Name: utilizing functional genomics screening to identify potentially novel drug targets in cancer cell spheroid cultures
Uploaded: 2016-12-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures at JoVE.com

The authors would like to thank Fredrik Walberg (FACS and imaging facility, ICR) for assistance with microscopy. This work was funded by Breast Cancer Now. RN is the recipient of a Breast Cancer Now Career Development Fellowship (2011MaySF01).

1. הכנת צלחות siRNA 96-היטב הערה: השוליים החיצוניים של צלחת 96-גם נוטים יותר אידוי לעומת בארות אחרות, ובכך להגביל את כמות siRNAs 60 לכל 96-גם צלחת. מלאו בארות חיצוניות עם מדיום רגיל או PBS להגביל זה. בנוסף, מסך אימות של להיטים מומלץ להקל הטיות צלחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את siRNAs 250 - 500 ng / μL במדיום סרום מופחת (לפי המלצות יצרן) ו aliquot 10 μL על הבארות המתאימות צלחת המצורף אולטרה-הנמוך. בצע את כל המסכים בשלושה עותקים. הערה: שלב המתאים ללא מיקוד (שלילי) והרג (חיובי, כגון UBB ו PLK1) שולטת siRNA בעיצוב הצלחת על מנת להבטיח יעילות transfection ניתן להעריך. שימוש צלחות נמוכה התקשרות עבור עבודת siRNA הוא קריטי, כמו תאים יתווספו לתערובת transfection. אנחנו לא יכולים לשלול כי חלק מהיצרנים מצורף אולטרה-נמוכהצלחות יכולות להיות השפעות עדינות על צמיחה אליפטית. וככזה אנו ממליצים אלה נבדקים על ידי משתמש הקצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אטמים עם חותמות ולאחסן דבק ב -20 ° C. </li></ol> 2. Transfection ההפוך של שורת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של המסך, להפשיר את הצלחות בטמפרטורת החדר ומסובב למשך 5 דקות XG ב 1000 באמצעות צנטריפוגות הספסל העליון. הוסף 10 μL של מדיום סרום מופחת המכילים את מגיב transfection אופטימיזציה היטב כל באמצעות פיפטה רבה. השאירו צלחות במשך 15 דקות עבור מתחמי transfection המכילים siRNA להיווצר. הערה: מחקר זה נצל את סרטן שד תא קו BT474 להקרנה גנומית תפקודית (בתרבית DMEM גלוקוז גבוהה (בינוני הנשר השונה של Dulbecco) בתוספת 10% עוברי בסרום שור (FBS) ואנטיביוטיקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize את התאים שיוקרנו (טריפסין 0.05% ו 0.53 mM EDTA) עד שניתקו מהבקבוק, לנטרל באמצעות נפח מתאים של specif שורת תאיםic בינוני ספין במשך 5 דקות XG ב 1000 על צנטריפוגות ספסל עליונים להסיר טריפסין. Resuspend התאים עם נפח מתאים של המדיום ולקבוע מספר הסלולרי מדויק באמצעות מונה תא. הערה: בדרך כלל 5,000 תאים לכל טוב מספיקים להיווצרות אליפטית על פני רוב שורות תאים הנבדקות. חשוב לספור את התאים במדויק כמו השעית תא בודדת להשוואות גודל מדויקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תאי 5,000 תאים לכל 180 μL במדיום קר (4 ° C). הערה: התוספת של רכיבי מטריצת קרום במרתף מחדש תשפיע באופן שלילי יעילות transfection ומומלץ כי הוא אינו בשימוש. אופטימיזציה הקו הסלולרית כדי לאשר קיבולת ויוצרי אליפטית ויעילות מציאה צריכה להתבצע לפני המסך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את השעית התא למאגר, pipet לערבב ולהוסיף 180 μL היטב כל הצלחת המצורפת אולטרה-נמוך 96-היטב המכילה את siRNA שהוכן קודם לכן (2.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Centrifugדואר הצלחת XG ב 1000 בצנטריפוגה 4 ° C precooled למשך 10 דקות ולאחר מכן לחזור חממה בתרבית רקמה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: התאים יופיעו כמו פסיפס בתחתית הבארות. במהלך 12 הבאות - 24 השעות התאים המצרפי יהיו ביחד כדי ליצור כדור בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, להתבונן התאים יוצרים אליפטית יחיד במרכז הבאר. הוספת 100 μL של בינוני מלא כל טוב כדי לעודד את הצמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחדש בינוני לאחר שלושה ימים. הוצא בעדינות 100 μL של המדיום מבאר כל ולהוסיף 100 μL של מדיום חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 7, לכמת את גודל אליפטית האוטומטית על קורא צלחת שיכולה לפקח צמיחת אליפטית כמותית לאורך זמן (ראה סעיף 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לקבוע כדאיות התא באמצעות צבע כדאיות התא זורח (ראה סעיף 4). </li></ol> 3. תמונה אוטומטית רכישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את הצלחות על הדמיה צלחת הספסל העליון, מיקרו-היטב cytometer ביום 7. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"> &lt;li&gt; פתח את התוכנה, בחר את האפשרויות הבאות: צלחת &quot;טוב -96 &#39;, בחר את סוג הצלחת המתאים וזן שם ניסוי. הערה: כל מידע נוסף ניתן גם להוסיף לתוך התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את היישום &#39;Tumorsphere&#39;. לשנות את המיקוד כך אליפטית בפוקוס יש ניגודיות אופטימלית. הערה: אנו ממליצים על דימוי מבוסס מיקוד &quot;כמו וריאציות משמעותיות בגדלים אליפטית צפויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הבארות הדורשות סריקה &#39;סריקה התחל &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנת סורק הצלחת, להבטיח כי מסכת האובייקט מייצגת את הגודל אליפטית במדויק. עושים זאת על ידי התאמת קוטר המושבה, התרחבות הגבול, הגדרות עובי ודיוק מינימום, באופן ספציפי עבור כל שורת תאים נבדק 11,12. הערה: אזור אליפטית אז יחושב באמצעות אלגוריתם תוכנה. לדוגמה, כדי לחשב את השטח במדויק spheroids BT474 גדל במשך שבעה ימים להתאים דיוק ל &#39;גבוהה&#39;ד להגדיר את קוטר מושבת מינימום 200 מיקרומטר. פעולה זו אמורה לייצר נציג מסכה אליפטית מתאים של אזור אליפטית. הערה: נתונים אלה לאחר מכן ניתן לייצא מהמכונה, באמצעות פונקציית היצוא, בשינה בצורת קובץ נתונים מבואר. תאריך הוא צלחת החציוני מנורמלת, בשילוב ונותח באמצעות כשל או הבדל סטנדרטי ממוצע לחלוטין (SSMD) לזהות siRNAs אשר השפיע באופן מובהק סטטיסטי על אזור אליפטית. </li></ol></li></ol> 4. קביעת כדאיות התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר באזור אליפטית חושב, לקבוע את הכדאיות באמצעות צבע תא כדאיות זורח. כן מגיב בהתאם להוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות 100 μL של המדיום מבאר כל ולהוסיף 100 μL של צבע הכדאיות. דגירת צלחות במשך 15 דקות ולאחר מכן סרוקות באמצעות קורא צלחת זורח. הערה: נתונים אלה לאחר מכן ניתן לייצא מהמכונה, באמצעות פונקציית היצוא, ב בבצורת קובץ נתונים מבואר. תאריך הוא צלחת החציוני מנורמלת, בשילוב ונותח באמצעות כשל או הבדל סטנדרטי ממוצע לחלוטין (SSMD) לזהות siRNAs אשר השפיע באופן מובהק סטטיסטי על כדאיות אליפטית. </li></ol>

<ol>
	<li>Seton-Rogers, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+the+ErbB2+receptor+and+transforming+growth+factor+beta+in+induction+of+migration+and+invasion+in+mammary+epithelial+cells.">Cooperation of the ErbB2 receptor and transforming growth factor beta in induction of migration and invasion in mammary epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (5), 1257-1262 (2004).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Chia, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+a+novel+hypoxia-regulated+marker,+carbonic+anhydrase+IX,+in+invasive+breast+carcinoma.">Prognostic significance of a novel hypoxia-regulated marker, carbonic anhydrase IX, in invasive breast carcinoma.</a> J Clin Oncol. 19 (16), 3660-3668 (2001).</li><li>Trastour, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1alpha+and+CA+IX+staining+in+invasive+breast+carcinomas:+prognosis+and+treatment+outcome.">HIF-1alpha and CA IX staining in invasive breast carcinomas: prognosis and treatment outcome.</a> Int J Cancer. 120 (7), 1451-1458 (2007).</li><li>Wilson, W. R., Hay, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+hypoxia+in+cancer+therapy.">Targeting hypoxia in cancer therapy.</a> Nat Rev Cancer. 11 (6), 393-410 (2011).</li><li>Ros, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+metabolic+screen+identifies+6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase+4+as+an+important+regulator+of+prostate+cancer+cell+survival.">Functional metabolic screen identifies 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 4 as an important regulator of prostate cancer cell survival.</a> Cancer Discov. 2 (4), 328-343 (2012).</li><li>Baenke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+identifies+MCT4+as+a+key+regulator+of+breast+cancer+cell+metabolism+and+survival.">Functional screening identifies MCT4 as a key regulator of breast cancer cell metabolism and survival.</a> J Pathol. 237 (2), 152-165 (2015).</li><li>Schug, Z. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-CoA+synthetase+2+promotes+acetate+utilization+and+maintains+cancer+cell+growth+under+metabolic+stress.">Acetyl-CoA synthetase 2 promotes acetate utilization and maintains cancer cell growth under metabolic stress.</a> Cancer Cell. 27 (1), 57-71 (2015).</li><li>Mashimo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+is+a+bioenergetic+substrate+for+human+glioblastoma+and+brain+metastases.">Acetate is a bioenergetic substrate for human glioblastoma and brain metastases.</a> Cell. 159 (7), 1603-1614 (2014).</li><li>Comerford, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+dependence+of+tumors.">Acetate dependence of tumors.</a> Cell. 159 (7), 1591-1602 (2014).</li><li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+tumor+spheroid+invasion+assay.">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> J Vis Exp. (99), e52686 (2015).</li><li>Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents.">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods Mol Biol. 986, 253-266 (2013).</li><li>Barretina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cancer+Cell+Line+Encyclopedia+enables+predictive+modelling+of+anticancer+drug+sensitivity.">The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity.</a> Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).</li><li>Maguire, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SF3B1+mutations+constitute+a+novel+therapeutic+target+in+breast+cancer.">SF3B1 mutations constitute a novel therapeutic target in breast cancer.</a> J Pathol. 235 (4), 571-580 (2015).</li><li>Brough, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+viability+profiles+of+breast+cancer.">Functional viability profiles of breast cancer.</a> Cancer Discov. 1 (3), 260-273 (2011).</li><li>Ferber, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO3a+regulates+reactive+oxygen+metabolism+by+inhibiting+mitochondrial+gene+expression.">FOXO3a regulates reactive oxygen metabolism by inhibiting mitochondrial gene expression.</a> Cell Death Differ. 19 (6), 968-979 (2012).</li><li>Jensen, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO3A+promotes+metabolic+adaptation+to+hypoxia+by+antagonizing+Myc+function.">FoxO3A promotes metabolic adaptation to hypoxia by antagonizing Myc function.</a> EMBO J. 30 (22), 4554-4570 (2011).</li><li>Ivascu, A., Kubbies, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+cell-mediated+adhesions+in+breast+cancer+spheroids.">Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids.</a> Int J Oncol. 31 (6), 1403-1413 (2007).</li><li>Bitler, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethality+by+targeting+EZH2+methyltransferase+activity+in+ARID1A-mutated+cancers.">Synthetic lethality by targeting EZH2 methyltransferase activity in ARID1A-mutated cancers.</a> Nat Med. 21 (3), 231-238 (2015).</li><li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9.">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nat Biotechnol. 33 (4), 390-394 (2015).</li></ol>

Open Access fees were supported by Nexcelom Bioscience, LLC.

תלת ממד דגמים של הסרטן שמתבצעים מועסקים ויותר להעריך את היעילות של תרכובות ידועות רומן אשר עוצבו להרוג באופן סלקטיבי תאי סרטן. Spheroids תאים סרטניים הם מבנים המציגים תנאים נוספים הדומים לאלה נתקל בגידולים in vivo, ובכך תרכובות גדלו יעילות 3D נוטים יותר להיות השפעה in vivo. עם זאת, שיטות אלו אינן מאפשרות זיהוי של מטרות רומן פוטנציאל שלא היו הנושא תכנון תרופות, שיכולה להיות להם יעילות רבה בטיפול בסרטן. פיתחנו גישה גנומיקה תפקודית siRNA שאיפשרו להשתקת גנים עמיד למשך עד שבעה ימים spheroids קו תאים סרטניים. ישנם מספר צעדים קריטיים בפרוטוקול הדורשים ייעול לפני מסך siRNA יכול להתבצע. היכולת ליצור spheroids קיימא לשחזור בקנה מידה גדול היא חיונית. יתר על כן,תנאי transfection ppropriate צריכים להיות מותאמים בקפידה. אנו ממליצים trialing מספר ריאגנטים transfection שונים עם זכויות שאינן מקנות מיקוד המתאים והרג שולטת לפני שתנסה המסך. הצלחנו להראות כי שורות תאים סרטניים כמה נפוץ השד, כלומר BT474, MCF10DCIS.com, מד&quot;א- MB-231 ו JIMT1 היו מקובל transfection siRNA. יתר על כן, אנו מספקים הוכחה של עיקרון נתונים ההקרנה 200 ביותר גנים שעברו מוטציה לעתים קרובות סרטן השד spheroids BT474, אישר את תלותם הגברה של HER2 מוטציה בשעור של PIK3CA. מעניין, השתקה של FOXO3 גורם שעתוק הביא לירידה בגודל אליפטית אך ללא השפעה משמעותית על כדאיות. FOXO3 ידוע להסדיר את התגובה היפוקסיה, לשנות את קיבולת המטבולית של תאי סרטן ומאפשר להם להסתגל ביתר קלות לסביבתם 16. תפקיד זה באופן פוטנציאלי יכול מפריעים לקריאת כדאיות התא כפי שהוא מזהה שפע ATP, אחד המוצרים העיקריים של חילוף חומרים בתא. בתמיכה של התצפית של צמצום גודל אליפטית, הוכיח כי השתקת FOXO3 ב הלה xenografts לקוי צמיחת גידול לאפופטוזיס 17. חשוב לציין כי חלק גנים עשויים להשפיע לרעה על יכולתו של תאים סרטניים שומרת על ארכיטקטורת 3D שלהם, אשר עלול לגרום חיוביות שגויות. לדוגמא, מציאה של E-cadherin הביאה לפירוק המבנה אליפטית BT474. זה בעבר דיווח באמצעות E-cadherin ממוקד נוגדנים 18. כמו עם כל פלטפורמת הקרנה, מטרות פוטנציאליות, יש rescreened להעריך את השחזור של האפקט שנצפה. ישנן מגבלות על הטכניקה, כלומר האופי הזמני של מציאת הגן בתיווך siRNA. מתמשכת השתקה יותר משבעה ימים לא היה בר השגה עם siRNA. היתרון של גישה זו הוא כי זה יכול להיות בשילוב עם סביבה אקולוגית שונה אחרתצבעי tric ולא רק במקומות להעריך כדאיות אליפטית, למשל, מתן מידע מרחבים של היפוקסיה אליפטית או ניטור תאים העוברים אפופטוזיס. יותר מכך, כיוון הסריקות קוראות צלחת יחסי מהירות ולא פולשנית, ההשפעה של siRNAs על גודל אליפטית ניתן להעריך לאורך זמן ולא רק בנקודת הסיום הניסיונית. ואכן, אנו בוחנים בימים אלה כמה אפיקים אלה נמצאים בצנרת ההקרנה שלנו. גישה חלופית אשר מנצלת תרבויות 3D לזהות תלות רומן היא השימוש בספריות כימיות המעכבות או מגוון רחב של מטרות או משפחות מסוימות של חלבונים. ואכן, Bitler et al. מנוצל גישה ממוקדת זו כדי לזהות את האינטראקציה הקטלנית הסינטתית בין מעמד ARID1A ומעכבי EZH2 ב קרצינומה תאים הברורה השחלות 19. התגלית של עריכת טכנולוגיה גנים CRISPR-Cas9 אפשרה גם לפיתוח מסכי גנטי בתרבויות organoid in vivo. עם זאת, לאגישתו תלויה שיש מתקני חיה מתאימים וניתן לעלות 20 מונע. לסיכום, אנו מאמינים כי גבשנו פרוטוקול בצורה מדויקת יותר מודלים הדרגתי חמצן וחומרי הזנה, שהן תכונות של microenvironment גידול in vivo, המאפשרות זיהוי של מטרות סרטן רומן או אימות חזקות של יעדים שנקבעו. יתר על כן, הפרוטוקול שלנו יכול להיות מיושם על כל סוג של שורת התאים המהווה spheroids ומכאן ניתן להשתמש באופן שגרתי דעה בקהילת חקר הסרטן למסכי siRNA תפוקה גבוהה.

גידולים מוצקים להציג היסטולוגית משמעותית, גנטי מייקרו-סביבתי ההטרוגניות תוך-גידול, המציג קלינאים עם אתגר משמעותי יכולת לטפל בחולים בהצלחה. רוב המודלים המשמשים לזהות רומן ממוקד טיפולים לא לשלב רב של תכונות אלה. אכן, טיפולים ממוקדים נוכחיים מנוצלים במרפאת פותחו בעשור האחרון העסיקו גישות הקרנה המסתמכות על שורות תאי הסרטן גדלות תחת דו ממדים (2D) תנאי תרבות. אמנם זה הביא הצלחות שונות, כגון מעכבי טירוזין קינאז קולטן, מתחוור כי מודלים מורכבים יותר של סרטן נדרשים להעריך במלואה את הגורמים התורמים שמניעים tumorigenesis in vivo ו להגדיל את מספר טיפולים חדשים שהופכים את המעבר מודלים פרה-קליניים ניסויים קליניים. יתר על כן, הוא מעריך כעת גם כי מערכות תרבות 2D מצליחות לשקףvivo התנהגות 1,2. לדוגמא, בגידולי vascularized גרועים, שכן ביקוש חמצן וחומרים מזינים במייקרו-הסביבה להצליח לספק, אזורים של משלוחים גבוהים ונמוכים לפתח. בנוכחות חמצן נמוך (היפוקסיה) אל תוך גידולים, כפי שזוהה על ידי מכתים immunohistochemical סעיפי גידול סמנים היפוקסי ותיקים כגון anhydrase פחמתית IX (קיי), עולה בקנה אחד עם תוצאות קליניות עניות בסרטן השד 3,4 תכונות שילוב לפיכך כגון היפוקסיה לתוך מודלי הקרנה עשויה לשפר את היכולת שלנו לגלות מטרות תרופה חדשניות כי תהיינה יעיל יותר in vivo. ואכן, בהצלחה מיקוד גידולים אגרסיביים המכילים היפוקסיה היא בעדיפות קלינית 5. שינוי של ההקרנה המסורתית 2D siRNA, בניסיון ליתר דיוק לשחזר אלמנטים של התנאים בהם נתקלים תאים סרטניים במיקרו-סביבה של הגידול, הוביל לזיהוי של מספר גנים הבבית כבר נמצא כחשוב לצמיחת גידול in vivo. אלה כוללים מסכי גנומית תפקודיים להתבצע בתנאים בסרום נמוכים 6, תנאי חוסר חמצן 7 ו בשילוב 8. לדוגמה, השתקת 6-Phosphofructo-2-קינאז / פרוקטוז-2,6-Biphosphatase 4 (PFKFB4), חלבון האחראי על ויסות הגליקוליזה הזנת פחמן, רק לאפופטוזיס בקווים סרטן הערמונית נגזר גרורות כאשר גדל בסרום נמוך. השתקת PFKFB4 בשורות תאי ערמונית נורמליות באותם תנאים לא הייתה השפעה, ואילו, דלדול של PFKFB4 לחלוטין ablated הצמיחה של שורת תאי סרטן ערמונית xenografts 6. בהרכב מורחב של שורות תאי סרטן השד, השתקת טרנספורטר מונה-carboxylase 4 (MCT4) הובילה מועדף להפחתת צמיחת שורת תאים בתנאים של רמות חמצן נמוכים. פגיעות זו קיבלה תוקף in vivo ב xenogra orthotropic קו תאי סרטן השדFTS. אולי הכי בולט, השתקה של synthetase Acetyl-CoA 2 (ACSS2), אנזים האחראי על ההפיכה תצטט לתוך אצטיל-CoA, מספר תאי סרטן מופחת בתנאי קיצון מזין (חמצן נמוך בדם) אבל היה מעט או ללא השפעה בתנאי תרבות הנורמליות 8. אבלציה של ACSS2 השפיעו על הצמיחה של xenografts סרטן השד והערמונית דבר המצביע על כך שהפרשי מזין אינם קיימים בבידוד במיקרו-סביבה של הגידול וכי תאים הנמצאים באזורים אלו חיוניים התקדמות הגידול 8. יתר על כן, ACSS2 נמצאה גם להיות חשוב גליובלסטומה קרצינומה hepatocellular 9,10, דבר המצביע על כך פעילות ACSS2 מוגברת בגידולים יכול להיות מנגנון יסודי התומכת בצמיחה בתנאים נחותים. ככלל, מחקרים אלה מוכיחים כי משחזרת התנאים נתקלו in vivo וביצוע מסכי siRNA מאפשרת זיהוי של gEnes חיונית להישרדות סרטן. כמו גם להשפיע על גדילת תאים סרטניים 2D בתנאי קיצון מזין, דלדול של גני מטרה במחקרים אלה מעכבות צמיחה אליפטית קו תאים סרטניים, שיקוף מה נצפתה xenografts הגידול 6,8. לפיכך, spheroids קו תאים סרטניים מכילים כמה מן התנאים נתקל במיקרו-סביבה של הגידול המקנים רגישות השתקה ACSS2. ואכן, spheroids להציג הדרגתיים מזינים (סרום וחמצן), שינויים ב- pH, תלת ממדי (3D) קשר בין תאים, אלא גם, שינויי חישת שגשוג עם תאים שעברו עיכוב מחזור תא אפופטוזיס. זה בא לידי ביטוי על ידי נוכחות spheroids סרטן של אזורים נמקי, תכונה לא נמצא בתרבות 2D המסורתית. spheroids תאים סרטניים כבר שימשו מודלים רלוונטיים יותר ביולוגית להקרין מעכבי מולקולה קטנה אבל זה מאפשר רק עבור אימות של יעילות מתחם או repurposing של רכיבי מדיהunds במקור לעצב עבור מחלות אחרות 11. שיטות הקרנה אליפטית נוכחיות אינן מאפשרות הניתוח של דלדול גן ספציפי בתוך תפוקה גבוהה של אופן גבוה תוכן. כאן אנו מתארים בפעם הראשונה, צינור גנומיקה תפקודית לחשיפת תלות גן ספציפי ניצול RNA התערבות קטנה (siRNA) הטכנולוגיה spheroids קו תאים סרטניים. עצבנו ספרייה העידה עם siRNAs מיקוד 200 הגנים שעברו מוטציה בתדירות הגבוהה ביותר של סרטן השד אנושי הערכתי את ההשפעה של דלדול גן על גודל אליפטית ופעילות מטבולית spheroids סרטן שד BT474. הצלחנו וחסונה ו reproducibly לזהות את ההשפעה של ERBB2 ו PIK3CA השתקה בתרבויות 3D. יתר על כן, אנחנו יכולים להעריך את ההשפעה של דלדול הגן על ארכיטקטורת מרחבית של spheroids BT474 באמצעות אימונוהיסטוכימיה.

<table><tbody><tr><td>Lullaby</td><td>Oz Biosciences</td><td>LL70500&amp;nbsp;</td><td>lipid-based transfection reagent</td></tr><tr><td>Viromer</td><td>Lipocalyx</td><td>VB-01LB-01</td><td>virus-like polymer transfection reagent</td></tr><tr><td>Ultra-low attachment plate</td><td>Corning</td><td>CLS7007</td><td>96 well plate</td></tr><tr><td>Foil plate seals</td><td>ThermoFisher</td><td>AB-0626</td><td></td></tr><tr><td>Luminescent cell viability dye</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td>CellTitre-Glo</td></tr><tr><td>Pipette tips (200 &amp;#956;L)</td><td>Starlab</td><td>S1111-0806</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips (10 &amp;#956;L)</td><td>Starlab</td><td>S1111-3800</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips (1, 000 &amp;#956;L)</td><td>Starlab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.025</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (10 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.025</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (25 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1685.020</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Media</td><td>GIBCO</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>GIBCO</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>GIBCO</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Feta bovine serum</td><td>GIBCO</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>Cherry picked library</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counter</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Cell counting chamber slides</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Celigo S</td><td>Nexcelom</td><td>contact company</td><td></td></tr><tr><td>Victor X5</td><td>Perkin Elmer</td><td>contact company</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert Inverted brightfield microscope</td><td>Zeiss</td><td>contact company</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; Incubator</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mulitichannel pipette</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilizing functional genomics screening to identify potentially novel drug targets in cancer cell spheroid cultures

זיהוי של אירועי נהג תפקודיים בסרטן הוא מרכזי בקידום ההבנה שלנו של ביולוגית הסרטן והכרחי על הגילוי של הדור הבא של מטרות תרופה חדשניות. זה נהיה ברור כי מודלים מורכבים יותר של סרטן נדרשים להעריך במלואה את הגורמים התורמים שמניעים tumorigenesis in vivo ולהגדיל את היעילות של טיפולים חדשניים שהופכים את המעבר ממודלים טרום קליניים ניסויים קליניים. כאן אנו מציגים מתודולוגיה להפקה spheroids גידול אחיד לשחזור שניתן נתון ההקרנה פונקציונלית siRNA. spheroids אלה מפגינים מאפיינים רבים הנמצאים בגידולים מוצקים שאינם נוכחים בתרבות דו מימד המסורתית. אנו מראים כי שורות תאים כמה נפוץ סרטן השד ניתן בפרוטוקול זה. יתר על כן, אנו מספקים הוכחה של עיקרון נתוני ניצול BT474 שורת תאי סרטן השד, מאשר שלהםהתלות הגברה של הקולטן לגורם הצמיחה אפידרמיס HER2 ו מוטציה של phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) כאשר גדל כמו spheroids הגידול. לבסוף, אנו מסוגלים לבדוק את העניין לעומק ולאשר את ההשפעה המרחבית של תלות אלה באמצעות אימונוהיסטוכימיה.

מבחני אליפטית בהתקשרות אולטרה-נמוכה 96-גם הצלחות לספק הערכה פנוטיפי תפוקה גבוהה עבור oncogenicity פוטנציאל בהקשר זה יותר בקלות משחזר את התנאים הפיזיולוגיים נמצא בסרטן in vivo. אכן, שורות תאי הסרטן MCF10DCIS.com וצורת BT474 מבנים אליפטית חזקים (איור 1 א) וחקירת immunohistological סעיפים אליפטית הראו שינויים מובחנים במורפולוגיה הסלולר גרעינית. במשך הזמן, כמה spheroids כגון spheroids BT474 לפתח אזורים נמקי, תכונה משותפת של גידולים מוצקים אגרסיבי (איור 1B). Spheroids מסוימת אינה לפתח ליבות נימקים, כגון קו הסלולרי מד&quot;א- MB-231, אבל לעשות תצוגת וריאציה מסומנת בסמן השגשוג Ki67, אשר ביחס הפוכים בקורלציה עם ביטוי caspsase -3 בקע, סמן של אפופטוזיס (איור 1 ג). כדי לקבוע כי שורות תאים מרובים הם אכן רג&#39;פמגני אוזניים כדי BT474 להשתקת גנים בתיווך siRNA, MCF10DCIS.com, מד&quot;א- MB-231 ותאי JIMT1 היו transfected הפוכה עם siRNA במשך שבעה ימים. הנוכחות של מגיב transfection (מדומה) או transfection של siRNAs מלאה לא הייתה השפעה על כדאיות אליפטית, תוך השתקה של הגן חיוני יוביקוויטין B (UBB) הכדאיות אליפטית הקטינה באופן משמעותי בכל שורות תאים שנבדקו (איור 1D). עצבנו ספריית siRNA אנושית שהקיפה את הגנים שעברו מוטציה בתדירות הגבוהה ביותר שלא נבחר, ER +, HER2 + וסוגי סרטן שד שלילי לשלושה סמנים. ספריה זו כוללת גנים של פונקציה ידועה, כגון MYC, PIK3CA ו TP53 ואלה שתרומתם סרטן אינו מבוסס דיו. המסך כולל גם מספר siRNAs השליטה הלא מיקוד (בקרת # 1, בקרת # 2) ו siRNAs מיקוד גנים חיוניים, כגון PLK1 ו UBB, אשר פועלים כמו הרג שולטת (טבלה 1). בחרנו להשתמש canc השדאה שורות תאי BT474 כפי שהם יוצרים קושי spheroids ללא תוספת של קרום במרתף מחדש, מוקמות שורות תאי סוס עבודה ויש ארכיטקטורת גנומי ידועה. לדוגמא, תאי BT474 הם חיוביים עבור קולטן אסטרוגן (ER +), ביטוי היתר לקולטן גורם הגדילה באפידרמיס אדם 2 (HER2 +) ומוטציות נמל TP53 (E285K) ו PIK3CA (K111N) 13. העסקת הפרוטוקול שתואר לעיל, אנו פיקוח דלדול גן ההשפעה היה על גודל כדאיות אליפטית לאחר שבעה ימים של transfection ההפוכה siRNA (האיור 1E). מעניין לציין, כי רוב הגנים לא להיות השפעה מהותית על תחום אליפטית או כדאיות (איור 2 א). השתקת FOXO3, PIK3CA, ERBB2 ו SF3B1, הביא לקיטון לשחזור המשמעותי ביותר גודל אליפטית. הפחתה זו נצפתה גם כדאיות אליפטית לאחר השתקת ERBB2 ו SF3B1. בנימה מעודדת, אנו confirmed השפעת PIK3CA, ERBB2 ו SF3B1 השתקה על גודל אליפטית באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 2 ב). כבר זיהינו SF3B1 כמו גן חיוני במודלים שורת תאים רבים ובכך siSF3B1 מייצג פקד הרג טוב בנוסף UBB 14. מעניין לציין, כי כל 200 גנים בלבד והשתקת E-cadherin הביאה לעלייה משמעותית הכדאיות אליפטית (איור 2 א). חקירת מורפולוגיה אליפטית הראתה כי E-cadherin השתקה הביאה פירוט מלא של אדריכלות אליפטית, עם תאי קיימא הנשענים על הקרקעית של הקובץ המצורף הנמוך היטב (איור 2 ב). reinvestigation הידני של נתוני מסך נפח אליפטית הראה כי גם זה נצפה אבל שנוטרל מן כימות באזור בשל חפץ להיות מעל מגבלות גודל סט. מודגש כמו בעבר, תאי BT474 overexpress טירוזין קינאז קולטן HER2 נמל מוטציה שבעור ב<html> PIK3CA (K111N). אנו מאשרים כי השתקת ERBB2 ו PIK3CA הביאה כדאיות אליפטית מופחתת ואילו transfection עם פקדים ללא מיקוד לא הייתה השפעה (איור 2 ג). הבא חקרנו את ההשפעה של דלדול siRNA על היסטולוגיה אליפטית. spheroids BT474 היו transfected הפוכה עם siRNA השליטה הלא מיקוד siRNAs מיקוד PIK3CA, ERBB2 ו UBB. השתקת ERBB2 ו UBB הביאה לירידה של הסמן פרו-שגשוג Ki67 לעומת שליטת siRNA (איור 2 ד). ההפעלה של הסמן פרו-אפופטוטיים בקעה caspase-3 נצפה רק לאחר השתקת UBB, הדבר המצביע על דלדול של HER2 ו PIK3CA לא לגרום אפופטוזיס אבל היה cytostatic ולא ציטוטוקסיות. ואכן, השתקת HER2 ו PIK3CA לא לגרום לעלייה בביטוי חלבון של p27 חלבון מעצר התא מחזור לעומת שליטה spheroids transfected. אף אוזן גרון &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; יחדיו, תוצאות אלה מראים כי תאי BT474 מונעים על ידי בשעור HER2 ו PIK3CA איתות כאשר גדל כמו spheroids 3D יתרה מכך, תוצאות אלו מראים כי אפשר. לתכנן וליישם ספריית הקרנת siRNA העידה של מאה גני spheroids קו תאים סרטניים וחסון ו reproducibly. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54738/54738fig1.jpg" /> איור 1: אופטימיזציה Cell קו לצמיחת 3 ממדים. א שורות תאי סרטן השד, MCF10DCIS.com ו BT474 היו בתרבית צלחות מצורפות נמוכות למשך 7 ימים. תמונות מייצגות Brightfield נלקחו באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. ב MCF10DCIS.com ו spheroids BT474 היו בתרבית במשך 28 ימים. 100 μL של תקשורת הטריה היה מתחדש כל 3 - 4 ימים. Spheroids היה קבוע 3.8% פורמלדהיד, דוארmbedded, מחולק ומוכתמים hematoxylin ו eosin (H &amp; E). נציג תמונות מוצגות בהגדלה נמוכה וגבוהה. ברי סולם מייצגים 100 מיקרומטר ו 33 מיקרומטר, בהתאמה. ג spheroids מד&quot;א- MB-231 היו בתרבית במשך 21 ימים. 100 μL של תקשורת הטריה היה מתחדש כל 3 - 4 ימים. Spheroids תוקנו בפורמלין 3.8%, מוטבע, מחולק ומוכתם Ki67 ו ביקע caspase-3. נציג תמונות מוצגות. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. ד BT474, MCF10DCIS.com, מד&quot;א- MB-231, ו JIMT1 שורות תאים היו transfected הפוכות עם (מגיב transfection בלבד) המדומה ואת siRNAs המלא UBB, צלחות מצורפות נמוכות במיוחד היו הסתחררו יוצרי spheroids. בינוני טרי (100 μl) נוספה בימים 1 ו- 4. לאחר 7 ימים, כדאיות התא היה לכמת. נתונים מייצגים את הממוצע ± סטיית התקן של שני משכפל ביולוגי עצמאי בוצע בשלושה עותקים המנורמלים לשלוט # 1. מובהקות סטטיסטיות חושבו באמצעות unpaסטודנטים IRED מבחן t (p &lt;0.05). א תרשים זרימה המסכם את פרוטוקול transfection הפוכה נהג לחקור תלות גן פונקציונלי spheroids קו תאים סרטניים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54738/54738fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54738/54738fig2.jpg" /> איור 2: חקירת הגנום פונקציונלי של תלות בשעור חושף BT474 Spheroids. תאי א BT474 היו transfected הפוכות עם ספריית siRNA siGENOME אדם 200-גן בשלושה עותקים. גודל ואת הכדאיות אליפטית נצפו. ערכים נתונים גולמיים היו מנורמל ו- Z-score החציוני צלחת חושבו לזהות חריגות משמעותיות יותר מאשר 1.7x סטיית התקן של צלחת 15 החציוני. הערה גנים הפריפריה ERBB2, SF3B1, PLK1 ו UBBnd E-CAD. siRNAs כי גדל באופן משמעותי או מופחת באזור ואת כדאיות אליפטית מוצללות בצבעים כחול ואדום, שבו אדום מתאר את השליטה siRNA. תאים ב היו transfected הפוכות עם שליטה ללא מיקוד, E-cadherin (E-CAD), PIK3CA, ERBB2 או UBB siRNA ואז הסתובבו צלחת מצורפת נמוכה במיוחד כדי ליצור spheroids. לאחר 7 ימים, Brightfield תמונות אליפטית נציג נלקחו באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. תאי ג היו transfected הפוכות עם ללא מיקוד שליטה, PIK3CA, ERBB2 או UBB siRNA ואז הסתובבו צלחת מצורפת נמוכה במיוחד כדי ליצור spheroids. לאחר 7 ימים, כדאיות התא היה לכמת. נתונים מייצגים את הממוצע ± סטיית התקן של שני משכפל ביולוגי עצמאי בוצע בשלושה עותקים המנורמלים לשלוט # 1. המובהקות הסטטיסטית חושבה באמצעות מבחן t-מזווג סטודנטים (p &lt;0.05). ד לאחר 7 ימים, spheroids שתוקן, מוטבע, מחולק ומוכתםעבור H &amp; E, Ki67, ביקע caspase-3, ו p27. נציג תמונות מוצגות. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. הערה H &amp; E של spheroids siControl להיראות קטנות יותר עקב artefact של spheroids עיבוד הפרט ללא פגע שנבחר מכתים. עם זאת אין בכך כדי לגרוע מן השינויים שנצפו עם התמונות הסרוקות ותוצאות כדאי תא. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54738/54738fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> ללא מיקוד 1 </td><td> TP53 </td><td> DST </td><td> KMT2C </td><td> מטופל 1 </td><td> FCGBP </td><td> ARID1B </td><td> FBXM7 </td><td> TTC40 </td><td> ללא מיקוד 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> GATA3 </td><td> TTN </td><td> MUC12 </td><td> MUC4 </td><td> AHNAK </td><td> HUWEI1 </td><td> DNAH11 </td><td> ITPR2 </td><td> ABCA13 </td><td> CREBBP </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MAP2K4 </td><td> PIK3CA </td><td> F5 </td><td> apoB </td><td> ANKRD30A </td><td> MUC17 </td><td> DNAH17 </td><td> LAMA2 </td><td> אֵס </td><td> CSMD2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> STARD9 </td><td> USH2A </td><td> FAT3 </td><td> LPR2 </td><td> CSMD3 </td><td> MYO18B </td><td> DNAH5 </td><td> MDN1 </td><td> ARHGAP5 </td><td> DNAH9 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CXCR3 </td><td> MUC16 </td><td> RB1 </td><td> PKHD1L1 </td><td> DNAH2 </td><td> SYNE2 </td><td> DYNC1H1 </td><td> PCLO </td><td> CACNA1B </td><td> ERBB2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> PLK1 </td><td> SYNE1 </td><td> LYST </td><td> PTEN </td><td> SPTA1 </td><td> מטופל 2 </td><td> VHL </td><td> RYR1 </td><td> COL6A3 </td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> ללא מיקוד 1 </td><td> ENAM </td><td> RYR2 </td><td> BRCA2 </td><td> מטופל 1 </td><td> FMN2 </td><td> HECW1 </td><td> LAMB4 </td><td> סִי </td><td> ללא מיקוד 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> FHOD3 </td><td> MACF1 </td><td> RYR3 </td><td> C2ORF16 </td><td> DMD </td><td> FRG1 </td><td> HERC2 </td><td> MYH11 </td><td> STAB1 </td><td> ZDBF2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> GOLGA6L2 </td><td> חוֹד </td><td> SMG1 </td><td> CACNA1E </td><td> DNA14 </td><td> GCC2 </td><td> HIVEP2 </td><td> NIPBL </td><td> TANC1 </td><td> ZNF536 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> HMCN1 </td><td> NF1 </td><td> UBR5 </td><td> CACNA1F </td><td> DYNC2H1 </td><td> GON4L </td><td> HYDIN </td><td> PKD1L1 </td><td> TF </td><td> ANK3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> HRNR </td><td> OBSCN </td><td> USP34 </td><td> CYMA5 </td><td> FAM208B </td><td> GPR112 </td><td> ITSN2 </td><td> RNF213 </td><td> TPR </td><td> ASPM </td><td></td></tr><tr><td></tד&gt; <td> PLK1 </td><td> PCDH15 </td><td> XIRP2 </td><td> COL7A1 </td><td> FLG2 </td><td> מטופל 2 </td><td> VHL </td><td> SAGE1 </td><td> UNC80 </td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> ללא מיקוד 1 </td><td> DCHS2 </td><td> MUC5B </td><td> ZFHX4 </td><td> מטופל 1 </td><td> MYO9A </td><td> SPHKAP </td><td> CXORF22 </td><td> NCOR1 </td><td> VPS13D </td><td></td></tr><tr><td></td><tד&gt; ATR </td><td> DMXL2 </td><td> MXRA5 </td><td> ANK2 </td><td> KIAA1210 </td><td> PRUNE2 </td><td> &quot;טש </td><td> DANH6 </td><td> NOTCH2 </td><td> ANKRD12 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> BIRC6 </td><td> DNAH10 </td><td> TENM1 </td><td> כַּספּוֹמָט </td><td> LRP1 </td><td> SCN10A </td><td> VPS13C </td><td> DNAH7 </td><td> SPEN </td><td> C5ORF42 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CDH1 </td><td> DNAH3 </td><td> PEG3 </td><td> DIDO1 </td><td> MAP1A </td><td> SCN2A </td><td> IPTR3 </td><td> ERBB3 </td><td> SRRM2 </td><td> CCDC88A </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CUBN </td><td> NOCK11 </td><td> RELN </td><td> DNAH8 </td><td> MED12 </td><td> SHROOM2 </td><td> CEP350 </td><td> FAT4 </td><td> SZT2 </td><td> CHD4 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> PLK1 </td><td> EYS </td><td> שקי </td><td> KIAA1109 </td><td> MED13 </td><td> מטופל 2 </td><tד&gt; VHL </td><td> KMT2A </td><td> VPS13A </td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> ללא מיקוד </td><td> QSER1 </td><td> ARID1A </td><td> WDFY3 </td><td> מטופל 1 </td><td> SDK1 </td><td> TEX15 </td><td> LAMA1 </td><td></td><td> ללא מיקוד 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> COL14A1 </td><td> SHROOM3 </td><td> ATRX </td><td> EFCAB5 </td><td> SF3B1 </td><td> CBFB </td><td> AHNAK2 </tד&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> CSMD1 </td><td> TBX3 </td><td> KIAA0947 </td><td> FOXA1 </td><td> ITPR1 </td><td> DDX3X </td><td> KIF4A </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> MEFV </td><td> UBR4 </td><td> MYCBP2 </td><td> INPPL1 </td><td> FLG </td><td> HECTD4 </td><td> FAT2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> MGAM </td><td> Vcan </td><td> NBEAL1 </td><td> MAP3K1 </td><td> AKAP9 </td><td> GPR98 </td><td> FOXO3 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> PLK1 </td><td> ZNF462 </td><td> SETX </td><td> NRP1 </td><td> HERC1 </td><td> מטופל 2 </td><td> VHL </td><td></td><td></td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></tד&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1: פריסה פלייט ו- Human siRNA הספרייה דה-קונבולוציה. הטבלה מכילה את התוכן של כל ברכות siRNA והפריסה עבור הצלחות המצורפות הנמוכות המשמשות במסך.

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures at JoVE.com

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

ניצול הקרנת Genomics פונקציונלית כדי לזהות מטרות תרופה חדשנית פוטנציאלי תרבויות אליפטית תא סרטני

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

utilizing-functional-genomics-screening-to-identify-potentially-novel

Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.3K Views.  The Institute of Cancer Research. Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

Video: Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated cancer associated fibroblasts are a key component of the tumor stroma that interact with cancer cells and support their growth and survival. Models that recapitulate the interaction of cancer cells and activated fibroblasts are important tools for studying the stromal biology and for development of antitumor agents. Here, a method is described for the rapid generation of robust 3-dimensional (3D) spheroid co-culture of pancreatic cancer cells and activated pancreatic fibroblasts that can be used for subsequent biological studies. Additionally, described is the use of 3D spheroids in carrying out functional metabolic assays to probe cellular bioenergetics pathways using an extracellular flux analyzer paired with a spheroid microplate. Pancreatic cancer cells (Patu8902) and activated pancreatic fibroblast cells (PS1) were co-cultured and magnetized using a biocompatible nanoparticle assembly. Magnetized cells were rapidly bioprinted using magnetic drives in a 96 well format, in growth media to generate spheroids with a diameter ranging between 400-600 &#181;m within 5-7 days of culture. Functional metabolic assays using Patu8902-PS1 spheroids were then carried out using the extracellular flux technology to probe cellular energetic pathways. The method herein is simple, allows consistent generation of cancer cell-fibroblast spheroid co-cultures and can be potentially adapted to other cancer cell types upon optimization of the current described methodology.

Here, a method is described for the preparation of 3-dimensional (3D) spheroid co-culture of pancreatic cancer cells and fibroblasts, followed by measurement of metabolic functions using an extracellular flux analyzer.

הכנה ואת וזמינותו מטבולית של תרבויות המשנה ספרואיד תלת-ממדי של תאי סרטן הלבלב ו Fibroblasts

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is exposed to in vivo. Solid tumors grow not as a sheet attached to plastic, but instead as a collection of clonal cells in a three-dimensional (3D) space interacting with their neighbors, and with distinct spatial properties such as the disruption of normal cellular polarity. These interactions cause 3D-cultured cells to acquire morphological and cellular characteristics which are more relevant to in vivo tumors. Additionally, a tumor mass is in direct contact with other cell types such as stromal and immune cells, as well as the extracellular matrix from all other cell types. The matrix deposited is comprised of macromolecules such as collagen and fibronectin.
In an attempt to increase the translation of research findings in oncology from bench to bedside, many groups have started to investigate the use of 3D model systems in their drug development strategies. These systems are thought to be more physiologically relevant because they attempt to recapitulate the complex and heterogeneous environment of a tumor. These systems, however, can be quite complex, and, although amenable to growth in 96-well formats, and some now even in 384, they offer few choices for large-scale growth and screening. This observed gap has led to the development of the methods described here in detail to culture tumor spheroids in a high-throughput capacity in 1536-well plates. These methods represent a compromise to the highly complex matrix-based systems, which are difficult to screen, and conventional 2D assays. A variety of cancer cell lines harboring different genetic mutations are successfully screened, examining compound efficacy by using a curated library of compounds targeting the Mitogen-Activated Protein Kinase or MAPK pathway. The spheroid culture responses are then compared to the response of cells grown in 2D, and differential activities are reported. These methods provide a unique protocol for testing compound activity in a high-throughput 3D setting.

Across a wide variety of disease indications, more physiologically relevant models are being developed and implemented into drug discovery programs. The new model system described here demonstrates how three-dimensional tumor spheroids can be cultured and screened in a high-throughput 1536-well plate-based system to search for new oncology drugs.

מהדור בתפוקה גבוהה תלת מימדי הגידול Spheroids להקרנה סמים

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of anti-cancer therapeutics in a physiologically representative microenvironment. We outline the formation of patient derived cancer stem cell spheroids, as well as, the manipulation of these spheroids for thorough analysis following drug treatment. Specifically, we describe collection of spheroid morphology, proliferation, viability, drug toxicity, cell phenotype and cell localization data. This protocol focuses heavily on analysis techniques that are easily implemented using the 384-well hanging drop platform, making it ideal for high throughput drug screening. While we emphasize the importance of this model in ovarian cancer studies and cancer stem cell research, the 384-well platform is amenable to research of other cancer types and disease models, extending the utility of the platform to many fields. By improving the speed of personalized drug screening and the quality of screening results through easily implemented physiologically representative 3D cultures, this platform is predicted to aid in the development of new therapeutics and patient-specific treatment strategies, and thus have wide-reaching clinical impact.

This protocol describes generation of patient-derived spheroids, and downstream analysis including quantification of proliferation, cytotoxicity testing, flow cytometry, immunofluorescence staining and confocal imaging, in order to assess drug candidates&#8217; potential as anti-neoplastic therapeutics. This protocol supports precision medicine with identification of specific drugs for each patient and stage of disease.

החולה הפיזיולוגי הנגזרות 3D Spheroids עבור הקרנת תרופות אנטי-נאופלסטית כדי למקד את תאי גזע הסרטן

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

הערכת הכדאיות תא ומוות ב 3D בתרבויות ספרואיד של תאים סרטניים

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

הפקה רובוטית של תאי סרטן Spheroids עם מערכת מימית שני שלבים לבדיקת סמים

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Bioengineering

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

קביעת ספרואידים תלת מימדיים מדגימות גידול שמקורן בחולה והערכת רגישותם לתרופות

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the evaluation of anticancer drugs. However, the conventional culture methods lack the ability to manipulate the tumor spheroids in a homogeneous manner at the three-dimensional level. To address this limitation, in this paper, we present a convenient and effective method of constructing average-sized tumor spheroids. Additionally, we describe a method of image-based analysis using artificial intelligence-based analysis software that can scan the whole plate and obtain data on three-dimensional spheroids. Several parameters were studied. By using a standard method of tumor spheroid construction and a high-throughput imaging and analysis system, the effectiveness and accuracy of drug tests performed on three-dimensional spheroids can be dramatically increased.

This article demonstrates a standardized method for constructing three-dimensional tumor spheroids. A strategy for spheroid observation and image-based deep-learning analysis using an automated imaging system is also described.

יצירת ספרואידים תלת ממדיים להערכת תרופות

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

סריקה בקנה מידה גנומי לזיהוי והשוואה של מטרות טיפוליות בגידולים

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome neurofibromatosis type 1 (NF1), MPNSTs are the most common malignancy and the leading cause of death. These rare and aggressive soft-tissue sarcomas offer a stark future, with 5-year disease-free survival rates of 34-60%. Treatment options for individuals with MPNSTs are disappointingly limited, with disfiguring surgery being the foremost treatment option. Many once-promising therapies such as tipifarnib, an inhibitor of Ras signaling, have failed clinically. Likewise, phase II clinical trials with erlotinib, which targets the epidermal growth factor (EFGR), and sorafenib, which targets the vascular endothelial growth factor receptor (VEGF), platelet-derived growth factor receptor (PDGF), and Raf, in combination with standard chemotherapy, have also failed to produce a response in patients. 
In recent years, functional genomic screening methods combined with genetic profiling of cancer cell lines have proven useful for identifying essential cytoplasmic signaling pathways and the development of target-specific therapies. In the case of rare tumor types, a variation of this approach known as cross-species comparative oncogenomics is increasingly being used to identify novel therapeutic targets. In cross-species comparative oncogenomics, genetic profiling and functional genomics are performed in genetically engineered mouse (GEM) models and the results are then validated in the rare human specimens and cell lines that are available. 
This paper describes how to identify candidate driver gene mutations in human and mouse MPNST cells using whole exome sequencing (WES). We then describe how to perform genome-scale shRNA screens to identify and compare critical signaling pathways in mouse and human MPNST cells and identify druggable targets in these pathways. These methodologies provide an effective approach to identifying new therapeutic targets in a variety of human cancer types.

מחבר זרקור: מציאת מטרות טיפוליות חדשות לגידול ממאיר במעטפת העצבים ההיקפית באמצעות מסכי shRNA בקנה מידה גנומי 

We have developed a cross-species comparative oncogenomics approach utilizing genomic analyses and functional genomic screens to identify and compare therapeutic targets in tumors arising in genetically engineered mouse models and the corresponding human tumor type.

פרופיילינג גנטי וסינון נשירה בקנה מידה גנומי לזיהוי מטרות טיפוליות במודלים עכבריים של גידול ממאיר במעטפת עצב היקפית

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome ...

ניצול הקרנת Genomics פונקציונלית כדי לזהות מטרות תרופה חדשנית פוטנציאלי תרבויות אליפטית תא סרטני

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST