We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).

תמלול 1. במבחנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Linearize וקטורים pCS2-H2A.F / Z-EGFP ו / או pCS2-mCherry-CAAX ידי הגבלה NotI האנזים לעכל 31. שימוש RNA בערכת שעתוק במבחנה, ליצור מוצרי mRNA 5 &#39;כתרים מכל תבנית, על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את ה- mRNA כתרים באמצעות ערכת טיהור. עקוב אחר ההוראות של היצרן. Elute עם H RNase ללא 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הריכוז של RNA על ידי ספיגה ב 260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. (OD 260 x דילול x 40 מיקרוגרם / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את RNA ל 100 ng / μl עבור כל H2A.F / Z-EGFP ו mCherry-CAAX עם RNase ללא H 2 O. אם ריכוז RNA הוא נמוך מדי, את הקרינה תפחת או נעדר. דגימות בהירות תקטנה את חשש phototoxicity ואת photobleaching. מצד השני, גם RNA הרבה יכול להיות רעיל ו / או לגרום מחוץ תופעות יעד. הערה: אחסן את הנותריםmRNA מטוהר במקפיא -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. גידול דג זברה, אוסף עובר, הזרקת mRNA 36-38 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכב טנקי רבייה עם מחסום להפריד הטנק לשני אזורים וממלאים כל אקווריום רבייה במי מערכת מדגה בשימוש במתקן דג הזברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע רבייה בטרם עת, הנח שני דג זכר בצד אחד של המחסום ושני דגים נקבה בצד השני אמש רבייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להפשיר את התערובת mRNA הכין בעבר על הקרח. החלף את המים במיכלים רבייה במי מערכת מדגה טריים להסיר את המחסומים. מייד לאחר המחסומים נמשכים, לחמם עובש הזרקה ל -28.5 מעלות צלזיוס, להגדיר את הציוד עבור microinjection. הערה: לקבלת מידע על תבניות להזרקה, עיין גרלך 36. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף ביצים כל 10 - 15 דקות באמצעות מסננת תה ולשטוף את הביצים לתוך צלחת 100 x 15 מ&quot;מ פטרי נקי באות E3 כחול (5 mM NaCl, KCl 0.17 מ&quot;מ, 0.33 מ&quot;מ 2 CaCl, 0.33 מ&quot;מ 4 MgSO, 10 -5% מתילן כחול). E3 הכחול משמש למניעת גידול פטרייתי ולהבטיח התפתחות תקינה של דגי זחל. לקבלת מידע נוסף על הזדווגות ואיסוף עובר, עיין גרלך 36 ו Porazinkski 37. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השבץ חד-תאים מבוימים עוברת בתוך תבנית הזרקה חממה ולהזריק את הרנ&quot;א בחלמון בסך הרצוי של עוברים (איור 1 א). חשבון למוות עוברי טבעי עוברים מופרים על ידי ביצוע זריקות עובריות ב -15% יותר עובר מדרוש לצורך הניסוי. לפרטים נוספים על microinjection של עוברי דג הזברה, עיין גרלך 36 ו Porazinkski 37. הערה: לשימוש לראשונה של mRNA, מבצע ניתוח מנה-עקום כדי לקבוע את המינון האופטימלי עבור קרינה ואת הכדאיות (המוגדרת אין פגמים התפתחותיים ברוטו עד 5 DPF) לפני ביצוע הדמית 5D. 150 - 200 ng / μlמוזרק לעוברים הוא לעתים קרובות הריכוז האופטימלי, ולכן הוא נקודת התחלה טובה עבור הריכוז הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לחלץ את העוברים המוזרקים מהתבנית בעזרת פיפטה פסטרה זכוכית 9 &quot;שונה. כדי לשנות את פיפטה, להמס את הסוף באמצעות מבער בונזן עד שנוצר כדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים עוברים מוזרקים בצלחת 100 x 15 מ&quot;מ פטרי ב E3 הכחול ובית C חממת 28.5 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שש שעות לאחר הזרקה, להסיר כל עוברים מתים או מופרים מהצלחות ולהוסיף נקי E3 הכחול. בית העוברים על 28.5 ° C. </li></ol> 3. הכנה והטבעה של עוברי דג הזברה חי הדמיה (איור 1B) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתי שעות לפני ההדמיה, להקרין את העוברים המוזרקים עבור GFP באמצעות מיקרוסקופ לנתח ניאון. מניחים עוברים GFP להביע ירוק בהיר בצלחת 100 x חדש 15 מ&quot;מ פטרי עם E3 כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים פתרון המניות של agarose נמוכה להמיס 1% על ידי הוספת 1 גרם של נמוכה להמיס agarose ל -100 מ&quot;ל של E3 כחול. לאחר שימוש agarose, מכסה את הבקבוק עם רדיד אלומיניום. הפתרון המניה נשאר שימושי עד חודש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 3 מ&quot;ל של אגר מומסת לתוך צינור תרבות 17 x 100 מ&quot;מ. שמור על חם agarose על ידי הנחת צינור תרבות באמבט מים C ° 42 עד מוכן לשימוש. הכן פתרון 15 מ&quot;מ Tricaine במים deionized כדי להרדים את עוברי דג הזברה 36. הערה: אם ההדמיה קודמת זמן נקודות היא רצויה, הריכוז אגר ניתן ירד נמוך כמו 0.3% 39. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו את 15 מ&quot;מ Tricaine, עוברים הוקרן, נמוכה להמיס agarose, E3 כחול, וצלחת תרבות התחתונה coverslip זכוכית 35 מ&quot;מ עד מיקרוסקופ אור לנתיחה. מוציאים בזהירות את של סיסית העובר עם פינצטה 5 #. האם זה במשך שלושה עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העוברים dechorionated במיכל נפרד כדי להיות מורדם. המכסה של המנה coverslip התחתונה משמשת לעתים קרובות למטרה זו. בעזרת פיפטה העברה, להוסיף שלוש טיפות (כ 150 μl)של 15 מ&quot;מ Tricaine כדי בצלחת של כחול 5 מ&quot;ל E3 (אם באמצעות המכסה של צלחת coverslip למטה) או עד עוברים כבר הרדים מספיק. בנוסף, להוסיף 3-4 טיפות (כ 150 - 200 μl) של 15 מ&quot;מ פתרון Tricaine אל הצינור agarose מומסת 1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה p200 עם 1 ס&quot;מ של קצה פיפטה מנותקים; להעביר את העוברים בהרדמה כדי בצלחת coverslip בעל תחתית. הסר את כל עודפי E3 כחול: פתרון Tricaine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט מוסיף 5 - 10 μl של agarose הנמוכה להמס: פתרון Tricaine על עובר, שמירה על כל טיפה נפרדת כדי להבטיח את העוברים לא להיסחף בטעות קרובה אחד לשני. אזהרה: אם agarose חם מדי, זה יגרום נזק לעובר. טמפרטורה טובה כדי לשמור על אגרה היא C ° 42. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט 21 G ½ 1, בעדינות לכוון את העובר ב agarose למיקום הרצוי. בעת שימוש במיקרוסקופ הפוכה הדמיה זמן לשגות, כוון את האזור של עניין (ROI) קרוב coverslip כמו possible. הערה: כללית, באזור הזנב מציע וקלות ההתמצאות בהירות עקב (איור 1 א) יחסית רזה רקמות. רקמות אחרות, כגון שכבת האפיתל סביב קפלי חלמון סנפיר, ניתן להשתמש 28,29. רקמות אלה מציעות בבהירות רבה, אולם האזורים אלה הם רק כמה שכבות תאים עבים. לצורך בפרוטוקול זה, זה מועיל לתמונה באזור הזנב לרכוש חלוקות תא רבות ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן כמה דקות עבור מיצוק חלקי של אגר. השתמש מחט להתפרק פיסה קטנה של אגר כדי לבדוק מיצוק שלה. כאשר פיסה אגר ניתן התרחקה הטיפה, המשך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את coverslip כולו עם אגר נמוך להמס ויוצרים כיפה על העוברים המוטבעים. אפשר אגר לגבש לפני הזזת צלחת הדמיה confocal (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תהליך ההתמצקות אגר (לוקח כ -10 דקות), להכין 3 מיליליטר of E3 כחול פתרון עם חמש טיפות של (כ 250 μl) 15 מ&quot;מ Tricaine להציב על העוברים מוטבע במהלך ההדמיה. </li></ol> 4. הדמיה Confocal 5D של 40,41 עוברים דג הזברה חי הערה: ראה Ariga 40 ו אובריאן 41 לפרטים על כיצד לבצע הדמית 5D באמצעות מערכות confocal אחרות. עבור Z-מרווח, Z- מחסנית, Z-עומק, מרווח הזמן, והגדרות 5D ראה תרשים 1C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת ההדמיה ולהגדיר מיקרוסקופ כדי 1.4 עדשה אובייקטיבית 60X NA. החל שמן טבילה אל העדשה האובייקטיבית ומניח בצלחת התרבות מחזיקה שקופיות על במת מיקרוסקופ. באמצעות בקר הציר, למרכז את עובר עניין מעל העדשה האובייקטיבית ולהביא את העדשה האובייקטיבית כלפי מעלה כדי לפגוש את מנת התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש על סמל עין החתיכה ולעבור מסנן GFP על המיקרוסקופ. דגש על ROI. התמקדות הרקמה הקרובה ביותר coverslip יהיה offer תוצאות ההדמיה הטובות ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המשתלבים. בחר את ערוצי GFP ו mCherry (אורכי גל שנקבע מראש בתוכנה) ולהגדיר את הקו הממוצע אפשרות לקדמותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש &quot;צפה / בקרת רכישה / A1 שטח סריקה&quot; פקודה כדי לפתוח את כלי שטח סריקת A1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל בסריקה. באמצעות בקר הציר, עמדה עובר כך את אזור הסריקה מתמלא כמה שיותר דג הזברה ככל האפשר. כוח לייזר לא צריך להיות אופטימלי בשלב זה. מנמיכים את כוח לייזר כדי למנוע photobleaching מיותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש &quot;בקרות צפו / רכישה / רכישת ND&quot; פקודה כדי לפתוח את לוח בקרת רכישת ND. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין סריקה כדי להגדיר את הפרמטרים מחסנית Z. קבע את הגבול העליון Z- מחסנית למקום שבו התאים הם לא בפוקוס גבול תחתון למקום שבו תאים אינם גלויים. לאפשר מרחב 3 מיקרומטר מעל המדגם לצמיחת תנועת תא, אשר עשוי להתרחב לתחום ההדמיה. The Z-ערימה עבור הדמויות המוצגים פרו זהtocol מכוסה בעומק-Z של 40 מיקרומטר הזנב העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גודל הצעד Z-מרווח 2 מיקרומטר. בממוצע, תא הוא 10 מיקרומטר קוטר; ולכן 2 מיקרומטר יפיקו חמישה במרווחים של נתוני הדמיה להיות מנותחים עבור כל תא. הערה: עומק התמונה שניתן לרכוש תלויה מרווח Z. רזולוצית Z הוא הקריב כדי להשיג עומק הכולל בממד Z כדי תמונה כמו תאים רבים עוברים מיטוזה כמו (Z- עומק גדול) אפשרי. המצב ההפוך הוא נכון, באותה, על ידי הפחתת גודל הצעד, ברזולוציה Z הוא זכה, תוך עומק Z הוא הקריב (Z- עומק קטן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את כוח לייזר תמונה, HV, וקיזזו רמות. עבור הניסויים הפגינו פרוטוקול זה, להשתמש בכוח הליזר הבא, HV, וקזז רמות להגדיר ברמות המקבילות, בהתאמה, עבור ערוץ ה- GFP; 2 - 5, 120 - 140, ו -9 ל -11. עבור ערוץ mCherry, השתמש כוח הליזר הבא, HV, וקזז רמות, בהתאמה; 3 - 6, 120 - 140, ו -3 כדי-8. לאחר הפרמטרים נקבעים, לכבות את הסריקה כדי למנוע חשיפת ליזר מיותרת שעלולות לגרום phototoxicity ואת photobleaching של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את סמל מיצוע קו 2x. &quot;אין מיצוע&quot; מייצר תמונה מגורענת בזמן &quot;קו 4x הממוצע&quot; מאריך את זמן הסריקה באופן דרסטי. השימוש מיצוע קו 2x מספק את איכות התמונה הגבוהה ביותר וזמן הסריקה המהירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את משך המתאים מרווח זמן הזמן הדרוש לצורך הניסוי. עבור חטיבות wild-type, מרווחי זמן של שתי דקות במשך שעה 2. עדיף לקביעת משך mitotic (ששימשו איורים 1, 2, 3 א, ו 3B). חטיבות המפעילות את מחסום הרכבת ציר עבור יותר מ -30 דקות מתאימות יותר של חמש דקות במשך ארבע שעות על מנת לשמר קרינה כפי שמודגם באיור 3C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את תיבת &quot;ולשמור את הקובץ&quot; ואת שם הקובץ כדי לשמור את הקובץ באופן אוטומטי כפי שהוא נרכש. בדוק היטב את כל parameters הוגדר כהלכה ופגע &quot;התחל הפעלה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרכישה תושלם, כדי לראות את הקובץ בפורמט תלת ממדים, לחץ על סמל סף נפח. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

השימוש בשיטה זו מאפשר להסיק פירוט מעטפת הגרעין, היווצרות של צלחת metaphase ידי קבצים מצורפים microtubule-קינטוכור, והפרדה של כרומטידה אחות ליצירת שני תאים חדשים vivo ובאופן שהזמן גרמן. היכולת להתבונן מיטוזה דג הזברה יש יתרון על פני דגימות קבועות ומערכות תרבית תאים כי ה...

מיטוזה הוא חיוני בתהליכים תאיים קריטי לצמיחה, בידול, והתחדשות בכל יצור חי. עם הכנה מדויקת שכפול של דנ&quot;א ביניים, התא ערוך לחלק. השלב הראשון של מיטוזה, prophase, הוא שיזם ההפעלה של cyclin B / Cdk1. Prophase מאופיין עיבוי של חומר הכרומטין לתוך הכרומוזומים. פירוט המעטפה גרעיני מתרחש במעבר בין prophase ו prometaphase. בשנת prometaphase, centrosomes, במרכז nucleating להיווצרות ציר, להתחיל להגר הקטבים תוך הארכת microtubules בחיפוש מצורף קינטוכור. עם קובץ מצורף, המרות קצה בדבר עיקול microtubule וכוחות המתח לכוון את הכרומוזומים להרכיב צלחת metaphase 1. אם כל הכרומוזומים מחוברים כהלכה, מחסום הרכבת הציר בא על סיפוקו, טבעות cohesin מחזיקות את כרומטידה האחות יחד הם בקעו, ו microtubules לקצר למשוך אחותוכרומטידה כדי קטבים מנוגדים במהלך anaphase 2,3. השלב הסופי, telophase, כרוך התארכות התא הרפורמציה של מעטפת הגרעין סביב שני הגרעינים החדשים. Cytokinesis משלים את התהליך החלוקה על ידי הפרדת הציטופלסמה של התאים הבת החדשים שני 4-6. שינוי מסלולי mitotic מפתח (כלומר, מחסום הרכבת ציר, שכפול centrosome, לכידות כרומטידה אחות, וכו.) יכול לגרום למעצר metaphase, missegregation של הכרומוזומים, 7-10 יציבות גנומית. בסופו של דבר, פגמי מיטוזה שליטת מסלולים יכולים לגרום פרעות התפתחותיות וסרטן, ויזואליזציה מחייב של מיטוזה והפגמים שלה חי, חוליות, רב תאי אורגניזם 10-16. עוברי דג הזברה לשרת כאורגניזם מודל נהדר עבור הדמיה לחיות בשל רקמה שקופה, קלות microinjection, ופיתוח מהיר. שימוש דג זברה, המטרה הכוללת של כתב היד הזה היאמתארים שיטה של 5D חי (מידות X, Y, Z, זמן, אורך הגל) הדמיה של מיטוזה 17 (תרשים 1C). שימוש מוטצית דג הזברה פגומה במסלולי mitotic שונים להדגים התוצאה של פגמים כאלה. עבור פרוטוקול זה, מוטציות אורורה B ו- Esco2 נבחרו כדי להמחיש את הפגמים הללו. אורורה B הוא קינאז כי הוא חלק מקומפלקס נוסעים כרומוזום (CPC) המעורבים ביצירת ציר והתקשרות microtubule. היא נדרשת גם להיווצרות הקמט מחשוף ב cytokinesis 18,19. בשנת דג הזברה, מחסור ב אורורה מוביל פגמים אינדוקציה תלם, cytokinesis, וכרומוזום הפרדה 20. Esco2, ומצד שני, הוא acetyltransferase כי הוא חיוני עבור לכידות כרומטידה אחות 21,22. זה acetylates cohesin על החלק SMC3 של הטבעת ובכך מייצב cohesin כדי להבטיח הפרדה כרומוזום נכונה במעבר metaphase-anaphase 23. אובדן Esco2 דג הזברה מוביל CHmissegregation romosome, הפרדת כרומטידה אחות מוקדמת, חוסר יציבות גנומית, ו- p53 תלוי אפופטוזיס עצמאית 24,25. בשל הזמינות, auroraB hi1045, ו hi2865 esco2 דג הזברה מוטציה (להלן המכונה aurB מ / מ &#39;esco2 מ / מ&#39;, בהתאמה) ישמש כדי להמחיש את הטכניקה הזו 25-27. מיקרוסקופיה זיווגי confocal עם מכונות תא ניאון מתויגות אפשרה לחוקרים לחזות דינמיקת הכרומטין קרום התא במהלך מיטוזה 25,28,29. פלורסנט מתויג היסטונים שימשו היסטורית לדמיין הכרומטין. ההיסטונים הם חלבונים גרעיניים מורכב מארבעה זוגות שונים (H2A, H2B, H3, H4 ו) כי הם אחראי המבנה הנוקלאוזום כי מלחינת כרומוזומים 30. בעוד H2B הוא לטעון את היסטון השימושי ביותר עבור חלבוני ניאון בהעכבר תרבית תאים, השימוש היסטון 2A, Z משפחה (H2A.F / Z) הוכיח גם לשימוש 31,32 דג הזברה. Concanavalin A ו- קזאין קינאז 1-גמא למשל, למקם את קרום התא בעבר הוכח יעיל לדמיין את קרום תא קיפודי ים תסיסנית 33,34. מחקרים אחרים הראו כי חלבון פלואורסצנטי מתויג CAAX תוויות קרום התא היה מוצלח דג זברה 31. CAAX הוא מוטיב כי הוא מוכר על ידי אנזימים שינוי שלאחר translational כגון farnesyltransferases ו geranylgeranyltransferases. שינויים על ידי אנזימים אלה לגרום חלבונים להפוך קרום קשור, ובכך תיוג קרום התא 35. בשל השימוש לפני דג זברה, פרוטוקול זה בחר להשתמש H2A.F / ת ו CAAX לתייג הכרומטין קרום התא. יישום של שיטה זו יאפשר החוקר לפקח מיטוזה ברמת התא היחידה להתבונן כרומוזום פרטדינמיקה, וכן בו זמנית לפקח חלוקות תא מרובות עלולים להשפיע בידול רקמות ופיתוח. מאמר זה יתמקד הדמית הדינמיקה של פרדה כרומוזום במהלך מיטוזה ברמת התא היחידה. בתוך כתב היד הזה, את היכולת להתבונן כמה חטיבות mitotic, לחשב זמן חלוק, ולפענח פנוטיפים mitotic שתודגם ודנה. באמצעות פרמטרים אלה, נתונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ניתן לאסוף להחיל מצבי מחלה כמה מושפע פגמים mitotic.

<table><tbody><tr><td>pCS2 vectors</td><td>Gift from K. Kwan</td><td></td><td>For plasmid of interest</td></tr><tr><td>NotI-HF restriction enzyme</td><td>New England BioLabs</td><td>R3189S</td><td>For restriction digest of plasmid</td></tr><tr><td>mMessage SP6 kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>For &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; transcription</td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>For purifying mRNA</td></tr><tr><td>100 x 15 mm Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>For housing embryos</td></tr><tr><td>microinjection mold</td><td>homemade</td><td></td><td>For holding embryos during microinjection</td></tr><tr><td>Agarose II</td><td>Amresco</td><td>0815-25G</td><td>For embedding embryos</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>For anesthetizing embryos</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M7506</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Methylene Blue Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MB1</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>100 mm culture tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-819-812</td><td>For melted agar</td></tr><tr><td>35 mm glass coverslip bottom culture dish&amp;nbsp;</td><td>MatTek Corp</td><td>P35G-0-20-C&amp;nbsp;</td><td>No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos</td></tr><tr><td>#5 tweezers</td><td>Dumont</td><td>72701-D</td><td>For dechorionating embryos</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 gauge needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>For positioning embryos in agar</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon AZ100</td><td></td><td>For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Nikon A1+</td><td></td><td>For time-lapse imaging</td></tr><tr><td>Confocal software</td><td>NIS Elements AR 4.13.00</td><td></td><td>For image acquisition and processing</td></tr></tbody></table>

observing mitotic division and dynamics in a live zebrafish embryo

מיטוזה היא קריטית לצמיחה האורגניזם והבחנה. התהליך הוא מאוד דינמי ומחייב הורה אירועים להשיג עיבוי הכרומטין נכון, מצורף קינטוכור-microtubule, פרדה כרומוזום, ואת cytokinesis בתוך מסגרת זמן קטנה. שגיאות בתהליך העדין יכולות לגרום מחלות אנושיות, כוללים מומים מולדים וסרטן. גישות מסורתיות חוקרות מצבי מחל mitotic אדם לעתים קרובות מסתמכות על מערכות תרבית תאים, אשר חסרים את הפיסיולוגיה הטבעית בהקשר התפתחותי / רקמות ספציפיות יתרון כאשר לומדים מחלות אנושיות. פרוטוקול זה מתגבר על מכשולים רבים על ידי מתן דרך לחזות, עם רזולוציה גבוהה, דינמיקת כרומוזום במערכת החולייתנים, דג הזברה. פרוטוקול זה יפרט גישה, שניתן להשתמש בם כדי להשיג תמונות דינמיות של תאים מתחלקים, הכוללים: במבחנת שעתוק, רביית דג זברה / איסוף, הטבעה עוברת, ולאחר הזמן לשגות הדמיה. אופטימיזציה modifications של פרוטוקול זה גם נחקר. שימוש H2A.F / Z-EGFP (תוויות הכרומטין) ו mCherry-CAAX (קרום התא תוויות) עוברים מוזרק mRNA, מיטוזה ב AB wild-type, auroraB hi1045, ו hi2865 esco2 דג הזברה מוטציה הוא מדמיין. הדמיה לחיות ברזולוציה גבוהה של דג זברה מאפשרת להתבונן mitoses המרובה לכמת פגמי mitotic סטטיסטיים ועיתוי של התקדמות mitotic. בנוסף, תצפית של היבטים איכותיים המגדירים תהליכי mitotic פסולים (כלומר, פגמי congression, missegregation של כרומוזומים, וכו &#39;) ותוצאות כרומוזומליות פסולות (כלומר, aneuploidy, polyploidy, גרעינונים, וכו&#39;) הם נצפו. assay זה יכול להיות מיושם על תצפית של / בידול רקמת פיתוח הוא נוח לשימוש דג הזברה מוטציה וסוכני תרופתי. ויזואליזציה של כמה פגמים מיטוזה להוביל להפרעות סרטן והתפתחותיות יהיה מאודלשפר את ההבנה של בפתוגנזה של המחלה.

<html> איור 2 מדגים את היכולת להתבונן חלוקות תא רבות באמצעות תצוגת שדה רחב של זנב דג הזברה wild-type AB. במשך שבע התאים mitotic הם צילמו בתוך מסגרת זמן 14 דק &#39;(סרט 1). בתוך מנות זמן שני hr, למעלה מ -40 אירועים mitotic נתפסו. בממוצע, 50 תאים מתחלקים נצפו AB ו ...

Watch this Scientific Journal Video about Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo at JoVE.com

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

observing-mitotic-division-and-dynamics-in-a-live-zebrafish-embryo

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Developmental Biology

Molecular Biology

Anatomy and Physiology

Unit 1

Unit 2

Cell Division

Essential Cellular Processes

SCIENTISTS IN ACTION

12.0K Views.  University of Alabama at Birmingham. Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Video: Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biology

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Neuroscience

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

<meta charset="utf8"></head><body>פרוטוקול מיקרוסקופיה מרובת תצוגות מעודנת עבור עוברים של דגי זברה

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר Spotlight: אסטרטגיות להרכבת עוברים של דגי זברה עבור מיקרוסקופ גיליון אור מרובה תצוגות ברזולוציה גבוהה — טכניקות להדמיה ושחזור תמונה

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

Summary

Explore More Videos

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה