מחקר זה מומן על ידי צי מחקר רפואי מרכז, יחידת עבודת מחקר 6000.RAD1.J.A0310. הדעות המובאות במאמר זה הן של הכותבים ואינם מייצגים בהכרח את המדיניות הרשמית או עמדת מחלקת הצי, משרד ההגנה, או ממשלת ארצות הברית. ויי-מיי ג&#39;ינג הינו עובד של ממשלת ארה&quot;ב. עבודה זו הוכנה במסגרת תפקידיהם הרשמיים שלה. כותרת 17 USC §105 קובע כי &quot;הגנה על זכויות יוצרים תחת הכותרת הזו אינה זמינה עבור כל עבודה של ממשלת ארצות הברית.&quot; הכותרת 17 USC §101 מגדיר יצירת ממשלת ארה&quot;ב כיצירה שהכינה חבר או עובדים שירות צבאי של ממשלת ארה&quot;ב כחלק תפקידיו הרשמיים של אותו האדם.

.1 כן פלסמיד דנ&quot;א דילולים כתקן עבור תגובת LAMP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ספקטרופוטומטר למדידת צפיפות אופטית (OD) ב 260 ננומטר, כדי לקבוע את (IS1111a גן המטרה המכיל של ג burnetii RSA 493) פלסמיד ריכוז ה- DNA. OD של 260 של 1 משווה ל 50 מיקרוגרם / μl של ה- DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המר את כמות ה- DNA פלסמיד לתוך מספר עותק. מאז בגודל של הפלסמיד הוא 6,330 נ&quot;ב, המשקל המולקולרי של פלסמיד זה הוא 4.1 x 10 6 גרם (6,330 נקודות בסיס x 649 ג &#39;/ נ&quot;ב). ריכוז ה- DNA של הפלסמיד הוא 34.2 ng / μl (כפי שנקבע משלב 1.1). 1 μl של דגימת DNA זה מכיל 34.2 ng של DNA פלסמיד, שהשוותה ל 5 x 10 9 עותקים (34.2 x 10 -9 גרם / 4.1 x 10 6 GX 6.02 x 10 23) של ה- DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של ה- DNA פלסמיד (5 x 10 9 עותקים / μl) עד 90 μl של מים עבור דילול של פי 10 לבצע דגימת DNA של 5 x 10 8 עותקים / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 1.3 להכין דגימות DNA של 5 x 10 7, 5 x 10 6, 5 x 10 5, 5 x 10 4, 5 x 10 3, 5 x 10 2, 5 x 10 1, ו -5 x 10 0 עותקים / μl. </li></ol> 2. הכן את ה- DNA תבנית ממדגמים עבור תגובת LAMP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מיצוי דנ&quot;א מדגים מפלזמה אנושית באמצעות ערכת מיני DNA מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. השתמש סך של 200 מדגם μl להפקת elute DNA חילוץ בהיקף 20 μl. </li></ol> 3. כן חיץ תגובת LAMP 2x <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 200 μl של 10x Pol הצפת, 320 μl של 5 M trimethylglycine, 12 μl של 1 M MgSO 4, 280 μl של תערובת dNTP (10 מ&quot;מ כל אחד) ו 188 μl של מים כדי להפוך 1 מ&quot;ל של חיץ 2x LAMP. מערבבים על ידי הדופק-vortexing במשך 10 שניות. </li></ol> 4. בצע התגובה הסטנדרטית LAMP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 12.5 μl של 2x LAחיץ MP (כפי מוכן בשלב 3, 40 mM Tris-HCl (pH 8.8), 20 KCl מ&quot;מ, 16 מ&quot;מ 4 MgSO, 20 מ&quot;מ (NH 4) 2 4 SO, 0.2% Triton X-100, 1.6 M trimethylglycine, 1.4 מ&quot;מ dNTP תערובת), 1.2 μl של תמהיל פריימר, 1 μl של פולימראז BST DNA (8 U / μl), ו -5.3 μl של מים כדי להפוך תערובת התגובה (20 μl) בצינור 0.2 מ&quot;ל PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של ה- DNA (משלב 1 או 2) לתערובת התגובה 20 μl ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור סגור לדגור על 60 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות באמבט מים או בלוק חימום. זוהי טמפרטורת התגובה האופטימלית נקבעה בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של 10x חיץ ג&#39;ל העמסה כדי לסיים את התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> μl טען 5 של תוצרי התגובה כדי ג&#39;ל 2% agarose מוכתם intercalating כתם חומצות גרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל הג&#39;ל על 100 וולט במשך 35 דקות במאגר 1x TBE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את התוצאות על ידי אור UV. </li></ol> 5. בצע תגובת LAMP עם מחדשריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 125 μl של 10x Pol הצפת, 200 μl של 5 M trimethylglycine, 7.5 μl של 1 M MgSO 4, 667.5 μl של מים כדי להפוך 1 מ&quot;ל של חיץ הכינון מחדש. מערבבים על ידי הדופק-vortexing במשך 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צינורות המכילים חומרים כימיים lyophilized מהשקית רדיד אלומיניום האטומה. אין להשתמש צינורות אם השקית בנייר אלומיניום אינו אטום או אם הוא פגום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של חיץ הכינון מחדש לתוך צינור אחד מחדש להשעות ריאגנטים lyophilized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים על ידי pipetting למעלה חיץ ולמטה 5 פעמים. תסתכל לוודא ריאגנטים lyophilized מחדש תלויים לחלוטין. האבקה הלבנה צריכה להיעלם בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של תבנית ה- DNA (משלב 1 או 2) אל ריאגנטים מחדש ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור סגור לדגור על 60 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות באמבט מים או בלוק חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של 10x חיץ ג&#39;ל העמסה כדי לסיים את התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 5 μl של תגובהמוצרים ג&#39;ל 2% agarose מוכתם intercalating כתם חומצות גרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל הג&#39;ל על 100 וולט במשך 35 דקות במאגר 1x TBE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את התוצאות על ידי אור UV. </li></ol> 6. בצע תגובת LAMP עם הצפת כינון המכילה HNB או פלורסנט intercalating דיי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 125 μl של 10x Pol הצפת, 200 μl של 5 M trimethylglycine, 7.5 μl של 1 M 4 MgSO, 7.5 μl של 20 מ&quot;מ HNB (או 12.5 μl של 100x לצבוע intercalating פלורסנט) ו 660 μl (או 655 μl) של מים לעשות 1 מ&quot;ל של חיץ הכינון מחדש. מערבבים על ידי הדופק-vortexing במשך 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש החיץ מחדש מוכן בסעיף 6 לחזור על השלבים 5.2 - 5.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את התוצאות על ידי בעין בלתי המזוינת (תגובה המכילה HNB) או אור UV (תגובה המכילה לצבוע intercalating פלורסנט). </li></ol> 7. בצעו תגובת LAMP בזמן אמת עם סורק Tube <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl DNA אל reconstitutריאגנטים ed המכיל לצבוע intercalating פלורסנט, צינור קרוב ולהכניס אותו לסורק צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טמפרטורת דגירת גדר ב 60 ° C. למדוד את הקרינה ב 520 ננומטר במשך 60 דקות. </li></ol>

<ol>
	<li>Anderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+Q+fever+United+States,+2013:+recommendations+from+CDC+and+the+Q+Fever+Working+Group.">Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group.</a> MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).</li><li>Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+ratio+of+serum+doxycycline+concentration+to+MIC+and+rapid+decline+of+antibody+levels+during+treatment+of+Q+fever+endocarditis.">Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis.</a> Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).</li><li>Fournier, P. E., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+PCR+and+serology+assays+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever.">Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever.</a> J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).</li><li>Schneeberger, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+with+serum+samples+is+indispensable+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever.">Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever.</a> Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).</li><li>Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+acute+Q+fever+by+PCR+on+sera+during+a+recent+outbreak+in+rural+South+Australia.">Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia.</a> Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).</li><li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA.">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).</li><li>Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+rapid+and+sensitive+detection+of+Orientia+tsutsugamushi.+by+loo-isothermal+DNA+amplification.">Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification.</a> Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).</li><li>Huber, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+targeting+the+47-kDa+gene+of+Orientia+tsutsugamushi.:+A+rapid+and+sensitive+alternative+to+real-time+PCR.">Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR.</a> J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).</li><li>Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+sensitive+detection+of+the+ompB+gene+of+spotted+fever+group+rickettsiae+by+loop-mediated+isothermal+amplification.">Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification.</a> BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).</li><li>Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+by+turbidity+derived+from+magnesium+pyrophosphate+formation.">Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).</li><li>Qiao, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+for+rapid+detection+of+Bacillus+anthracis.spores.">Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores.</a> Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).</li><li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).</li><li>Thekisoe, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+Loop-Mediated+Isothermal+Amplification+(LAMP)+reagents+and+its+amplification+efficiency+on+crude+trypanosome+DNA+templates.">Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates.</a> J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).</li><li>Chen, H. W., Ching, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+loop-mediated+isothermal+amplification+assays+for+rapid+and+easy+detection+of+Coxiella+Burnetii.">Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii.</a> J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+In-House+Real-Time+LAMP+Assays+with+a+Commercial+Assay+for+the+Detection+of+Pathogenic+Bacteria.">A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria.</a> Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

בעבר, פיתחנו assay LAMP רגיש וספציפי מיקוד אלמנט הכניסה IS1111a 14. מרכיב IS1111 נבחר משום שהיא נשמרת מאוד בקרב הזנים השונים של C. burnetii ומספר גבוהים של עותקים (7 עד 110) החיידקים (קליי 2006). תוצאותינו הראו כי LAMP יכול לזהות כ -25 עותקים של אלמנט IS1111, אשר עשוי לתאם ק...

החיידק גראם שליליים קטנים Coxiella burnetii הוא הגורם הסיבתי של קדחת Q, שהינה זואונוסיס ברחבי העולם. בשל ההפצה העולמית של קדחת Q ואת ההדבקה גבוהה של ג burnetii, ארה&quot;ב אנשי צבאיים ואזרחיים בפריסה רב לאומית נמצאים בסיכון להידבק בתחומי אנדמיים. קדחת Q מבטאת בשתי צורות: זיהומים אקוטיים וכרוניים. Q-חום חריפה מציג את עצמו עם תסמינים דמויי שפעת, דלקת כבד, או דלקת ריאות, והוא בדרך כלל מחלה מעצמם עם שיעור תמותה נמוך. Q-חום כרוני, בעוד פחות נפוץ, לעתים קרובות תוצאות אנדוקרדיטיס, אשר יש שיעור תמותה גבוה בהרבה אם נותר 1,2 המטופל. לכן, אבחון מוקדם כדי להנחות את הטיפול מתאים הוא קריטי עבור טיפול בחולים. מבחני תגובת שרשרת פולימראז (PCR) בזמן אמת PCR כמותי (qPCR) פותחו לאיתור ג DNA burnetii בתרביות דגימות קליניות 3-5 &lt;/ Sup&gt;. שני PCR ו qPCR הם יקרים ולעתים קרובות לא זמינים באזורים מוגבל משאב לעבודה שגרתית. במקור שתאר Notomi 6, הגברת isothermal בתיווך לולאה (LAMP) מציעה שיטת הגברת DNA חלופית. LAMP משתמשת DNA פולימרז BST לסינתזת גדיל DNA עקירה יחד עם סטים פריימר ומעוצבים שמזהים לפחות לשישה אזורים עצמאיים של גן המטרה. היתרון המשמעותי ביותר של LAMP הוא הגברה מתרחשת בתנאי isothermal. לכן, רק באמבט מים, בלוק חימום או באינקובטור נדרש. שיטה זו נעשה שימוש כדי לזהות פתוגנים כמה ריקציאלי 7-9. ויזואליזציה של מוצרי ה- DNA מוגברים על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה היא השיטה המדויקת ביותר שיכול להבדיל חיוביות אמיתית תוצאות חיוביות שגויות עקב הגברה ספציפית. עם זאת בהליכי ג&#39;ל אלקטרופורזה אינם מעשיים עבור ar משאב מוגבלEAS. מספר שיטות חלופיות שפותחו כדי לגלות את תוצרי התגובה. חלופיים אלה, כגון עכירות נגזר היווצרות מגנזיום pyrophosphate 10 או באמצעות צבע intercalating פלורסנט להיות דמיינו תחת אור UV 11,12 הם נוחים יותר פועל ג&#39;ל. ריאגנטים LAMP היו יציבים במשך חודש, כאשר הם מאוחסנים על 25 מעלות צלזיוס ו -37 מעלות צלזיוס, אשר בטמפרטורות סביבה במדינות טרופיות ותת טרופיות שבו הקדחת Q היא 13 אנדמיים. Assay LAMP פותח במעבדה שלנו כדי לזהות את נוכחותו של ג burnetii בדגימות פלזמה 14. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט להכנת תערובת התגובה LAMP מן ריאגנטים lyophilized. ריאגנטים lyophilized יציבים במשך חודש אחד, כאשר הם מאוחסנים ב RT. בשילוב עם שיטת הדמיה קלה, זוהי שיטה אידיאלית לשימוש לאיתור ג burnetii בסביבת משאב מוגבל.

<table><tbody><tr><td>LAMP primers</td><td>Eurofins MWG operon</td><td>10 nmol, salt free</td><td>Sequence designed by customer</td></tr><tr><td>Bst DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0275L</td><td>8 units/ml</td></tr><tr><td>10x Thermo pol buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B9004S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mixture</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>10 mM each</td></tr><tr><td>Betaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300</td><td>5 M, Trimethylglycine</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3409-1ML</td><td>1 M</td></tr><tr><td>10x Bluejuice</td><td>Invitrogen</td><td>10816-015</td><td>gel loading buffer</td></tr><tr><td>SYBR green</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td>10,000x, visualize products in tubes</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Phenix Research Products</td><td>RGB-4103</td><td>10,000x, visualize products in gels</td></tr><tr><td>Lyophilized reagents</td><td>Gene Reach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydroxynaphthol blue</td><td>Fluka</td><td>33936-10G</td><td></td></tr><tr><td>ESEQuant tube scanner</td><td>Qiagen</td><td></td><td>real-time detection</td></tr></tbody></table>

the development of lyophilized loop-mediated isothermal amplification reagents for the detection of coxiella burnetii

Burnetii Coxiella, סוכן גרימת הקדחת Q, הוא חיידק תאי לחייב. מבחני אבחון מבוסס PCR פותחו לאיתור ג DNA burnetii בתרביות דגימות קליניות. PCR דורש ציוד מיוחד והכשרת משתמש קצה נרחבת, ולכן, זה לא מתאים לעבודה שיגרתית במיוחד באזור המוגבל במשאבים. פתחנו הגברת isothermal בתיווך לולאה (LAMP) assay כדי לזהות את נוכחותו של ג burnetii בדגימות המטופל. שיטה זו מבוצעת בטמפרטורה יחידה סביב 60 מעלות צלזיוס באמבט מים או בלוק חימום. הרגישות של assay LAMP זה דומה מאוד PCR עם גבול גילוי של כ -25 עותקים לכל תגובה. דו&quot;ח זה מתאר את הכנת התגובה באמצעות ריאגנטים lyophilized ויזואליזציה של התוצאות באמצעות כחול hydroxynaphthol (HNB) או מנורת UV עם צבע intercalating פלורסנט התגובה. ריאגנטים LAMP היו lyophilized ו לאחסן בטמפרטורת החדר (RT) במשך חודש ללא הפסד של רגישות זיהוי. assay LAMP זהו חזק במיוחד משום הכנת תערובת התגובה אינה כרוך צעדים מורכבים. שיטה זו היא אידיאלית לשימוש הגדרות משאב מוגבל שבו קדחת Q הוא אנדמי.

ריאגנטים LAMP lyophilized בתוך הצינור 0.2 מ&quot;ל מכיל DNA פולימרז BST, תחל ו dNTPs. 20 μl של חיץ הכינון מחדש משמש מחדש להשעות את ריאגנטים lyophilized. איור 1 מציג את תוצאות התגובה LAMP על ג&#39;לים agarose עם ריאגנטים מוכן טרי ריאגנטים lyophilized. מגיב lyophilized לא לצמצם את פע?...

Watch this Scientific Journal Video about The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii at JoVE.com

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

התפתחות Lyophilized Loop בתיווך ריאגנטים הגברה איזו תרמים לצורך זיהוי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

the-development-lyophilized-loop-mediated-isothermal-amplification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

10.4K Views.  Naval Medical Research Center. We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Video: The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many countries around the world. Severe yield losses are caused by direct feeding, and even more importantly, also by the transmission of more than 100 harmful plant pathogenic viruses. As for other invasive pests, increased international trade facilitates the dispersal of B. tabaci to areas beyond its native range. Inspections of plant import products at points of entry such as seaports and airports are, therefore, seen as an important prevention measure. However, this last line of defense against pest invasions is only effective if rapid identification methods for suspicious insect specimens are readily available. Because the morphological differentiation between the regulated B. tabaci and close relatives without quarantine status is difficult for non-taxonomists, a rapid molecular identification assay based on the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology has been developed. This publication reports the detailed protocol of the novel assay describing rapid DNA extraction, set-up of the LAMP reaction, as well as interpretation of its read-out, which allows identifying B. tabaci specimens within one hour. Compared to existing protocols for the detection of specific B. tabaci biotypes, the developed method targets the whole B. tabaci species complex in one assay. Moreover the assay is designed to be applied on-site by plant health inspectors with minimal laboratory training directly at points of entry. Thorough validation performed under laboratory and on-site conditions demonstrates that the reported LAMP assay is a rapid and reliable identification tool, improving the management of B. tabaci.

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

This paper reports the protocol for a rapid identification assay for Bemisia tabaci based on loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology. The protocol requires minimal laboratory training and can, therefore, be implemented on-site at points of entry for plant imports such as seaports and airports.

בתיווך לולאה Assay איזותרמי הגברה (מנורה), עבור זיהוי מהיר של כנימת עש הטבק

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

Environment

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in vegetable production annually. Phytophthora capsici is soil-borne and a persistent problem in vegetable fields due to its long-lived survival structures (oospores and chlamydospores) that resist weathering and degradation. The main method of dispersal is through the production of zoospores, which are single-celled, flagellated spores that can swim through thin films of water present on surfaces or in water-filled soil pores and can accumulate in puddles and ponds. Therefore, irrigation ponds can be a source of the pathogen and initial points of disease outbreaks. Detection of P. capsici in irrigation water is difficult using traditional culture-based methods because other microorganisms present in the environment, such as Pythium spp., usually overgrow P. capsici making it undetectable. To determine the presence of P. capsici spores in water sources (irrigation water, runoff, etc.), we developed a hand pump-based filter paper (8-10 &#181;m) method that captures the pathogen&#8217;s spores (zoospores) and is later used to amplify the pathogen&#8217;s DNA through a novel loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay designed for the specific amplification of P. capsici. This method can amplify and detect DNA from a concentration as low as 1.2 x 102 zoospores/mL, which is 40 times more sensitive than conventional PCR. No cross-amplification was obtained when testing closely related species. LAMP was also performed using a colorimetric LAMP master mix dye, displaying results that could be read with the naked eye for on-site rapid detection. This protocol could be adapted to other pathogens that reside, accumulate, or are dispersed via contaminated irrigation systems.

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

We developed a method to detect Phytophthora capsici zoospores in water sources using a filter paper DNA extraction method coupled with a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay that can be analyzed in the field or in the lab.

זיהוי של Phytophthora capsici במים השקיה באמצעות לולאה בתיווך איזותרמית

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in ...

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease mechanisms and may elucidate new markers to substratify disease with different clinical features and better understand pathogenesis. We have developed a highly quantitative method called Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS) for profiling patient sera antibody responses to autoantigens and pathogen antigens associated with infection. Unlike ELISAs, the highly sensitive LIPS is easily implemented to survey humoral serological response profiles to different antigens in a universal format and produces dynamic antibody titer ranges up to 6 log10 for some antigens. In these studies, quantitative profiling by LIPS of patient humoral responses against panels of antigens or even the entire proteome of some pathogens (i.e. HIV), is typically more informative than testing a single antigen by ELISA. In addition, LIPS also eliminates time and effort needed to produce highly purified antigens as well as the labor-intensive assay optimization steps needed for standard ELISAs. Here we provide a detailed protocol describing the technical aspects of performing LIPS assays for readily profiling antibody responses to single or multiple antigens.

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

The technical aspects of performing LIPS (Luciferase Immunoprecipitation Systems) are described. The overall approach involves expressing chimeric genes encoding antigens fused to Renilla luciferase (Ruc) in mammalian cells. Crude Ruc-antigen extracts are then prepared and, without purification, employed in immunoprecipitation assays to quantify antibodies.

נוגדן פרופיל על ידי מערכות immunoprecipitation בלוציפראז (שפתיים)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

Biology

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Isothermal הגברה מבחני בתיווך לולאה (LAMP) לאיתור המינים ספציפי של<em&gt; Eimeria</em&gt; כי להדביק תרנגולות

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

החלת העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) לבחינת יעילות טרנסלוקציה מפעיל ידי<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; במהלך siRNA השתקה

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

זיהוי ויזואלי של מספר חומצות גרעין ב מערך נימי

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Bioengineering

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. Although mycoplasma do not usually kill contaminated cells, they are difficult to detect and can cause a variety of effects on cultured cells, including altered metabolism, slowed proliferation and chromosomal aberrations. In short, mycoplasma contamination compromises the value of those cell lines in providing accurate data for life science research.
The sources of mycoplasma contamination in the laboratory are very challenging to completely control. As certain mycoplasma species are found on human skin, they can be introduced through poor aseptic technique. Additionally, they can come from contaminated supplements such as fetal bovine serum, and most importantly from other contaminated cell cultures. Once mycoplasma contaminates a culture, it can quickly spread to contaminate other areas of the lab. Strict adherence to good laboratory practices such as good aseptic technique are key, and routine testing for mycoplasma is highly recommended for successful control of mycoplasma contamination.
PCR-based detection of mycoplasma has become a very popular method for routine cell line maintenance. PCR-based detection methods are highly sensitive and can provide rapid results, which allows researchers to respond quickly to isolate and eliminate contamination once it is detected in comparison to the time required using microbiological techniques. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit is highly sensitive, with a detection limit of only 2 genomes per &mu;l. Taking advantage of the highly specific JumpStart Taq DNA Polymerase and a proprietary primer design, false positives are greatly reduced. The convenient 8-tube format, strips pre-coated with dNTPs, and associated primers helps increase the throughput to meet the needs of customers with larger collections of cell lines.
Given the extreme sensitivity of the kit, great care must be taken to prevent inadvertent contamination of samples and reagents. The step-by-step protocol we demonstrate highlights the precautions and practices required for reliable mycoplasma detection. We also show and discuss typical results and their interpretation. Our goal is to ensure the success of researchers using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit utilizes the polymerase chain reaction (PCR), which is established as the method of choice for highest sensitivity in the detection of Mycoplasma, Acholeplasma, and Ureaplasma contamination in cell cultures and other cell culture derived biologicals.

אופטימליים PCR מבוססי זיהוי של Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

אבחון זיהומים חיידקיים בדרכי הנשימה בבני אדם באמצעות הגברה איזותרמית

Rapid Detection of Bacterial Pathogens Causing Lower Respiratory Tract Infections via Microfluidic-Chip-Based Loop-Mediated Isothermal Amplification

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will provide practical guidelines for managing and treating RTIs. This study describes a method for rapidly detecting bacterial pathogens that cause respiratory tract infections via multi-channel loop-mediated isothermal amplification (LAMP). LAMP is a sensitive and specific diagnostic tool that rapidly detects bacterial nucleic acids with high accuracy and reliability. The proposed method offers a significant advantage over traditional bacterial culturing methods, which are time-consuming and often require greater sensitivity for detecting low levels of bacterial nucleic acids. This article presents representative results of K. pneumoniae infection and its multiple co-infections using LAMP to detect samples (sputum, bronchial lavage fluid, and alveolar lavage fluid) from the lower respiratory tract. In summary, the multi-channel LAMP method provides a rapid and efficient means of identifying single and multiple bacterial pathogens in clinical samples, which can help prevent the spread of bacterial pathogens and aid in the appropriate treatment of RTIs.

מחבר זרקור: קידום זיהוי מהיר של פתוגנים נשימתיים באמצעות שבב מיקרופלואידי 

Various bacterial pathogens can cause respiratory tract infections and lead to serious health issues if not detected accurately and treated promptly. Rapid and accurate detection of these pathogens via&#160;loop-mediated isothermal amplification provides effective management and control of respiratory tract infections in clinical settings.

זיהוי מהיר של פתוגנים חיידקיים הגורמים לזיהומים בדרכי הנשימה התחתונות באמצעות הגברה איזותרמית בתיווך לולאה בתיווך שבב מיקרופלואידי

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will ...

התפתחות Lyophilized Loop בתיווך ריאגנטים הגברה איזו תרמים לצורך זיהוי של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בתיווך לולאה Assay איזותרמי הגברה (מנורה), עבור זיהוי מהיר של כנימת עש הטבק

זיהוי של Phytophthora capsici במים השקיה באמצעות לולאה בתיווך איזותרמית

נוגדן פרופיל על ידי מערכות immunoprecipitation בלוציפראז (שפתיים)

Isothermal הגברה מבחני בתיווך לולאה (LAMP) לאיתור המינים ספציפי של

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של

החלת העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) לבחינת יעילות טרנסלוקציה מפעיל ידי

זיהוי ויזואלי של מספר חומצות גרעין ב מערך נימי

אופטימליים PCR מבוססי זיהוי של Mycoplasma

זיהוי מהיר של פתוגנים חיידקיים הגורמים לזיהומים בדרכי הנשימה התחתונות באמצעות הגברה איזותרמית בתיווך לולאה בתיווך שבב מיקרופלואידי

זיהוי מהיר של פתוגנים חיידקיים הגורמים לזיהומים בדרכי הנשימה התחתונות באמצעות הגברה איזותרמית בתיווך לולאה בתיווך שבב מיקרופלואידי