TB מודה מלגת מחקר מקנדה סיסטיק פיברוזיס.

שים לב מועצת האתיקה מחקר (REB) נדרש לאסוף ולאחסן דגימות כיח מ בבני אדם. מחקרים אלה אושרו על ידי בית החולים לילדים REB # 1000019444. 1. הכנת דוגמאות כיח CF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף מדגם ליחה מחול במהלך ביקורים שיגרתי במרפאת סיסטיק פיברוזיס ולשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הובלת ליחה המדגם על הקרח במהלך השעה הראשונה של האוסף, למעבדת מחקר, לעבור עיבוד. </li></ol> 2. עיבוד כיח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את עוצמת הקול של מדגם הליחה שהושג. להוסיף בופר פוספט (PBS) כדי 2x היקף המדגם (כלומר, 2 חלקים PBS, מדגם חלק 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את המדגם היטב עם טפטפת ההעברה. וורטקס המדגם על ההגדרה הגבוהה ביותר עבור 1 דקות לערבב לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 1 מ&quot;ל של תערובת הנ&quot;ל לתוך הצינורות מספר 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge המתאים ומסובב ב 5000 XG עבור20 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה, להסיר את supernatant וזורקים את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן לעקר את supernatant דרך פילטר 0.22 מיקרומטר ולאסוף בתוך שפופרת microcentrifuge נקי. הערה: עקרות של תסנין נבחנות על ידי ציפוי על אגרת LB וכך גם ייחס תקשורת נוזלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן supernatant כיח ב -80 ° C לשימוש עתידי. הערה: כיח מחולים רבים יכולים גם להיות ונקווה לאחר סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש, לדלל כיח תסנין 1/10 V / V (100 μl של ליחה, 900 μl של תקשורת) בתקשורת רצויה. הערה: כאן, lysogeny מרק סטנדרטי (LB) בתקשורת היה בשימוש. </li></ol> 3. תאיים coverglass שיטה ליצירת biofilm <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול לבודד בקטריאלי של לילה עניין התקשורת הרצוי על 37 מעלות צלזיוס עם רועד (200 סל&quot;ד). הערה: מספר חיידקים שונים שימשו, כולל קליני מבודד Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Burkholderia מורכבים cepacia ו Achromobacter xylosoxidans. בחירה של תקשורת תלוי זנים ותנאי ריבית, אולם תקשורת LB יכולה לשמש בניסויים ראשוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתרבים הלילה, להציב 40 μl של התרבות לתוך 4 מיליליטר של תקשורת הטריה לגדול במשך 3-4 שעות ב 37 ° C עם רועד (200 סל&quot;ד) להשיג תרבות עם צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600) של כ 0.5 -0.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תרבות משלב 3.2 ל 1/5 במדיה הרצויים עם 10% כיח תסנין או ללא תסנין ליחה (כמו שליטה). ריכוז אחר של תסנין כיח ניתן לבדוק (כלומר, 50% או 100%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 200 μl של דילול זרע בארות של תאי שקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לחיידקים לצרף במשך 4 שעות ב 37 ° C בלי לרעוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 שעות, להסיר את התקשורת לשטוף בעדינות את biofilm עם תקשורת הטריה 1x. חלף עם 200 μl תקשורת טריה. הערה: כדי לחקור את ההשפעות של ליחה על ביופילם, את fresh התקשורת צריכה לכלול supernatant ליחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר biofilms לגדול במשך פרק הזמן הרצוי על 37 מעלות צלזיוס ללא רעד, החלפת התקשורת בכל 12 שעות, בלי לשטוף עד הפעם עבור במיקרוסקופ. הערה: כדי לחקור את ההשפעה של supernatants כיח על רגישות לאנטיביוטיקה ביופילם, אנטיביוטיקה מתווספת המדיה הבאות 24 שעות של צמיחת biofilm ומתוחזקים בתקשורת עד מכתים והדמיה של biofilms. </li></ol> Biofilms מכתים 4. מיקרוסקופית Confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות זמן צמיחה רצוי (HR 24-48 עובד הכי טוב), להסיר תקשורת מבארת קאמרי לשטוף בעדינות כל תא פעמים עם 300 μl של PBS סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין תערובת מכתימה עבור ביופילם על ידי ערבוב 1 μl של כל צבע (המסופק בערכה הכדאית) עבור כל מיליליטר של פתרון הנדרש. הפוך צבע בתמיסת מים או תקשורת. הערה: מים מומלצים על ידי היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של תערובת לצבוע היטב כל תאיים coverglass דגירה בטמפרטורת החדר, בחושך במשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור תערובת מכתימה מהלשכה ולשטוף היטב עם כל 300 μl של PBS סטרילית. הסר PBS ולהחליף עם מים או תקשורת טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך עם ויזואליזציה של biofilms באמצעות מיקרוסקופיה confocal. </li></ol> 5. חזותי Biofilms עם מיקרוסקופית Confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרא biofilms מוכתם בתאי מיד לאחר מכתים (בתוך שעה 1). מזער את העיכוב להדמיה של השקופיות על ידי צביעת 1 עד 2 תאים 8-גם בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הדמיה באמצעות מיקרוסקופ confocal עם לייזרים לערכות עירור מסנן עבור הרכישה. הערה: כאן, confocal הדיסק מסתובב המערכת עם לייזרים זוהרים ספקטרלי (גרין: 491nm, אדום: 561 ננומטר) שמשה עירור. סינוני פליטת 515/40 ו 624/40 שמשו כדי להמחיש את הכתמים מתוך ההערכה הכדאית ביופילם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונות באמצעות מטרת מי 25x על מיקרוסקופ confocal עם מצלמה. </li><li&gt; השתמש Z- ערימות מנת ליצור מודל של ביופילם. צלמו תמונות בכל 0.5-1 מיקרומטר החל מהמטוס ב-המוקד הראשון למסגרת פוקוס האחרון של ביופילם (בדרך כלל פורש 30-80 מיקרומטר עבור 48 biofilms hr) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 3-5 תמונות מכל טוב. הערה: כך עבור 8 גם מחולק לתאי coverglass, 24-40 תמונות תופקנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור תמונות לניתוח. הערה: התמונה צריכה להיות נשמר כמו שת-TIFF קבצים לנתח באמצעות לסטטמ&quot;מ 18,19. הוראות לניתוח תמונה biofilm ניתן למצוא בכתובת http://www.comstat.dk/. ברגע תמונות מיובאות, פרמטרים כגון עובי ממוצע, ביומסה כיסוי שטח לכל ערוץ (אדום וירוק) ניתן לנתח. </li></ol>

<ol>
	<li>Beaudoin, T., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+with+biofilm+formation:+selection+of+antimicrobials+and+role+of+prolonged+antibiotic+therapy.">Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy.</a> Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).</li><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+microbial+life+on+surfaces.">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).</li><li>Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giving+structure+to+the+biofilm+matrix:+an+overview+of+individual+strategies+and+emerging+common+themes.">Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes.</a> FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).</li><li>Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Microbial+coaggregation:+ubiquity+and+implications+for+biofilm+development.">Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development.</a> Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).</li><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation:+a+clinically+relevant+microbiological+process.">Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process.</a> Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).</li><li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+biofilm.">The in vivo biofilm.</a> Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).</li><li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance.">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li><li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-specific+antibiotic+resistance.">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li><li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm-specific+antibiotic+resistance+gene+ndvB+is+important+for+expression+of+ethanol+oxidation+genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li><li>Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+clonal+strains+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+in+Ontario,+Canada.">Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada.</a> Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).</li><li>Vidya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+infection+phenotypes+of+Pseudomonas+aeruginosa+are+associated+with+failure+of+eradication+in+children+with+cystic+fibrosis.">Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis.</a> Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).</li><li>Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+caused+by+mucA+mutations+result+in+activation+of+TLR2+in+addition+to+TLR5+in+airway+epithelial+cells.">Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells.</a> Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).</li><li>Beaudoin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+level+of+p38alpha+mitogen-activated+protein+kinase+activation+in+airway+epithelial+cells+determines+the+onset+of+innate+immune+responses+to+planktonic+and+biofilm+Pseudomonas+aeruginosa.">The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa.</a> J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).</li><li>LaFayette, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis-adapted+quorum+sensing+mutants+cause+hyperinflammatory+responses.">Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses.</a> Sci.Adv. 1 (6), e1500199 (2015).</li><li>Staudinger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditions+associated+with+the+cystic+fibrosis+defect+promote+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+infection.">Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).</li><li>Kennedy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+Tobramycin+against+Cystic+Fibrosis+Isolates+of+Burkholderia+cepacia+Complex+Grown+as+Biofilms.">Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).</li><li>Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+High-Dose+Antimicrobials+on+Biofilm+Growth+of+Achromobacter+Species+Isolated+from+Cystic+Fibrosis+Patients.">Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).</li><li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).</li><li>Vorregaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Informatics and Mathematical Modelling. , (2008).</li><li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Biofilm+Formation+in+an+8-well+Chamber+Slide.">In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide.</a> J. Vis. Exp. (47), e2481 (2011).</li></ol>

אף לא אחד.

השיטות שתוארו במסמך זה לאפשר להדמיה של biofilms החיידקים גדל בנוכחות מוצרים אקסוגניים. באופן לא מפתיע, את הייצור של exoproducts הוא בעל חשיבות בעת שימוש בסוג זה של המערכת. למשל, Dithiothreitol (DTT), משמש לעתים קרובות על דגימות כיח אדם לעזור למוסס את הדגימות. עם זאת, ההשפעה של DTT לבדו יכול להקטין פיתוח biofilm ואת הכדאיות (מידע לא מוצג). לפיכך, בקרות נאותות עבור כל התנאים הדרושים. יתר על כן, התוספת של מוצרי ליחה אנושיים יוצרת את שוני פנימי על הניסוי בשל העובדה כי הליחה של כל מטופל יש Microbiome ייחודי. כדי להתאים לכך, השתמשנו דגימות כיח נקוו להימנע תוצאות מטופל ספציפיות. בנוסף, הבחירה של חומרי הדפסה מתאימות חשובה בעת שימוש בכל מערכת מודל. חומרי הדפסה רגילות לצמיחה ביופילם של האורגניזם המיועד מומלצות התקנה ראשונית של המערכת. אם מטרת הניסוי היא זיהויify כיצד מוצרים אקסוגניים המשפיעים היווצרות ביופילם, מדיה עשירה מזינה מספקת מוצעת היווצרות ביופילם נאותה. זה יאפשר מספיק תזונה לצמיחה תוך קביעת כיצד גורמים אקסוגניים עשויים להשפיע על ביופילם. תקשורת נוספת, כגון תקשורת מינימאלית או מוגדר, ניתן להשתמש לתנאים מסוימים לחקות טוב יותר. מדיה אחרת שמשה עם תוצאות טובות במערכת זו (מידע לא מוצג). הקובץ המצורף של biofilms כדי coverglass החדרים הוא איתן, אולם בזהירות רבה יש לנקוט בעת הסרה / הוספת מדיה או במהלך שלבי כביסה של biofilms למנוע שיבוש biofilms. שימוש הכתם החי-מת לפי הפרוטוקול של יצרן ניב תוצאות טובות עבור המערכת המתוארת. מספר גורמים יכולים להשפיע על היחס הקרינה של תמונות (כולל ספיגת צבע של חיידקים, הצפיפות היחסית של הגדרות רווח ביופילם גלאי), לעומת זאת, שיטה זו צריכה להתייחס למה שרואים בתמונהים. אמצעים אחרים עשויים לשמש לייצג את הכמות היחסית של ביופילם מת / חי, כגון ביומסה מן התאים המתים כיחס של ההווה ביומסה סך ביופילם (כפי שנגזר לסטטמ&quot;מ). באמצעות ספירת חיידקים כדי לאשר כדאיות ביופילם בניסויים חוזרים מומלץ לאשר את התצפיות החזותיות של המודל הזה. בשל ההטרוגניות טבועה של biofilms, מספר רב של תמונות מכל תא ותא מרובה אמורות לשמש עבור כל תנאי בניסוי. זה מוסיף לעלות ומשך ניסויים אלה. רכישת התמונות חשובה לפני ניתוח נתונים מניסויים אלה. יש להקפיד לא מעל להרוות תמונות בקביעת התקנת מיקרוסקופ. בהתאם לרמת הפירוט הנדרשת ואת מיקרוסקופ זמין, מספר מטרות שונות (10X, 25x, 40X ו 63X) ניתן להשתמש כדי לרכוש תמונות, אם כי אנו מוצאים כי המטרה 25x נותן תמונות טובות יותר. העובי של tהוא מחסנית Z יכול להשפיע גם על איכות התמונה הכוללת ואת רמת הפירוט. לאחר תמונות שצולמו בכל 0.5-1 מיקרומטר נראה לספק תמונות ברורות ב 25x אובייקטיבי, תוך שמירה על תמונות מחסנית Z בגודל שיכול להיות מנותח על ידי סטטמ&quot;מ על מערכות מחשב רגילות. ניסויים אלה הם יקרים יותר וזמן רב יותר מאשר מבחני תוספת אחרים, ולא ניתן לעשות זאת באופן תפוקה גבוה. בהליך זה, חיידקים לצרף משטח בורוסיליקט, אשר אינו משקף מצב in vivo ועלול להשפיע היווצרות והתפתחות ביופילם. עם זאת, הם מספקים מידע נוסף ניתן להפיק השערות עבור מנגנון הקשורים biofilm עמידות לאנטיביוטיקה ותגובה פיזיולוגית אות אקסוגני. אם מטרת הניסוי היא להבין כיצד biofilms להשתנות בתגובה לגורמים שונים, ולא בזיהוי תרכובות אנטי biofilm באמצעות שיטות תפוקה גבוהה למשל, המידע הנוסף מתבצע באמצעות tהטכניקה שלו הופכת את השיטה כדאית. לכן השיטה הנוכחית היא התקדמות משמעותית על מבחנים מצורפים מוגבלים קודמים כגון assay הסגול קריסטל, אשר הוא נפוץ ביותר ללמוד biofilms. צעדים קריטיים נוהל זה כוללים: 1) הבטיח עיבוד בזמן של דגימות כיח כדי למנוע שפלה; 2) להיות עדין עם שינויי תקשורת על biofilms כדי למנוע שיבוש של ביופילם ו -3) עושים מדידות חוזרות של הדמיה ביופילם כדי להבטיח ייצוג מדויק של עובי ביופילם בשל ההטרוגניות של היווצרות ביופילם. ברגע שמערכת הגדרה עבור זן חיידקים מסוים, אפשר לבדוק מספר תנאים שונים, לרבות שפעת גורמים חיצוניים על בידודים קליניים מרובים. מערכת זו נעשה שימוש כדי לחקור את ההשפעה של אנטיביוטיקה על biofilms חשופים כיח אדם 16 ולהשוות עמיד מאוד ועמיד intermediately מבודד קליניים. 17 שינויים כדי coverglass החדרים, כגון ציפוי תחתון עם פיגום-מייקרו mucin או קולגן (למשל, puracol), יכולים להרחיב את הטווח של ניסויים אפשריים. ייתכן שניתן יהיה להתאים מערכת זו כדי לחקור אינטראקציות ישירות, כמו אלה שבין תאי אפיתל וחיידקים, או בין סוגי חיידקים שונים. זוהי הרחבה של המודל שתואר על ידי אל Jurcisek et. 20 השיטה משתמשת צמיחה קאמרית שקופיות דומה לזה שתואר כאן ומשתמש פורמלין לתקן biofilms לפני להדמיה. לחלופין, בשיטה זו אנו לחזות biofilms מייד לאחר מכתים ואל תשתמשו מקבע. בנוסף, אנו מוסיפים גורמים אקסוגניים כדי לבדוק את ההשפעה של אנטיביוטיקה על biofilms. מודל זה ולכן יש פוטנציאל לקדם את ההבנה שלנו באופן משמעותי של biofilms חיידקי מחלות אנושיות.

biofilms חיידקים הם קבוצות של מיקרואורגניזמים מחוברים זה לזה עטוף מטריצה-מופרש עצמי. 1,2 קלסי, הם מייצגים חיידקים מחוברים פיזי משטח אביוטי או ביוטיים שנוצר בתנאים של זרימה. Biofilms גם הוכח לגדול בתנאים סטטיים (העדר זרימה) ו דיסטלי ממשטחים, כגון בממשק הנוזל אוויר של ברכות תרמיות או pellicles נוצרו במבחנות. biofilms אלה כבר מזמן מוכר בסביבה והם לרעת משמעותיים בתהליכים תעשייתיים, כפי שהם יכולים להיווצר מאגרי מים או בצינורות, וכתוצאה מכך biofouling, קורוזיה חסימות. 3,4 Biofilms הוא גם קריטי גדרות בריאות, כפי שהם הוכחו להיות מעורבי זיהומים הקשורים קטטר, דלקות ריאות בחולי סיסטיק פיברוזיס, כמו גם זיהומים רבים אחרים. 5,6 אחד מסימני ההיכר של זיהומים ביופילם הוא דהמקומט רגישות של חיידקים לאנטיביוטיקה ולקוי אישור על ידי מערכת החיסון המולדת. 7-9 למדו הכי טוב, תרחישים רלוונטיים קליני מעורבי זיהום מבוסס ביופילם מתרחשים בחולים עם סיסטיק פיברוזיס (CF), אשר נגועים באופן כרוני עם Pseudomonas aeruginosa biofilms. פ aeruginosa יכול לעבור מספר שינויים במהלך הקמת זיהום כרוני זה עושה את זה קשה מאוד לטיפול. 10,11 Biofilms יכול להפעיל מולדת חסינה ולנסוע דלקת דיפרנציאלי. 12-14 כמו זיהומים אלו מובילים לתחלואה ולתמותה מוגברות בחולי CF, חשוב להבין גורמים שיכולים להשפיע על התפתחות biofilm בהקשר זה. מחקר שנערך לאחרונה עולה כי גורמי מארח הם קריטיים ההיווצרות של אגרגטים ביופילם פ aeruginosa. 15 biofilms אלה תורמים רגישים מופחתים אנטיביוטיקה ומנגנוני הגנה מארחת. preseNCE גורמים מארחים נגזר, כגון אלסטט נויטרופילים, כמו גם מוצרים מופרשים מיקרואורגניזמים נוכחות ריאות CF, יש פוטנציאל לווסת היווצרות והתפתחות ביופילם מאוד. 16 בנוסף, biofilms אינטראקציה עם המארח לווסת ביטוי של מסלולים רבים וליזום דלקת. בעוד שיטות תפוקה גבוהה, כגון assay סגול קריסטל רגיל, יכול לספק קצת מידע לגבי תהליך ביופילם, להדמיה של biofilm בתגובה הגורמים הללו לספק יותר מידע מעמיק. בכתב היד הזה אנו מתארים שיטה לשימוש גורמים מן הליחה של חולי CF כדי ללמוד על ההתפתחות של biofilms במבחנה. שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה מהירה של biofilms חשופה לגורמי מארח המכיל כיח באמצעות ערכת כדאיות ביופילם מסחרית. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לזהות ויזואלית שינויים המתרחשים במהלך צמיחת biofilm בנוכחות exogenoלנו מוצרים, ומייצג שיטה משופרת לנתח את השינויים בפיתוח ביופילם בתנאים שונים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1270">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Sicher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">155409</td>
			<td style="width:729px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">L10316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Blood agar plates</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">R10215</td>
			<td>Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">COMSTAT</td>
			<td style="width:159px;">Availble software online</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Millers LB Broth</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12780-052</td>
			<td style="width:729px;">Standard media for overnight gowth/biofilm growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Millex-GV Syringe Filters</td>
			<td style="width:159px;">Millipore</td>
			<td>SLGV013SL</td>
			<td>Filtering of sputum supernants</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)</td>
			<td style="width:159px;">Oxoid</td>
			<td style="width:136px;">BR0014G</td>
			<td>Washing of biofilm chambers after media removal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss AxioVert 200M</td>
			<td style="width:159px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hamamatsu C9100-13 EM-CCD</td>
			<td style="width:159px;">QS Technologies Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectral Borealis</td>
			<td style="width:159px;">Qs Technologies Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Perkin Elmer Volocity</td>
			<td style="width:159px;">QS Technologies Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model

Biofilms מורכב קבוצות של חיידקים עטופים מטריצה-מופרש עצמי. הם משחקים תפקיד חשוב זיהום תעשייתי כמו גם בפיתוח וההתמדה של זיהומים רבים הקשורים לבריאות. אחד biofilms תיאר הכי טוב ולמד מחלות אנושיות מתרחשת דלקת ריאות כרונית של חולי סיסטיק פיברוזיס. כאשר לומדים biofilms בהקשר של המארח, גורמים רבים יכולים להשפיע היווצרות והתפתחות ביופילם. על מנת לזהות כיצד גורמי מארח עשויים להשפיע היווצרות ביופילם ופיתוח, השתמשנו בשיטת coverglass חדרים סטטי לגדול biofilms בנוכחות גורמים נגזרים מארחים בצורת supernatants ליחה. חיידקים הם זורעים לתוך תאי וחשוף filtrates ליחה. בעקבות 48 שעות של צמיחה, biofilms מגואלות ערכת כדאיות ביופילם מסחרית לפני מיקרוסקופיה וניתוח confocal. בעקבות רכישת תמונה, תכונות biofilm ניתן להעריך באמצעות פלטפורמות תוכנה שונות.שיטה זו מאפשרת לנו לדמיין תכונות מפתח של צמיחת biofilm בנוכחות של חומרים שונים כולל אנטיביוטיקה.

העיצוב הכללי של הניסוי מיוצג באיור 1. השימוש בפרוטוקול זה מספק שיטה נוחה כדי להמחיש את השינויים biofilms גדל במשך תקופות זמן שונות (למשל, 24, 48 או 72 שעות). חשוב לציין, אותות אקסוגניים, כגון ליחה filtrates, ניתן להוסיף כדי להמחיש את השינויים בפיתוח ביופילם. כפי שניתן לראות באיור 2, בנוכחות filtrates כיח 10% יכול לשנות את הארכיטקטורה של ביופילם (איור 2A, לוחות נמוך). 16 תמונות אלה ניתן לנתח באמצעות תוכנה לסטטמ&quot;מ להשיג מטריצות biofilm מפתח, כולל עובי ממוצע של ביופילם, ביומסה סך כיסוי השטח. הדבר בא לידי הביטוי לעליה במספר עובי ביופילם (2B הדמוי, ו -3). 16 ההשפעות של אנטיביוטיקה על biofilms ב כיח הנוכחות מוצגות באיור 3. על ידי visuali<html> זיע השינויים בפיתוח ביופילם, אפשר להעריך טוב יותר כיצד גורמים שונים יכולים להשפיע על הצמיחה ביופילם, במידה הרבה יותר טובה מאשר מבחני ביופילם מסורתיים, כגון מכתים סגול קריסטל. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54819/54819fig1.jpg" /> איור 1: עיצוב כללי של ניסוי. זרימת תרשים של פרוטוקול בסיסי. לכל הלילה (O / N) תרבות הוא מדולל 1 / 1,000 ואיפשר לגדול עד OD הסופי 600 של 0.5. זה מדולל יותר 1 / 1,000 ו -200 μl הוא זורע לתוך היטב של coverglass חדרים ואפשרנו לצרף עבור 3-4 שעות. בעקבות זאת, התקשורת להסיר ומחליפה עם תקשורת טריה. Biofilms מותר לגדול במשך הזמן הרצוי. Media, ניתן להוסיף מוצרים או אנטיביוטיקה אקסוגנית biofilms. בעקבות צמיחה, מדיה מוסרת, biofilms מגואלות והדמית confocal מתבצעת.ge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54819/54819fig2.jpg" /> איור 2: תמונות נציג של פיתוח biofilm בעקבות חשיפת filtrates ליחה. (א) נציג תמונות של מורכבות cepacia Burkholderia (BCC) שבודד קליני הבא 48 שעות של צמיחה ב coverglass חדרים עם תקשורת לבדה (פנלים למעלה) או בנוכחות filtrates כיח 10% (לוחות נמוכים) ואחריו מכתים עם ערכת כדאיות ביופילם. יחידת מידה 1 לייצג 19.68 מיקרומטר. (ב - ג) העובי הממוצע של בידודים (ב &#39;) מת: יחס חי (C) של מספר רב של תמונות של BCC מבודד גדל במשך 48 שעות בתאי שקופיות בהעדר (פסים לבנים) או נוכחות (פסים שחורים) של ליחת filtrates. כל עמודה מייצגת ממוצע של 45 תמונות זממועם סטיית תקן של הממוצע. ** P &lt;0.001 לעומת קבוצת ביקורת (מדיה לבד) באמצעות בדיקת Kruskal-Wallis. האיור מותאם ואח קנדי. 16 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54819/54819fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54819/54819fig3.jpg" /> איור 3: נציג תמונות של טיפול אנטיביוטי על biofilms חשוף תסנין ליחה. תמונות (א) של הבידודים קליניים vietnamiensis Burkholderia הבאים 48 שעות של צמיחה ב coverglass החדרים עם התקשורת לבדה (משמאל) או בנוכחות filtrates כיח 10% (מימין) עם או בלי 1,000 מיקרוגרם / מ &#39;של tobramycin. Biofilms גדלו במשך 24 שעות בתקשורת לבד או מדיה בתוספת 10% (v / v) כיח filtrates. לאחר 24 שעות, תקשורת הוסרה והוחלפה Medi(ליחה +/-) א המכיל אנטיביוטיקה. יחידת מידה 1 לייצג 19.68 מיקרומטר. (ב - ג) עובי ממוצע של הבידודים (ב &#39;) מת: יחס חי (C) של מספר רב של תמונות (n = 9) של vietnamiensis ב מבודד גדלו במשך 48 שעות בתאי שקופיות בהעדר או נוכחות של ליחה filtrates. כל עמודה מייצגת ממוצע של 45 תמונות זממו עם סטיית התקן של הממוצע. ** P &lt;0.001 לעומת קבוצת ביקורת (0 מיקרוגרם / מ&quot;ל) באמצעות הבדיקה Kruskal-Wallis. האיור מותאם ואח קנדי. 16 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54819/54819fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model at JoVE.com

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

לדמיין את ההשפעות של כיח על פיתוח biofilm באמצעות מודל תאיים coverglass

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

visualizing-effects-sputum-on-biofilm-development-using-chambered

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.3K Views.  Hospital for Sick Children. This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Video: Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Biofilm microtiter תבשיל גיבוש Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

ב גיבוש biofilm חוץ גופית ב 8-Slide גם לשכת

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

Assay Microplate כדי להעריך את ההשפעות כימיות על degranulation תא התורן RBL-2H3: השפעות של Triclosan ללא שימוש בממס אורגני

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

שימוש בכימיה לחץ כדי למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בסינתזת RNA Host-Cell

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

חוקר את ההשפעות של פרוביוטיקה על דלקת ריאות התיישבות שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay דבקות

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

ניתוח ההשפעות של תאי סטרומה על הגיוס של לויקוציטים מתזרים

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

ניתוח תזרים Cytometric נ בית נכנס חלקיקים 1 האלרגנים PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

הדמיה בזמן אמת, כימות של פיתוח Biofilm פטרייתי באמצעות מערכת זרימת Recirculating דו-שלבית

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are needed to decipher the utilization of microbiome modulators for human health benefits. However, the large-scale screening and optimization of modulators to validate microbiome modulation and predict related health benefits may be practically difficult due to the need for large number of animals and/or human subjects. To this end, in vitro or ex vivo models can facilitate preliminary screening of microbiome modulators. Herein, it is optimized and demonstrated an ex vivo fecal microbiota culture system that can be used for examining the effects of various interventions of gut microbiome modulators including probiotics, prebiotics and other food ingredients, aside from nutraceuticals and drugs, on the diversity and composition of the human gut microbiota. Inulin, one of the most widely studied prebiotic compounds and microbiome modulators, is used as an example here to examine its effect on the healthy fecal microbiota composition and its metabolic activities, such as fecal pH and the fecal levels of organic acids including lactate and short-chain fatty acids (SCFAs). The protocol may be useful for studies aimed at estimating the effects of different interventions of modulators on fecal microbiota profiles and at predicting their health impacts.

This protocol describes an in vitro batch-culture fermentation system of human fecal microbiota, using inulin (a well-known prebiotic and one of the most widely studied microbiota modulators) to demonstrate the use of this system in estimating effects of specific interventions on fecal microbiota composition and metabolic activities.

באצווה מחוץ לגופית-מודל תרבות להעריך את ההשפעות של משטרי התערבותית על האדם מיקרוביוטה בצואה

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are ...

Mechanistic Insight into the Development of TNBS-Mediated Intestinal Fibrosis and Evaluating the Inhibitory Effects of Rapamycin

Significant studies have been carried out to understand effective management of intestinal fibrosis. However, the lack of better knowledge of fibrosis has hindered the development of a preventative drug. Primarily, finding a suitable animal model is challenging in understanding the mechanism of Crohn&#39;s-associated intestinal fibrosis pathology. Here, we adopted an effective method where TNBS chemical exposure to mice rectums produces substantially deep ulceration and chronic inflammation, and the mice then chronically develop intestinal fibrosis. Also, we describe a technique where a rapamycin injection shows inhibitory effects on TNBS-mediated fibrosis in the mouse model. To assess the underlying mechanism of fibrosis, we methodically discuss a procedure for purifying Cx3Cr1+ cells from the lamina propria of TNBS-treated and control mice. This detailed protocol will be helpful to researchers who are investigating the mechanism of fibrosis and pave the path to find a better therapeutic invention for Crohn&#39;s-associated intestinal fibrosis.

In this study, we describe a detailed procedure of TNBS-mediated intestinal fibrosis, which exhibits comparable pathophysiology to Crohn&#39;s fibrosis. We also discuss this approach in light of rapamycin facilitated inhibitory effects on intestinal fibrosis.

תובנה מכניסטית לתוך פיתוח של מעיים TNBS-תיווך פיברוזיס והערכת השפעות העכבות של Rapamycin

Significant studies have been carried out to understand effective management of intestinal fibrosis. However, the lack of better knowledge of fibrosis has ...