המחברים מבקשים להודות אריק ואסקו עזרתו בהכנת מצעים PDMS, ד&quot;ר Shiyong וואנג במעבדה של ד&quot;ר מרינה מאטה באוניברסיטת מישיגן עבור הצעות מועילות והכשרה של בידוד DRG, וד&quot;ר מארק Tuszynski וד&quot;ר . וו מארי קמפנה באוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו לקבלת הצעות פרוטוקול מועיל עבור בידוד SC. מחקר זה מומן בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע (CBET 0,941,055 ו CBET 1,510,895), המכון הלאומי לבריאות (R21CA176854, R01GM089866, ו R01EB014986).

כל הנהלים עבור בידוד של תאים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת מישיגן. 1. הכנת שטח אניזוטרופי טרום נמתח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 10: 1 פתרון של הבסיס סוכן ריפוי ויוצקים את התערובת לתוך צלחת בתרבית רקמה (12 ס&quot;מ קוטר). השתמש 4,900 בסיס מ&quot;ג ו -490 מ&quot;ג סוכן ריפוי עבור תערובת crosslinking הכולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור את תערובת ג&#39;ל תחת ואקום במשך 20 דקות כדי להסיר בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התערובת ג&#39;ל בתנור ריפוי לילה בשעה 60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מרפא קרום PDMS, לטיפול פני השטח עם פלזמה חמצן באמצעות מערכת ניקוי פלזמה / תחריט 3 דקות ב 165 mTorr ו -65 זרימת SCCM של O 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים חתיכה של קרום מלבני (5 × 3.5 ס&quot;מ) מצלחת, בעת היותו מודע באיזה צד הוא שטופלו בחמצן, לוודא בצד שטופלו חמצן הוא פונה כלפי מעלה ולתקן על מסגרת מתיחה. מניח את המסגרת על<html> מתיחה הבמה למתוח באופן שווה על ידי סיבוב הכפתור על הבמה עד שהוא מגיע 10 התארכות% (או כמה למתוח שנקבע מראש אחרים; התארכות ניתן לקרוא ישירות מהבמה מתיחה) ב 9 ציר זמן ארוך יותר. תקן את המתיחה על ידי הידוק הברגים על המסגרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המסגרת מהבמה. ודא פני השטח קרום יבש ונקי אבק, ולאחר מכן למקם בתא סיליקון על הממברנה ומאפשר הצד הדביק של החדר לצרף בחוזקה הממברנה. הערה: תא סיליקון מספק גם עבור שמירה על המדיום הסלולרי על הממברנה PDMS. עיצוב המכשיר מוצג באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את פני השטח עם UV למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל פולי- L- ליזין (PLL) (0.01% ב בופר פוספט) אל פני השטח PDMS בתוך החדר, בתוך 6 שעות של טיפול פלזמה דגירה במשך שעה 2 ב 37 ° C לפני זריעת נוירונים DRG. זה משפר מצורף תא. </li></ol>le &quot;&gt; 2. בידוד של DRG <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן בינוני צמיחה סטנדרטי עבור נוירונים DRG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הבידוד, חיטוי ציוד בידוד מכשור לאספקת מים. הוסף 5 מ&quot;ל של חיץ בידוד לתוך אחד טוב של צלחת 6-היטב, ומניחים את הצלחת על קרח. הכן 10 מ&quot;ל של מדיום דיסוציאציה על ידי הוספת 1 מ&quot;ל של collagenase (500 U / ml) עד 9 מ&quot;ל של 0.05% טריפסין- EDTA (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל), לסנן הפתרונות עם מסנן 0.22 מיקרומטר ומניחים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משתמש בו עשרה כדי שתים עשרה 5 - &#39;7 ימים ישנות חולדות Sprague-Dawley עבור הבידוד. רסס את הגורים עם 75% isopropanol, ולהקריב על ידי עריפת ראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את העור שמעל חוט השדרה מהחלק האחורי להסיר את כל רקמה עודפת סביב עמוד השדרה. תחת זכוכית מגדלת כירורגית עם האורות במקום כירורגית על, לבצע את החתך הראשון מהצוואר ואז חתך אחד לאורך עמוד השדרה משני הצדדים עם מספריים. לנתק את עמוד השדרה מהגוף של הגורים ולהסיר את השרירים העודפים. לאחר מכן, להשתמש במספריים לחתוך לאורך לוןציר גרם של פינצטה השדרה ושימוש כדי לפתוח את עמוד השדרה לגמרי ולחלץ את השדרה cord.Remove קצה מן פיפטה כדי ליצור פתח גדול יותר להעברת DRGs עם חיץ בידוד לתוך צינור 15 מ&quot;ל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פינצטה בסדר, להסיר את גנגליון מכיס העצם ולאסוף כ -10 - 16 DRG משני הצדדים. חתוך את שורשי העצבים ולהעביר את הגרעינים למאגר בידוד קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את טיפ פיפטה כדי ליצור פתח גדול יותר להעברת DRGs עם חיץ בידוד לתוך צינור 15 מ&quot;ל סטרילי. לאחר הניתוק הכימי, צנטריפוגה הגרעינים ב 900 XG ו -4 C ° למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנו רקמות ליישב לתחתית של התחתית ובעדינות להסיר את החיץ בידוד על גבי ולהוסיף 10 מ&quot;ל של מדיום דיסוציאציה לתוך הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הרקמות הגזורות במדיום דיסוציאציה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 תוך רעד הצינור כל 5 - 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחרהדיסוציאציה, צנטריפוגות כימיים הגרעינים ב 900 XG ו -4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant מחדש להשעות הגלולה ב 10 מיליליטר תקשורת צמיחה סטנדרטית מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים ניתקו כמצוין בסעיף 2.9 שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant, מחדש להשעות הגלולה ב 12 מיליליטר של תקשורת מערבולת צמיחה הסטנדרטית. </li></ol> 3. תרבות של DRG על משטח טרום נמתח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני זריעת התאים, להסיר את פתרונות PLL מהאולם לשטוף את המשטח PDMS עם יבש מים ואוויר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בדיקה חוזרת של השעיית תאים, תיתן את הסט ההשעיה עבור 1 - 2 דקות, כדי לאפשר את הפסולת כדי ליישב לתחתית של התחתית. הוסף 1.5 מ&quot;ל של תרחיף תאים לתוך תא למתוח לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחסל ותאי גלייה, ב 1 יום במבחנה (DIV), להוסיף 10 μl (או 15 μl) תערובת של soluti המניות fluoro-2 deoxy-uridine ו uridine (FDU-U)על (ראה טבלה של חומרים) זה טוב. לאחר 7 שעות, להחליף בינוני עם מדיום גידול רגיל טרי מצמיד את התקן התרבות טרום נמתח באינקובטור 37 ° C עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתקופת תרבית תאים (2 - 3 שבועות), לשנות את התקשורת בכל יומיים על ידי החלפת מחצית בינונית בילה עם מדיום חדש. הערה: לאחר culturing על המשטחים נמתחים unstretched עבור 2 שבועות, גיל מטוהרים מתווספים הקאמרי בתרבית למשך שבוע נוסף (שלב 4.7). </li></ol> 4. משותף תרבות של תאי שוואן (SCS) עם DRG נוירונים על פני שטח טרום נמתחו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד גיל כפי שתואר על ידי הקבוצה של ד&quot;ר קמפנה בעבר 15. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, לבודד את הגיל מאז שהיה גור קטן בן 1 יום. האיסוף לנתק את העצבים הנשה הוא כימי (טריפסין-EDTA ו- A Collagenase) מכאני (18 מחט מד / 10 מזרק מיליליטר) 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי התאים ניתקו לתוך פולי- D- ליזין (PDL) במשותףבקבוק ותרבות T25 ated ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. ביום 5, לטהר את התאים דרך בחירת נוגדנים באמצעות אנטי-עמך 1.1 נוגדן ארנב להשלים תת התאים המטוהרים למעבר 2 - 4. בינוני השתמש תרבות המכיל בינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), 10% בסרום שור עוברי (FBS) פניצילין, 1% / סטרפטומיצין (פן / סטרפטוקוקוס), 21 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​שור יותרת המוח חלץ (BPE), ו -4 מיקרומטר Forskolin. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני תרבות מן גיל, ולהוסיף 5 מ&quot;ל 0.05% טריפסין-EDTA לתוך הבקבוק. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 על 2 - 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק התאים תחת מיקרוסקופ אופטי באמצעות המטרה 10X כדי לראות אם הם להרים מהבקבוק, ולאחר מכן להוסיף 5 מ&quot;ל של מדיום תרבות ומערבבים עם התאים את הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את ההשעיה לתא צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל ו צנטריפוגות ב XG 200 ו -20 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב 7 מ&quot;ל med צמיחה DRG תקןIA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 10 μl של השעיה התא לתוך צינור microcentrifuge 0.5 מ&quot;ל, לערבב עם 10 μl של trypan כחול, ולאחר מכן לספור את מספר הסלולרי באמצעות hemocytometer תחת מיקרוסקופ אופטי באמצעות המטרה 10X. לדלל את השעית תא 5,000 תאים לכל מיליליטר ידי הוספת תקשורת צמיחת DRG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 0.5 מ&quot;ל של מדיום מתרבות DRG בתא נמתח ולהוסיף 0.5 מ&quot;ל של השעיה SC לתרבות DRG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות התאים במשך שבוע 1 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. שנה את התקשורת בכל יומיים על ידי החלפת מחצית בינונית בילה עם מדיום הגידול רגיל טרי DRG. לאחר 1 בשבוע שיתוף תרבות, תהליך התאים על ידי אימונוהיסטוכימיה 10. </li></ol>

<ol>
	<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Layer-by-Layer Films for Biomedical Applications. , 525-546 (2015).</li><li>Faweett, J. W., Keynes, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Nerve+Regeneration.">Peripheral Nerve Regeneration.</a> Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).</li><li>Li, Y., Field, P. M., Raisman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+adult+rat+corticospinal+tract+by+transplants+of+olfactory+ensheathing+cells.">Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells.</a> Science. 277, 2000-2002 (1997).</li><li>Geller, H. M., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+bridge:+Engineering+spinal+cord+repair.">Building a bridge: Engineering spinal cord repair.</a> Exp Neurol. 174, 125-136 (2002).</li><li>Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury+is+accompanied+by+chronic+progressive+demyelination.">Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination.</a> J Comp Neurol. 486, 373-383 (2005).</li><li>Chua, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+neurites+sense+the+depth+of+the+underlying+topography+during+neuronal+differentiation+and+contact+guidance.">Extending neurites sense the depth of the underlying topography during neuronal differentiation and contact guidance.</a> Biomaterials. 35, 7750-7761 (2014).</li><li>Dowell-Mesfin, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographically+modified+surfaces+affect+orientation+and+growth+of+hippocampal+neurons.">Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons.</a> J Neural Eng. 1, 78-90 (2004).</li><li>Baek, S., Gleason, R. L., Rajagopal, K. R., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+small+on+large:+Potential+utility+in+computations+of+fluid-solid+interactions+in+arteries.">Theory of small on large: Potential utility in computations of fluid-solid interactions in arteries.</a> Comput Method Appl M. 196, 3070-3078 (2007).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Static+Pre-stretch+Induced+Surface+Anisotropy+on+Orientation+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Effect of Static Pre-stretch Induced Surface Anisotropy on Orientation of Mesenchymal Stem Cells.</a> Cell Mol Bioeng. 7, 106-121 (2014).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+pre-stretch+induced+surface+anisotropy+on+axon+regeneration.">The impact of pre-stretch induced surface anisotropy on axon regeneration.</a> Tissue Eng Part C Methods. , (2015).</li><li>Berns, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligned+neurite+outgrowth+and+directed+cell+migration+in+self-assembled+monodomain+gels.">Aligned neurite outgrowth and directed cell migration in self-assembled monodomain gels.</a> Biomaterials. 35, 185-195 (2014).</li><li>Kidambi, S., Lee, I., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neuron/astrocyte+co-culture+on+polyelectrolyte+multilayer+films:+A+template+for+studying+astrocyte-mediated+oxidative+stress+in+neurons.">Primary neuron/astrocyte co-culture on polyelectrolyte multilayer films: A template for studying astrocyte-mediated oxidative stress in neurons.</a> Adv Funct Mater. 18, 294-301 (2008).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+neurite+growth+of+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+and+increased+colocalization+with+Schwann+cells+on+aligned+poly(methyl+methacrylate)+electrospun+nanofibers.">Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers.</a> Brain Research. 1565, 18-27 (2014).</li><li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts:+Extremes+and+exploitations.">Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations.</a> Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).</li><li>Mantuano, E., Jo, M., Gonias, S. L., Campana, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+Density+Lipoprotein+Receptor-related+Protein+(LRP1)+Regulates+Rac1+and+RhoA+Reciprocally+to+Control+Schwann+Cell+Adhesion+and+Migration.">Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein (LRP1) Regulates Rac1 and RhoA Reciprocally to Control Schwann Cell Adhesion and Migration.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 14259-14266 (2010).</li><li>Kim, B., ET, K. P., Papautsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stability+of+plasma+oxidized+PDMS+surfaces.">Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 7, 5013-5016 (2004).</li><li>Lopera, S., Mansano, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-Based+Surface+Modification+of+Polydimethylsiloxane+for+PDMS-PDMS+Molding.">Plasma-Based Surface Modification of Polydimethylsiloxane for PDMS-PDMS Molding.</a> ISRN Polymer Science. 2012, (2012).</li><li>Chandra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Organosilicon Materials. , (2013).</li><li>Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+poly(dimethylsiloxane)+surface+modification+to+control+cell+adhesion.">Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion.</a> Surf Interface Anal. 41, 11-16 (2009).</li><li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-channel+scaffolds+to+promote+spinal+cord+axon+regeneration.">Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration.</a> Biomaterials. 27, 419-429 (2006).</li><li>Clarke, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+methacrylate+polymers+direct+spiral+ganglion+neurite+and+Schwann+cell+growth.">Micropatterned methacrylate polymers direct spiral ganglion neurite and Schwann cell growth.</a> Hearing Res. 278, 96-105 (2011).</li><li>Pfister, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons.">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li></ol>

The authors do not have any conflict of interest to disclose.

כדי לגרום יישור האקסון על משטח מראש נמתח, ישנם שני שלבים קריטיים: 1) קרום PDMS חייב להיות שטוח של עובי אחיד; ו -2) ותאי גלייה חייב יוסר DRG. לאחר ערבוב PDMS ו crosslinker וריפוי בתנור, הג&#39;ל PDMS crosslinked צריך להישמר על גבי ספסל שטוח מטופל בזהירות כדי למנוע הטיה. טיפול פלזמת החמצן של קרום ...

בפגיעות עצבים, גדמי הפרוקסימלי ועצב דיסטלי מנועים לעתים קרובות מן ההתכנסות ישירה של fascicles עצב בשל באתר הנגע 1-2. בדרך כלל, קטעי האקסון מורכבים הורה מאוד ומיושר צרורות של אקסונים, המהווים רשתות מורכבות של קישוריות. עם זאת, התחדשות של עצבים היא תהליך כאוטי עקב יישור האקסון מאורגן היטב 3-4. לכן, כדי ליצור כמות מספקת של התחדשות אקסונים כי לגשר על אתר הנגע, יש צורך להשרות יישור אקסונלית מאורגן היטב. בנוסף, פגיעה במיאלין מלווה פציעות עצב בשל מות התאים myelinating במקום הפציעה. מאז demyelination מאוד פוגע קיבולת המוליך לשרוד אקסונים, טיפולי מיקוד demyelination או קידום מיאלין מחדש הם משמעותיים עבור התאוששות תפקודית לאחר פגיעה עצבית 5. לכן המטרה של פרוטוקול זה היא להמחיש גישה הנדסית מטפלת בשני נושאים אלושל התחדשות של עצבים. אנאיזוטרופיה Surface, אשר מוגדרת כהבדל, כאשר נמדדו לאורך צירים שונים, בתוך התכונות הפיסיקליות או מכאניות של חומר, יושמה להשפיע יישור תא, צמיחה, והגירת 6-7. בנוסף טופוגרפיה, ישנן שיטות אחרות כדי לגרום אנאיזוטרופיה. בעבר, חקרנו אנאיזוטרופיה משטח המושרה על ידי מראש מתיחה סטטית מכני של פולי-דימתיל-siloxane (PDMS) קרום. התאוריה של &quot;סופר עיוות קטן המוטל על גדול&quot; חזתה כי הנוקשות היעילות התאים לחוש בכיוון נמתח נבדלו בכיוון ניצב, וההבדל הזה נוקשות יעילות הוא בשל שטח אנאיזוטרופיה 8. בתאי גזע mesenchymal (MSCs) בתרבית על קרום מראש נמתח PDMS מסוגלים לחוש את אנאיזוטרופיה ידי משיכת משטח פעיל וכתוצאה מכך, ליישר בכיוון מראש נמתח 9. באופן דומה, ar משטח איזוטרופיאייסינג ממשטח מראש נמתח מכני משפיע על יישור, כמו גם צמיחה myelination של גנגליון השורש הגבי (DRG) אקסונים 10. כאן אנו מספקים פרוטוקול גרימת אנאיזוטרופיה השטח על מצע PDMS מראש נמתח סטטי כדי לשפר התחדשות האקסון 10. כדי לעורר יישור האקסון, תכונות טופולוגי עם דפוסים רצויים, דיווח על מנת לספק הדרכת קשר באמצעות סיבים מיושרים וערוצים 6,11-12, הודגמו כדי להקל יישור האקסון 11,13. עם זאת, דיווח טכניקות גרימת יישור האקסון באמצעות תכונות טופולוגי, כגון סיבים, ערוצי דפוסים, לא הצליח להאריך ולהגדיל את העובי של אקסונים. לעומת זאת, הדרגתי מכאני מתיחה הוביל יישור האקסון לכיוון המתיח עם אקסונים ארוך ועבה כי גדל עם הגודל של המתיחה 14. עם זאת, כולל התקן מנוע מופעל vivo אינואפשרי. לעומת זאת, אנאיזוטרופיה סטטי מושרה מראש נמתחת היא פחות מסובכת ויכולה להיות משולבת יותר בקלות לתוך עיצובי פיגום בעתיד ליישומי in vivo. בפרוטוקול זה, מערכת תרבית תאים טרום נמתח סטטי משמש לגרום אנאיזוטרופיה משטח ללא תכונות טופולוגי. מערכת ההתרבות נמתח מראש מורכב קרום PDMS, מסגרת stretchable ובמה מתיחה, ואז הממברנה מקובע המסגרת בסדר גודל למתוח מראש מוחל על הבמה המתיחה. טרי מבודד נוירונים DRG מתורבת על פני השטח טרום נמתח עד 21 ימים מנוטרים ליישור ועובי האקסון. כתוצאה מכך, תאי שוואן (SCS) שיתוף תרבותי עם אקסונים המיושרים מנוטרים עבור מעטפת המיאלין. על ידי שילוב אנאיזוטרופיה משטח המושרה מראש למתוח הצלחנו לשפר התא יישור-בידול האקסון יישור-צמיחה של MSCs ונוירונים DRG 9-10, בהתאמה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane &#65288;PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium 1X</td>
			<td>GibcoBRL</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement 50X</td>
			<td>GibcoBRL</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax-I 100X</td>
			<td>GibcoBRL</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax-I</td>
			<td>GibcoBRL</td>
			<td>11020-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve Growth Factor-7S</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13290-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>GibcoBRL</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA/1mM EDTA</td>
			<td>GibcoBRL</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td><a href="http://www.trevigen.com/item/2/7/64/220/Cultrex_PolyLLysine/">3438-100-01</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>p-6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-2 deoxy-uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170-112</td>
			<td>Isolation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I Collagenase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30080.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPE</td>
			<td>Clonetics</td>
			<td>CC-4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>344270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone chamber</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>FlexiPERM ConA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaning/etching system</td>
			<td>March Instruments</td>
			<td>PX-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Thy 1.1 antibody</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>M7898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Complement</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>S-7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard growth medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 500 ml Neurobasal Medium 1X, add 10 ml of B-27 50X, 5 ml of Glutamax-I 100X,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 &#956;l of NGF-- 7S (50 ug/ml).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDU and Uridine stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FDU 100mg in 10ml of ddw (10mg/ml), filter in the hood and divided in 500ul aliquots and store at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Uridine 5g in 166.7ml of ddw (33mg/ml), filter in hood, divide in 200ul aliquots and store at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Take 61.5ul of FDU (10mg/ml) and 20.5ul of Uridine(33mg/ml), and add 4918ul of ddw to a final stock concentration,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>then divide in 1 ml aliquots and store at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an approach to enhance alignment and myelination of dorsal root ganglion neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

מערכת תרבית תאים טרום נמתח קדמה יישור האקסון DRG 10. נוירונים DRG היו בתרבית על משטחים מראש נמתח unstretched במשך 12 ימים. האקסונים היו מוכתמים עבור β-III טובולין להפגין יישור שלהם. איור 2 משווה אוריינטציה האקסון על מצעים PDMS מראש נמתח unstretched לאחר 12 ...

Watch this Scientific Journal Video about An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons at JoVE.com

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

גישת שפר מערך myelination של נוירונים שורש הגבה גנגליון

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

an-approach-to-enhance-alignment-myelination-dorsal-root-ganglion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.4K Views.  Michigan State University. This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Video: An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

הדמיה חיה של אקסונים לאחר רוט הגבי Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

המחקר הגנטי של הדור הבא אקסון עם נוירונים בתרבית למבוגרים הגנגליון הגב שורש

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

גב שורש הגרעינים עצב ותאי גזע שמקורם בשומן Differentiated:<em&gt; במבחנה</em&gt; משותף תרבות דגם לחקר התחדשות של עצבים היקפיים

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

במבחנת דוגמנות של פלישה העצבית סרטנית: מודל גנגליון השורש הגבה

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

הזרקת גנגליון שורש הגבה ו שורש הגבה Crush פגיעה כמודל להתחדשות החושית אקסון

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive targets for injection of novel therapeutics aimed at treating chronic pain. In small animal models, laminectomy has been used to facilitate DRG injection because it involves surgical removal of the vertebral bone surrounding each DRG. We demonstrate a technique for intraganglionic injection of lumbar DRG in a large animal species, namely, swine. Laminotomy is performed to allow direct access to DRG using standard neurosurgical techniques, instruments, and materials. Compared with more extensive bone removal via laminectomy, we implement laminotomy to conserve spinal anatomy while achieving sufficient DRG access. Intraoperative progress of DRG injection is monitored using a non-toxic dye. Following euthanasia on post-operative day 21, the success of injection is determined by histology for intraganglionic distribution of 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). We inject a biologically inactive solution to demonstrate the protocol. This method could be applied in future preclinical studies to target therapeutic solutions to DRG. Our methodology should facilitate testing the translatability of intraganglionic small animal paradigms in a large animal species. Additionally, this protocol may serve as a key resource for those planning preclinical studies of DRG injection in swine.

We describe a method for laminotomy in swine that provides access to lumbar dorsal root ganglia (DRG) for intraganglionic injection. Injection progress is monitored intraoperatively and histologically confirmed up to 21 days after surgery. This protocol could be used for future preclinical studies involving DRG injection.

Laminotomy גישה גנגליון המותני שורש העזוב, הזרקה של החזירים

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of the PNS are affected by injury and disease, affecting the nerve function and the capacity for regeneration. Neuronal immune cells are commonly analyzed by immunofluorescence (IF). While IF is essential for determining the location of the immune cells in the nerve, IF is only semi-quantitative and the method is limited to the number of markers that can be analyzed simultaneously and the degree of surface expression. In this study, flow cytometry was used for quantitative analysis of leukocyte infiltration into sciatic nerves or dorsal root ganglions (DRGs) of individual mice. Single cell analysis was performed using DAPI and several proteins were analyzed simultaneously for either surface or intracellular expression. Both sciatic nerves from one mouse that were treated according to this protocol generated &#8805; 30,000 single nucleated events. The proportion of leukocytes in the sciatic nerves, determined by expression of CD45, was approximately 5% of total cell content in the sciatic nerve and approximately 5-10% in the DRG. Although this protocol focuses primarily on the immune cell population within the PNS, the flexibility of flow cytometry to measure a number of markers simultaneously means that the other cells populations present within the nerve, such as Schwann cells, pericytes, fibroblasts, and endothelial cells, can also be analyzed using this method. This method therefore provides a new means for studying systemic effects on the PNS, such as neurotoxicology and genetic models of neuropathy or in chronic diseases, such as diabetes.

Quantitative analysis of cell content within the murine sciatic nerve is difficult due to the scarcity of the tissue. This protocol describes a method for tissue digestion and preparation that provides sufficient cells for flow cytometry analysis of immune cell populations from nerves of individual mice.

ניתוח של תאים חיסוניים העצבים ממוגלה יחיד, גנגליון העזוב השורש של עכבר אחת באמצעות Cytometry זרימה

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

בידוד גרעיני הבסיס העזוב והתרבות העיקריים ללמוד שחרור נוירוטרנסמיטר

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

התחדשות האקסון בתרבית של החוקר: In Vivo אלקטרופורציה של העכבר למבוגרים העזוב שורש גנגליון

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure

Single-fiber recording has been a classical and effective electrophysiological technique over the last few decades because of its specific application for nerve fibers in the central and peripheral nervous systems. This method is particularly applicable to dorsal root ganglia (DRG), which are primary sensory neurons that exhibit a pseudo-unipolar structure of nervous processes. The patterns and features of the action potentials passed along axons are recordable in these neurons. The present study uses in vivo single-fiber recordings to observe the conduction failure of sciatic nerves in complete Freund&#8217;s adjuvant (CFA)-treated rats. As the underlying mechanism cannot be studied using in vivo single-fiber recordings, patch-clamp-recordings of DRG neurons are performed on preparations of intact DRG with the attached sciatic nerve. These recordings reveal a positive correlation between conduction failure and the rising slope of the after-hyperpolarization potential (AHP) of DRG neurons in CFA-treated animals. The protocol for in vivo single fiber-recordings allows the classification of nerve fibers via the measurement of conduction velocity and monitoring of abnormal conditions in nerve fibers in certain diseases. Intact DRG with attached peripheral nerve allows observation of the activity of DRG neurons in most physiological conditions. Conclusively, single-fiber recording combined with electrophysiological recording of intact DRGs is an effective method to examine the role of conduction failure during the analgesic process.

Single-fiber recording is an effective electrophysiological technique that is applicable to the central and peripheral nervous systems. Along with the preparation of intact DRG with the attached sciatic nerve, the mechanism of conduction failure is examined. Both protocols improve the understanding of the peripheral nervous system&#39;s relationship with pain.

השימוש ב Vivo הקלטה חד-סיבים ושורש השורש שלמות עם העצב מוצמד לבחון את המנגנון של כשל הולכה

Single-fiber recording has been a classical and effective electrophysiological technique over the last few decades because of its specific application for ...