות מותאם אישית בכל הנוגע לממדים ודרישתם וכן בפריסה שלהם ביחס לזה. בנוסף, מרבית הפונקציות השליטות על מודולים הבודדים הם עצמם כאלה מודולרי בוקר גז האטמוספרי פרט, למשל, עשויים להיות מוחלפים בקלות ללא הפרעה משמעותית למערכת. תאי עיבוד מיוחדים, כגון אחד עבור להדמיה מיקרוסקופית ומניפולציה של תרביות תאים, ניתנים להתאמה בקלות למערכת. שני השלב בניגוד מיקרוסקופ פלואורסצנטי הם בתוך המערכת (איור 6), כך תאים יכולים להיות מוכתם חי, ומושבות יכולות להיות גזורות באותם תנאים אטמוספריים כמו בתוך tהוא אינקובטורים. ניתוב של כבלים דרך grommets חתום הקירות הצדדיים של חדר העיבוד מאפשר ציוד כגון ספקי כוח ומחשבים להישמר מחוץ המנגנון, בדרך כלל על עגלה (איור 6). לתאי העיבוד במתקן ייצור תאים יש דפוס זרימת אוויר שונה מאשר BSCs הקונבנציונלי. בשנת BSCs הקונבנציונלי, זרימת אוויר זורם במורד מתוך פורקן פליטה מרכזי מתפצלת לשני זרמים נפרדים, אשר נלקחים מכן על ידי שני פתחי צריכה שונים בחלק קדימה ומאחור של הרצפה של הארון. לעומת זאת, ע.מ. יש פורקן יחיד בחלק הקדמי של התקרה. האוויר זורם כלפי מטה לכיוון החלק האחורי של החדר, שם הוא נמשך מכן כלפי מעלה לתוך פורקן צריך. למרות ע.מ. הוא מטבעו מאוד נקי, דפוס זרימת אוויר ייחודי זה אומר טכנאים צריכים להתאים את הטכניקה שלהם מעט כדי להפחית את הסיכון לזיהום. כמו עם BSC מקובלת, עובד במעבדהhould להימנע מלהציב את ידיהם נגד זרם של צלחות תרבית תאים פתוחות ובקבוקי תקשורת. עם זאת, כיוון שהוא הזרם השתנה ב ע.מ. המעבדה מתקן ייצור התאים עצמו הוא סטנדרטי למדי ו מגיע מאובזר עם מקפיא -20 ° C, -80 ° C במקפיא, מקרר 4 ° C., בצנטריפוגה, ואמבט מים. המעבדה גם יש כיור עם דוושות מבצע דיבורית נוח. על מנת במעבדה הזאת להפוך למתקן ייצור תאים קליני תפקודי, אולם מספר שינויים נוספים עדיין חייבות להתבצע. ראשית, המנגנון עצמו יש לשדרג כדי לקבל את היכולת לפקח על תרכובות אורגניות נדיפות, חלקיקים, וריכוזים של דו תחמוצת כלור המשמש טיהור. שנית, תא עיבוד המכיל מכונה FACS ניתן שוכן ומחובר שאר המנגנון באמצעות מודול חיץ. זה יאפשר מיון תא וטיהור trאוכלוסיות תאי ansplantable בתנאים הסביבתיים המתאימים. לבסוף, המנגנון כולו צריך להיות שוכן בתוך חדר נקי חומה רכה. זה מספק ארגון התקינה הבינלאומי הסביבה (ISO) בכיתה 8 למנגנון 5. על סטריליות הגבוהה וטבע מבוקרת מחשב של ע.מ. עושים את זה מערכת אידיאלית עבור יישומים עתידיים עם טיפול מבוסס תאים ותהליכי ייצור נאותים. הסיכון של זיהום היא מיתנה מאוד, אבל יותר חשוב, את התנאים של הרחבת התא נרשמות באופן אוטומטי לארכיון על ידי מערכת המחשב. סטיות בריכוזי גז, טמפרטורה, לחות, וכל אירועי גישה למערכת מתועדות בקפדנות. זה יכול לעזור מאוד כאשר חוקר בעיות איכות המוצר. עם זאת, ישנם עדיין מגבלות. השימוש של כל וכל ריאגנטים ואספקה ​​(למשל, רכיבי תקשורת, טפטפות, צלחות) חייב להיות מתועד בנפרד. לְהוֹסִיףitionally, יש שפע של בעיות פוטנציאליות (כולל צורות רבות של טעות אנושה) שיכול להתעורר אשר אינם קשורים זה לזה לחלוטין כדי המשתנים מתועד על ידי מערכת הניטור של CPF. לפיכך, את הצורך צוות מקצועי מהשורה הראשונה ותיעוד מדריך מפורט של משימות נשאר במקום.

Standard stem cell culture techniques suffer from several environmental constraints that place undue stresses on the cells and expose the cells to unacceptable risks of contamination. Among the stresses that cells may endure under standard cell culture conditions are precipitous changes in the levels of carbon dioxide and oxygen concentrations3,4. This occurs when the cells are moved from the incubator to the biosafety cabinet and/or microscope which may not be optimal for the cells. Previous studies have confirmed the advantages of culturing both pluripotent and neural stem cells in hypoxic conditions4,11, and for best results, these conditions need to be continuous. Moreover, risks of cellular contamination are higher as the laboratory environment and personnel impinge upon the cells at almost every step of their culture and manipulation. Traditional clean rooms comprise one effective method to greatly decrease contamination risks but they are expensive, have a large footprint and fail to address stressors related to carbon dioxide and oxygen concentrations. 
A cell production facility that can address both contamination risks and gas concentrations and that can be qualified to meet cGMP criteria9 provides high quality cells for basic science research as well as clinical applications1,6,7. Such a cell production facility consists, at a minimum, of the following components: a process chamber, which acts as a heated workspace for the feeding and manipulation of cell cultures; a laminar flow hood, for the initial sterilization of reagents, tubes, and tools; two buffering airlock chambers in between the hood and the process chamber; two cell culture incubators accessible from the process chamber; a microscope chamber adjacent to the process chamber; and finally, computer software to set and monitor the conditions within these modules. Using this basic infrastructure, a wide variety of tasks can be performed, such as standard feeding and passaging of pluripotent stem cells and multipotent neural stem cells, as well as more specialized methods like Sendai virus-based reprogramming, in vitro migration studies, and differentiation of neural stem cells for electrophysiological characterization.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;i&gt;Xvivo System&lt;/i&gt;</td><td>Biospherix</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>&lt;i&gt;Xvivo&lt;/i&gt; Software</td><td>Biospherix</td><td>version i.o.2.1.2.1</td><td></td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Manifold</td><td>Amico</td><td>P-M2H-C3-S-U-OXY</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Manifold</td><td>Amico</td><td>M2H-C3-D-U-CO2</td><td></td></tr><tr><td>N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Manifold</td><td>Western Innovator</td><td>CTM75-7-2-2-BM</td><td></td></tr><tr><td>Microscope with DP21 camera and fluorescence</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>StemPro hESC Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>A100006-01</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Sodium</td><td>Hyclone</td><td>9236</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor 2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AFL233</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Protide</td><td>PP1130</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s-based Cell dissociation Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>Oct-3/4 Antibody</td><td>Millipore</td><td>AB3209</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4260</td><td></td></tr><tr><td>SSEA4 Antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>BIT-9500 Serum Supplement</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Consumable Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml Serological pipet</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Serological pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-102</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Serological pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Serological pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-106</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Serological pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-107</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>T25 flask</td><td>TPP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T-75 flask</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;l pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>22491130</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>22491148</td><td></td></tr><tr><td>1,000 pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>22491156</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Scientific</td><td>5000.102</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>BDH</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Sanimaster 4</td><td>Ecolab</td><td>65332960</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>A714239</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing human pluripotent and neural stem cells in an enclosed cell culture system for basic and preclinical research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

כתב יד זה מתאר בפירוט מתקן ייצור תאים, ואת ההיבטים הייחודיים של תאי culturing בתוך מערכת סגורה. חלק הארי של מתקן ייצור תאים כולל מנגנון תרבות מחוייט, סגור, תא שבו יש טביעת רגל קטנה והוא יכול להיות מאוחסן בקלות בתוך 6 x 7.5 מ &#39;2 חדרים (איור 2). באותו זמן לא הוא התאים בתוך המנגנון חשוף אנשי מעבדה או סביבה. המנגנון מורכב של מספר מודולים: תא תהליך, במנדף זרימה למינרית, 2 תאי airlock חציצה בין מכסה המנוע ואת תא התהליך, שתי חממות תרבית תאים, וחדר מיקרוסקופ סמוך לתא התהליך (איור 3). המערכת נשלטת על ידי תוכנה המאפשרת משתנים סביבתיים להיות מבוקר תחת פיקוח (איור 1). המחשב פועל תוכנה זו היא על-פסק. גזים מוזנים לתוך המערכת דואר על ידי קבוצה של סעפות עבור חמצן, חנקן ופחמן דו חמצני (איור 4). גזים עבור ההתקן מסופקים על ידי מערכות סעפת שיש שתי קבוצות של טנקים כל - סט פעיל ומערכת מילואים. כאשר הערכה הפעילה מופנה כלפי מטה, הסעפת עוברת אוטומטית המילואים להגדיר וצוות הטנקים החלופיים. הכוח נמצא על מערכת גנרטור גיבוי. פלוריפוטנטיים ותאי גזע עצביים ניתן לגדל בתנאי חוסר חמצן במתקן זה באמצעות הפרוטוקולים שפותחו בעבר 9, עם סיבוכים הוסיף אינהרנטי ציוד הרומן. תאי גזע פלוריפוטנטיים ניתן לגזור באמצעות וירוס סנדאי, באמצעות נוגדנים ספציפיים pluripotency לזהות מושבות טרנספקציה מלאה, אשר מבודדות אז והרחיבו. (איור 5 א &#39;וב&#39;), מ iPSCs אלה, תאים ונוירונים גזע עצביים ניתן לגזור באמצעות עיכוב הסמאד כפול, ואת הפנוטיפ שלהם אומת usi<html> ng נוגדנים המל&quot;ל ספציפיים (איור 5 ג ו-ד). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig1.jpg" /> איור 1. ממשק גרפי את הייצור במתקן הנייד. (א) הייצוג הגרפי של ע.מ. הוא למסך ברירת המחדל ותואם את ציור CAD שמוצג באיור 3. לחיצה על העכבר מעל 1 מודול החוצץ (2F באיור 1) נפתח מסך שליטתה (B) שבו O 2 ערכים מוגדרים כדי להתאים את תא עיבוד (3 באיור 3). באופן דומה, לחיצה על התהליך קאמרי או חממת 1 מעלה מסכי הבקרה שלהם (C ו- D, בהתאמה), שבה ערכים עשויים להשתנות או פיקוח על פי צורך.<html> r קבל = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig2.jpg" /> איור 2. מתקן ייצור תאים. (א) המערכת כפי שניתן לראות מנקודת מבט ימני קדמי. הערה את חיבורי החשמל והגז בתקרה והעגלה עם אביזרים מיקרוסקופ והמחשב ימינה. (ב) מכסה המנוע זרימה למינרית עם דלתות גישה מודולים חיץ לראות בצד ימין. (C) תא התהליך עם שתי חממות (דלתות שחורות) לראות בחלק האחורי. (ד) מבט דרך הצד הימני של המערכת מראה את המיקרוסקופ ולנטר עם הדלתות לתאי החיץ נראים מרחוק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> t &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig3.jpg" /> איור 3. CAD שרטוט של מתקן ייצור תאים. כל הפריטים הזנת המכשיר נמחקים למטה הראשון עם אלכוהול ואוויר מיובש למכסה המנוע זרימה למינרית (1). פריטים מכן יועברו אל האווירה המתאימה במודול החיץ מול (2F) בטרם עבר לתוך מודול UCPC, או תהליך קאמרי (3). הם תאים בתרבית בתוך שתי החממות (4, 5). מכתים תא חי, מושבת קטיף, הערכת מורפולוגיה תאית כללית וניתוח הגירה מתרחשת במודול UPC, או לשכת מיקרוסקופ (6). לבסוף, פסולת יוצאת המערכת באמצעות מודול החיץ האחורי (2R). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> &lt;<html> / P&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig4.jpg" /> מקורות איור 4. גזי הכח. (א) סעפת 2 CO היא התקנה 4 x 4 כפי שהיא מספקת את כל החממות של המעבדה. (ב) סעפת O 2 היא התקנת 2 x 2 ואספקה ​​למתקן ייצור תאים בלבד. חנקן למערכת נוצרת מאדה (C, ממש מתחת שלט היציאה) מחוברת סעפת חנקן נוזלי (ימינה) כי גם ממלא באופן אוטומטי cryofreezers (למטה משמאל). הסעפת היא התקנה 2 x 2 להיות מסופקת על ידי שני זוגות של טנקי חנקן נוזל 160 L. CO 2, O 2, ו- N 2 מסופקים מהתקרה דרך shutoffs (D). ואקום בית מסופק גם במיקום זה. נראה ממש מאחורי shutoffs גז אספקה ​​הם זוג כבלי חשמל המספקים חשמל למערכת.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig5.jpg" /> איור 5. תאים פלוריפוטנטיים גזע שמקורם ב היפוקסיה בווירוס סנדאי. (א) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (המינוח נמצא סטובר et al. 9), לעומת שלב 10X. (ב) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs חי מוכתם AF-594 שכותרתו Tra-1-60, 1: 100 דילול בתקשורת. כל iPSCs היו transduced במתקן הייצור תא 5% O 2 עם וירוס סנדאי. (ג) בניגוד שלב של SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 NSCs iPSC נגזר, גדל ב 5% O 2 ב שקופיות קאמריות. התאים היו קבועים אז paraformaldehyde 4% ו מוכתם נוגדן ראשוני אנטי אנושי Nestin, ואלכס-488 נוגדנים משני. כל הברים בקנה המידה נמצאים 1001;. מ &#39; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research at JoVE.com

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Culturing האדם pluripotent ואת עצבי תאי גזע מערכת תרבית תאים סגורות למחקר בסיסי פרה

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

culturing-human-pluripotent-neural-stem-cells-an-enclosed-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.2K Views.  Childrens Hospital of Orange County Research Institute. Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Video: Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

תרבות דגם חדשני לpluripotent אדם תאי גזע רביה בטין במדיה מזגן שליה

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Passaging Human Neural Stem Cells

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes as well as to explore many fundamental processes of human neural development and pathology.  This protocol presents a simple method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of standardizing this technique and increasing reproducibility of human stem cell research.  The hNSPCs we use were isolated from cadaveric postnatal brain cortices by the National Human Neural Stem Cell Resource and grown as adherent cultures on flasks coated with fibronectin (Palmer et al., 2001; Schwartz et al., 2003).  We culture our hNSPCs in a DMEM:F12 serum-free media supplemented with EGF, FGF, and PDGF and passage them 1:2 approximately every seven days.  Using these conditions, the majority of the cells in the culture maintain a bipolar morphology and express markers of undifferentiated neural stem cells (such as nestin and sox2).

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro allows to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes and to explore human neural development. This protocol presents a method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of increasing reproducibility of human stem cell research.

Passaging אדם בתאי גזע עצביים

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Biology

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

הדור של בתאי גזע עצביים מן רקמה אנושית זרוקות קליפתיים עוברית

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

גזירת יעיל של אבות עצב נוירונים האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

בידול עצבי יעיל באמצעות התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטית מושרית באמצעות מערכת תרבית אוטומטית

An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, including the elucidation of rare disease pathologies, the development of new medicines, and regenerative medicine aiming to restore damaged organs. Despite this, the social implementation of hiPSCs is still limited. This is partly because of the difficulty of reproducing differentiation in culture, even with advanced knowledge and sophisticated technical skills, due to the high sensitivity of iPSCs to minute environmental changes. The application of an automated culture system can solve this issue. Experiments with high reproducibility independent of a researcher's skill can be expected according to a shared procedure across various institutes. Although several automated culture systems that can maintain iPSC cultures and induce differentiation have been developed previously, these systems are heavy, large, and costly because they make use of humanized, multi-articulated robotic arms. To improve on the above issues, we developed a new system using a simple x-y-z axis slide rail system, allowing it to be more compact, lighter, and cheaper. Furthermore, the user can easily modify parameters in the new system to develop new handling tasks. Once a task is established, all the user needs to do is prepare the iPSC, supply the reagents and consumables needed for the desired task in advance, select the task number, and specify the time. We confirmed that the system could maintain iPSCs in an undifferentiated state through several passages without feeder cells and differentiate into various cell types, including cardiomyocytes, hepatocytes, neural progenitors, and keratinocytes. The system will enable highly reproducible experiments across institutions without the need for skilled researchers and will facilitate the social implementation of hiPSCs in a wider range of research fields by diminishing the obstacles for new entries.

Author Spotlight: אוטומציה של תרבות iPSC לשיפור יכולת השחזור 

Here, we present a protocol for an automated cell culture system. This automated culture system reduces labor and benefits the users, including researchers unfamiliar with handling induced pluripotent stem (iPS) cells, from the maintenance of iPS cells to differentiation into various types of cells.

מערכת תרבית אוטומטית לשמירה והתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

תרבויות אלטרנטיבי לפלוריפוטנטיים אנושיים לתאים גזע ייצור, תחזוקה וניתוח גנטי

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

מוח עכבר עוברי מעורב תרביות תאים כדי לחקור זיהום וחסינות מולדת

Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of neurons, astrocytes, oligodendrocytes, and microglia. Due to increasing efforts to replace and reduce animal use, a variety of in vitro cell culture systems have been developed to explore innate cell properties, which allow the development of therapeutics for CNS infections and pathologies. Whilst certain research questions can be addressed by human-based cell culture systems, such as (induced) pluripotent stem cells, working with human cells has its own limitations with regard to availability, costs, and ethics. Here, we describe a unique protocol for isolating and culturing cells from embryonic mouse brains. The resulting mixed neural cell cultures mimic several cell populations and interactions found in the brain in vivo. Compared to current equivalent methods, this protocol more closely mimics the characteristics of the brain and also garners more cells, thus allowing for more experimental conditions to be investigated from one pregnant mouse. Further, the protocol is relatively easy and highly reproducible. These cultures have been optimized for use at various scales, including 96-well based high throughput screens, 24-well microscopy analysis, and 6-well cultures for flow cytometry and reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analysis. This culture method is a powerful tool to investigate infection and immunity within the context of some of the complexity of the CNS with the convenience of in vitro methods.

מחבר זרקור: ביסוס תרביות תאי עצב וגליה מעורבים ממוחות עכברים עובריים לחקר זיהום וחסינות מולדת  

This protocol presents a unique way of generating central nervous system cell cultures from embryonic day 17 mouse brains for neuro(immuno)logy research. This model can be analyzed using various experimental techniques, including RT-qPCR, microscopy, ELISA, and flow cytometry.

ביסוס תרביות תאי עצב וגליה מעורבים ממוחות עכברים עובריים לחקר זיהומים וחסינות מולדת

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of ...

Culturing האדם pluripotent ואת עצבי תאי גזע מערכת תרבית תאים סגורות למחקר בסיסי פרה

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST