The study was supported by the Swedish Research Council, the Swedish Rheumatism Asociation, Karolinska Institute Foundations, Stockholm County Council, The Wallenberg Foundation, and the GV 80 Years' Foundation for research. The authors would also like to thank Hannah Aucott for proofreading the manuscript.

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות לטיפול ולשימוש בחיות אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית בבית קרולינסקה בסטוקהולם. ועדת האתיקה המקומית בעקבות הנחיות האיחוד האירופי על טיפול בבעלי חיים. הערה: השינויים העיקריים מן הפרוטוקול המקורי הם זמן החלמה לאחר ניתוח (6 שעות לעומת 1 hr) ורמת LPS מוזרק (2 מ&quot;ג / ק&quot;ג לעומת 15 מ&quot;ג / ק&quot;ג). אחרת, הגדרות שונות הקשורות לניתוח עצמו לא שונו. 1. הכנת חומר עבור גירוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעילו את המחשב ואת מערכת הרכשת נתונים צמוד (איור 1 א) מגרה אלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את תכנית מכירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון המניות של LPS בריכוז של 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב PBS 1x, aliquot אותו, ולאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס. ביום הניסוי, להפשיר aliquot ולהכין ADEמדגם של LPS קווייט (0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל) כדי להזריק סביב 100 μl לתוך החיה, לפי משקל. </li></ol> 2. הכנת בעלי החיים עבור הרדמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמשו C57Bl / 6 עכברים. לשמור אותם בתנאי אקלים מבוקר עם מחזור אור 12-hr / כהה, להאכיל אותם צ&#39;או מכרסמים רגילים, ולתת להם כרצונך מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע ניתוח על עכברים כי שוקל בסביבות 25 גרם ביום של הניסוי. הערה: כאשר תגובות דלקתיות מושרות, חשוב במיוחד לבצע בדיקות ותצפיות קבועות של התגובות הקליניות בחיות. המתת חסד מוקדם על ידי שאיפת 2 CO נדרשת אם תנאי החיה אינו עומד בקריטריונים האתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מכונת ההרדמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי הצינורות מחוברים כראוי והוא לא ניזוק בצורה כלשהי. ודא כי במקום מאוורר פועל כהלכה. חבר את מסנן מפתח בקבוק isoflurane ולמלא את vaporizer עם כמות isoflurane מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את אספקת הגז (אוויר וחמצן) ולוודא כי הבקבוקים המכילים גז מספיק לצורך הניסוי. מחבר שלושה כיוונים ואז תוכל לשלוח את זרימת isoflurane לתא האינדוקציה או המסכה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המחבר המשולש לתא האינדוקציה. פיק עכבר אחד מהכלוב הביתה ולהכניס את החיה לתוך התא. התאם את הרגולטור זרימת חמצן 1.0 L / min ואוויר 1.0 L / min. התאם את ריכוז isoflurane ל 4 - 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר רמת ההרדמה הרצויה, כאשר רמת ההרדמה הרצויה, לגלח את אזור הניתוח ולעבור את החיה מבית הבליעה אל המסכה. הפעל את מחבר שלושה כיווני זרימת מסכה. התאם את הרגולטור זרימת חמצן 0.25 L / min ואוויר 0.25 L / min. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ריכוז isoflurane ל -1.5 - 2.5%. בדוק את רמת הרדמה בשלט רפלקס וקצב הנשימה לפני תחילת procedur כירורגידואר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הרגליים של העכבר על ספסל העבודה באמצעות דבק. ודא כי האף של החיה עדיין בדקדקנות את המסכה. </li></ol> 3. כירורגיה ועידוד של העצב התועה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את אזור הניתוח עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל, לחתוך את העור בזהירות ברמה של הצוואר (חתך של בסביבות 1 עד 1.5 ס&quot;מ). הערה: הפרוטוקול, הליך הניתוח מסתיים כאן עבור חיות-דמה פעל. ואכן, הוכח כי רק נגיעה בעצב עם כלי מתכת כבר מגרה אותו במידה מסוימת. לכן, כדי לקבל חיה מלאה ניתוח מדויק יותר כאשר משתמשים בכמות קטנה של LPS, להפסיק את הניתוח בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מיקרוסקופ (אובייקטיבי 12.5X), לבודד את העצב התועה השמאלי מן העורק הראשי באמצעות מלקחיים לנתח. ראשית לאתר את שריר sternocleidomastoid ידי הסרת שכבות עור ושומן, ולאחר מכן לחזור בוכדי לשים את המלקחיים מאחורי שניהם עצב ואת העורק. הערה: השלב הבא הוא מאוד מסובך, כמו העצב העורק הם דבקו באופן הדוק זה לזה. לכן, קל מאוד לחתוך את הספינה ולהרוג את החיה. עם זאת, על ידי הצבת מלקחיים בזהירות רבה בין העצב והעורק, הם בסופו של דבר להפריד, וזה אפשרי לבודד את העצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האלקטרודה (1B איור) תחת העצב התועה. אלקטרודה המחט ארוכה למדי, כך שגם אם העצב מעביר מעט במהלך הגירוי, זה תמיד יהיה במגע עם האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לביצוע הזרקה הזרקה (IP) של LPS (2 מ&quot;ג / ק&quot;ג) בעזרת מזרק (עבור לקריאה על רמות הציטוקינים; כלומר, כדי למדוד את השפעת ויסות למטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתן 5 דקות לפני תחילת הגירוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר את העצב התועה עבור 5 דקות ב 5 V ו- 1 הרץ על ידי לחיצה על כפתור התחל בתוכנית הכר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מִחָדָשׁלהזיז את אלקטרודה ו תפר את הפצע של החיה עם חוט תפירה כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רסס סרט מכשול אין סטינג (NSBF) על הפצע כדי לשפר ריפוי להגן מפני זיהומים. </li></ol> שחזור 4. של בעלי החיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניתוח, להזיז את החיה חזרה לכלוב בבית שלו עבור התעוררות והתאוששות. תחת אור אינפרא-אדום על מנת לשמור על טמפרטורת הגוף, לוודא לפקח על בעלי חיים עד להכרה מלאה כבר חזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו החיה להתאושש בכלוב שלה עבור 6 שעות לפני ההקרבה לניתוח. הערה: ההשפעה של גירוי עצב הואגוס היא מאוד מהירה וגם הוכחה להיות ארוך שנמשך (עד 48 שעות), כך שזמן ההתאוששות יכול להיות מוגדר על ידי הנסיין בהתאם לצרכי המחקר. </li></ol> 5. קורבן לניתוח נוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את החיה בכלוב הקשור מכשיר ממשל 2 CO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המכשיר על 5מחזור -min משאיפת 2 CO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר המתת חסד נעשה, לאסוף את האיברים של עניין ולהקפיא אותם ישירות על קרח יבש לניתוח נוסף (למשל, למדידת רמות הציטוקינים בתמציות הטחול באמצעות TH1 העכבר / TH2 9-Plex assay) 3. </li></ol>

<ol>
	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Points+of+control+in+inflammation.">Points of control in inflammation.</a> Nature. 420 (6917), 846-852 (2002).</li><li>Rosas Ballina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine-synthesizing+T+cells+relay+neural+signals+in+a+vagus+nerve+circuit.">Acetylcholine-synthesizing T cells relay neural signals in a vagus nerve circuit.</a> Science. 334 (6052), 98-101 (2011).</li><li>Le Ma&#238;tre, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+vagus-mediated+immunosuppression+in+microsomal+prostaglandin+E+synthase-1+deficient+mice.">Impaired vagus-mediated immunosuppression in microsomal prostaglandin E synthase-1 deficient mice.</a> Prostaglandins Other Lipid Mediat. 121 (Part B), 155-162 (2015).</li><li>Borovikova, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vagus+nerve+stimulation+attenuates+the+systemic+inflammatory+response+to+endotoxin.">Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin.</a> Nature. 405 (6785), 458-462 (2000).</li><li>Olofsson, P. S., Rosas-Ballina, M., Levine, Y. A., Tracey, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rethinking+inflammation:+neural+circuits+in+the+regulation+of+immunity.">Rethinking inflammation: neural circuits in the regulation of immunity.</a> Immunol. Rev. 248 (1), 188-204 (2012).</li><li>Pavlov, V. A., Tracey, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuitry+and+immunity.">Neural circuitry and immunity.</a> Immunol Res. 63 (1-3), 38-57 (2015).</li><li>Huston, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splenectomy+inactivates+the+cholinergic+antiinflammatory+pathway+during+lethal+endotoxemia+and+polymicrobial+sepsis.">Splenectomy inactivates the cholinergic antiinflammatory pathway during lethal endotoxemia and polymicrobial sepsis.</a> J. Exp. Med. 203 (7), 1623-1628 (2006).</li><li>Rosas-Ballina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splenic+nerve+is+required+for+cholinergic+anti-inflammatory+pathway+control+of+TNF+in+endotoxemia.">Splenic nerve is required for cholinergic anti-inflammatory pathway control of TNF in endotoxemia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 11008-11013 (2008).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+acetylcholine+receptor+alpha7+subunit+is+an+essential+regulator+of+inflammation.">Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation.</a> Nature. 421 (6921), 384-388 (2003).</li><li>Pavlov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+muscarinic+cholinergic+regulation+of+the+systemic+inflammatory+response+during+endotoxemia.">Central muscarinic cholinergic regulation of the systemic inflammatory response during endotoxemia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (13), 5219-5223 (2006).</li><li>Pavlov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+acetylcholinesterase+activity+controls+systemic+cytokine+levels+through+the+cholinergic+anti-inflammatory+pathway.">Brain acetylcholinesterase activity controls systemic cytokine levels through the cholinergic anti-inflammatory pathway.</a> Brain Behav. Immun. 23 (1), 41-45 (2009).</li><li>Rosas-Ballina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanomeline+suppresses+excessive+pro-inflammatory+cytokine+responses+through+neural+signal-mediated+pathways+and+improves+survival+in+lethal+inflammation.">Xanomeline suppresses excessive pro-inflammatory cytokine responses through neural signal-mediated pathways and improves survival in lethal inflammation.</a> Brain Behav. Immun. 44, 19-27 (2014).</li><li>Bellinger, D. L., Lorton, D., Lubahn, D., Felten, D. L., Ader, R., Felten, D. L., Cohen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Psychoneuroimmunology. 55, 55-112 (2001).</li><li>Andersson, U., Tracey, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+rheumatoid+arthritis:+treating+inflammation+with+computerized+nerve+stimulation.">A new approach to rheumatoid arthritis: treating inflammation with computerized nerve stimulation.</a> Cerebrum. 2012, 3 (2012).</li><li>Ono, S. J., Nakamura, T., Miyazaki, D., Ohbayashi, M., Dawson, M., Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines:+Roles+in+leucocyte+development,+trafficking,+and+effector+function.">Chemokines: Roles in leucocyte development, trafficking, and effector function.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 111 (6), 1185-1199 (2003).</li><li>Silvestre-Roig, C., Hidalgo, A., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+heterogeneity:+implications+for+homeostasis+and+pathogenesis.">Neutrophil heterogeneity: implications for homeostasis and pathogenesis.</a> Blood. , (2016).</li><li>Matteoli, G., Boeckxstaens, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vagal+innervation+of+the+gut+and+immune+homeostasis.">The vagal innervation of the gut and immune homeostasis.</a> Gut. 62, 1214-1222 (2013).</li><li>Pereira, M. R., Leite, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+parasympathetic+and+sympathetic+nerve+in+the+inflammatory+reflex.">The involvement of parasympathetic and sympathetic nerve in the inflammatory reflex.</a> J. Cell. Physiol. 231, 1862-1869 (2016).</li><li>Levine, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurostimulation+of+the+cholinergic+anti-inflammatory+pathway+ameliorates+disease+in+rat+collagen-induced+arthritis.">Neurostimulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway ameliorates disease in rat collagen-induced arthritis.</a> PLoS One. 9 (8), e104530 (2014).</li><li>Huston, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+vagus+nerve+stimulation+reduces+serum+high+mobility+group+box+1+levels+and+improves+survival+in+murine+sepsis.">Transcutaneous vagus nerve stimulation reduces serum high mobility group box 1 levels and improves survival in murine sepsis.</a> Crit. Care Med. 35 (12), 2762-2768 (2007).</li><li>Yuan, H., Silberstein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vagus+nerve+and+vagus+nerve+stimulation,+a+comprehensive+review:+Part+II.">Vagus nerve and vagus nerve stimulation, a comprehensive review: Part II.</a> Headache. 56 (2), 259-266 (2016).</li></ol>

החוקרים אין לחשוף.

מאז גילויו בתחילת שנות ה -2000, המנגנונים של CAP נחקרו ביסודיות. עכשיו יש לנו תמונה טובה של המסלול, ובפרט, איבר היעד, הטחול, שבו NE, תאי T הזיכרון, אח, ו מקרופאגים העבודה כצוות יעיל מאוד למטה לווסת מתווכים דלקתיים 2. גם פרסמנו נתונים לאחרונה על החשיבות של מערכת פרו...

חסינות מולדת מספקת שורה ראשונה מיידית של הגנה מפני זיהומים ומחלות במגוון רחב של אורגניזמים. זה לא רק משיג את התגובה החיסונית הראשונית כדי לחסל את האיום, אבל זה גם משחק תפקיד מרכזי בהפעלה והדרכת החסינות אדפטיבית כי מבצעת תגובות משתי חיסוניות בצורה פתוגן ספציפית. דלקת היא מתוזמרת על ידי שפע של ציטוקינים chemokines, שבתורה יש את היכולת למשוך תאים חיסוניים אחרים לאתר של זיהום וכדי לגרום סימני הקרדינל של דלקת, כגון אדמומיות, נפיחות, כאב, אובדן התפקוד, וחום . משך ועוצמת הדלקת תלוי במספר גורמים, אך בפתרון דלקת ושחזור הומאוסטזיס הוא שלב קריטי, כדי למנוע התפרצות של מחלות דלקתיות כרוניות. התפתחויות אחרונות בתחום הנוירולוגיה אימונולוגיה יש נפרם מנגנונים עצביים ספציפיים עם פוטנציאל טיפולי עצום לשלוט inflammation היא במערכת העצבים המרכזית ובפריפריה. אחד המנגנונים האלה הוא המסלול אנטי דלקתי כולינרגית (CAP), הידוע גם בשם רפלקס הדלקתי, אשר מונע על ידי מערכת העצבים האוטונומית 4, 5. הוא חשב כרגע כי מתווכים דלקתיים להפעיל עצבים תחושתיים ושולחים אותות על מצב הדלקת במערכת העצבים המרכזית. תגובה רפלקס אז מופעל באמצעות העצב התועה efferent. מחקר מקיף על הפרטים האנטומיים של CAP חשף דגם הפאראסימפתטית-אוהד מורכב משני עצבים, העצב התועה ואת עצב טחול, בהתאמה 6. בשנות ה CAP, העצב התועה כולינרגית efferent מופעל מסתיים גנגליון צליאק-mesenteric, וכתוצאה מכך ההפעלה של עצב הטחול אדרנרגיים על ידי מנגנון טרם נחקרו. עצב הטחול, ולכן הופעל, ידוע פנימיvate בסמיכות לתאים חיסוניים עיסת לבן, אזור שולי, ואת עיסת אדום של הטחול, קרן איבר חובה של CAP 7, 8. ונוראפינפרין (NE) מן קצות עצבי טחול נקשר לרצפטורים אדרנרגיים β 2 המתאימים הביעו על לימפוציטים מסוג T טחול. זה גורם transferase אצטיל כולין (צ&#39;אט) אצטילכולין בתיווך (ACH) שחרור, אשר בתורו מפעיל קולטני אצטילכולין ניקוטינית α7 (α7nACh) על מקרופאגים, וכך להגביל ייצור ציטוקינים ודלקות 2. כתוצאה מכך, עכשיו זה ברור כי מערכת העצבים היא מסוגלת לווסת דלקת ברקמות היקפיות וכדי לשחזר הומאוסטזיס מקומית חיסונית. כפי שהשם של המסלול מרמז, מערכת האח היא בעל חשיבות מרכזית לתפקוד מסלול המסדיר נוירו-החיסון הזה. מעניין, המנגנונים מעורבים בהפעלהה- CAP נראה שונה בפריפריה ובמערכת העצבים המרכזית. למרות החשיבות של קולטנים ניקוטינית (α7nAChR) בטחול הודגמה מוקדם 9, קולטנים מוסקריניים (mAChR) הם חובה עבור ההפעלה המרכזית של המסלול 10, 11. לאחרונה, ממשל היקפי של אגוניסט M1 מוסקריניים מרכזי הפועל α גורם נימק בסרום מודחק משמעותי וטחול גידול (TNFα) במהלך endotoxemia בעכברים הקטלני, פעולה שחייב שלם עצב תועה ואת עצב טחול איתות 12. גם הראינו לאחרונה כי עכברים שחסרו פרוסטגלנדין E 2 (PGE 2) לא היו מסוגלים להגיב לגירוי העצב התועה ולא למטה להסדיר את שחרורו המושרה LPS של ציטוקינים בסרום והטחול 3. לכן, CAP יכול גם להיות מוסדר על ידי מערכות אחרות מאשר pathw האח הראשיAY. העצב התועה כבר בשם כזה בגלל כמובן לנדוד בגוף, innervating אברים עיקריים כולל הכבד, ריאות, טחול, כליות, ואת הבטן 13. בהתחשב עצבוב גדול זו והשפעת אימונוסופרסיבי מאוד חזקה של העצב התועה, את הפוטנציאל הטיפולי של CAP יכול לכסות מגוון רחב של מצבים דלקתיים. עצב התועה יכול להיות חשמלי (או מכאני) מופעל, עם שליטה על המתח ותדירות, ובניגוד לטיפול קונבנציונלי, ללא תרופות הוסיפו לגוף. ניסויים נערכים כיום בחולי ראומטיים, למשל, כדי לבדוק את המשמעות הקלינית של VNS בטיפול בדלקת כרונית 14. בסך הכל, התקשורת חיסונית-נוירו והרגולציה של דלקת כרגע תחת חקירה, אשר תספק טיפול חלופי אפשרי לטיפול קונבנציונלי. לכן, ניתוח של העצב התועה stimulatioאפקט n באיברים מעוצבבים השונים, אלא גם אפיון של הפעולה הטיפולית הפוטנציאלית מודלים בבעלי חיים למחלות דלקתיות כרוני, בהחלט ייתן תובנה ולקוות מטרות טיפוליות פוטנציאליות חדשות. המתודולוגיה המקורית שפותחה על ידי טרייסי ועמיתיו 4 לא יכולה להיות משורבבת לתחום שלנו של מחקר עקב גירוי יתר של התגובה הדלקתית (על ידי מנה קטלנית של LPS) ומגוון מדי-זמן קצר בין הפעלת CAP ואת ההקראה. בעבודה הנוכחית, נציג את השינויים שבוצעו בפרוטוקול המקורי, להשוות בין שתי מתודולוגיות שונות על רמות ציטוקינים, ולהאיר של התבוננות חדשה ההפוכה על איבר המטרה (הטחול).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="665">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Computer</td>
			<td style="width:91px;">Toshiba</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td style="width:191px;">Any computer is actually compatible</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">MP-150 data acquisition system</td>
			<td style="width:91px;">Biopac Systems</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">MP150WSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Acknowledge software</td>
			<td style="width:91px;">Biopac Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Mice C57Bl/6</td>
			<td style="width:91px;">Charles River</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Anesthetic machine</td>
			<td style="width:91px;">Simtec Engineering</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Medical oxygen bottle</td>
			<td style="width:91px;">AGA</td>
			<td style="width:136px;">107563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Medical air bottle&#160;</td>
			<td style="width:91px;">AGA</td>
			<td style="width:136px;">108639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Vetflurane (1000mg/g)</td>
			<td style="width:91px;">Virbac</td>
			<td style="width:136px;">137317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">LPS</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Saline</td>
			<td style="width:91px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">1024060080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">PBS 10X</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">P5493</td>
			<td>Diluted 10 times for used concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Syringe (1 ml)</td>
			<td style="width:91px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:136px;">303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Needles 23G</td>
			<td style="width:91px;">KD-FINE</td>
			<td style="width:136px;">900284</td>
			<td>0.6 x 30 mm (blue)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Microdissecting forceps (curved)</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">Z265969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Surgical suture 4-0</td>
			<td style="width:91px;">Ethicon</td>
			<td style="width:136px;">G667G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Euthanasia unit</td>
			<td style="width:91px;">Euthanex Smartbox</td>
			<td style="width:136px;">EA-32000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Cavilon No Sting Barrier Film</td>
			<td style="width:91px;">3M Health Care</td>
			<td style="width:136px;">3346N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">TH1/TH2 9-Plex assay, ultrasensitive kit</td>
			<td style="width:91px;">MesoScale Discovery</td>
			<td style="width:136px;">K15013C-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

increased recovery time and decreased lps administration to study the vagus nerve stimulation mechanisms in limited inflammatory responses

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release cytokines and other mediators of inflammation. For a long time, humoral and cellular mechanisms have been studied for their role in regulating the immune response, but recent advances in the field of immunology and neuroscience have also unraveled specific neural mechanisms with interesting therapeutic potential. The so-called cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) has been described to control innate immune responses and inflammation in a very potent manner. In the early 2000s, Tracey and collaborators developed a technique that stimulates the vagus nerve and mimics the effect of the pathway. The methodology is based on the electrical stimulation of the vagus nerve at low voltage and frequency, in order to avoid any side effects of overstimulation, such as deregulation of heart rate variability. Electrical devices for stimulation are now available, making it easy to set up the methodology in the laboratory. The goal of this research was to investigate the potential involvement of prostaglandins in the CAP. Unfortunately, based on earlier attempts, we failed to use the original protocol, as the induced inflammatory response either was too high or was not suitable for enzymatic metabolism properties. The different settings of the original surgery protocol remained mostly unchanged, but the conditions regarding inflammatory induction and the time point before sacrifice were improved to fit our purposes (i.e., to investigate the involvement of the CAP in more limited inflammatory responses). 
The modified version of the original protocol, presented here, includes a longer time range between vagus nerve stimulation and analysis, which is associated with a lower induction of inflammatory responses. Additionally, while decreasing the level of lipopolysaccharides (LPS) to inject, we also came across new observations regarding mechanistic properties in the spleen.

רמה של TNFα ו- interleukin-1β (IL-1β) לאחר הגדלת ועבר זמן רב לאחר הניתוח הקטנת המינון של LPS כפי שהוצג קודם, באמצעות פרוטוקול מקורי, VNS ירד לרמות של TNFα (169.3 ± 24.9 pg / מ&quot;ג בהעמדת הפנים לעומת 39.7 ± 10.8 pg / מ&quot;ג ב VNS, p ...

Watch this Scientific Journal Video about Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses at JoVE.com

Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses

Vagus nerve stimulation has proven to have a strong efficacy for decreasing peripheral inflammation. Here, we present a modified vagus nerve stimulation protocol that allows for further examinations of the cholinergic anti-inflammatory mechanisms in limited inflammatory responses.

הגברת Recovery Time וירידה מינהל LPS לחקר העצב התועה מנגנוני גירוי בתגובות דלקתיות מוגבל

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release ...

increased-recovery-time-decreased-lps-administration-to-study-vagus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.8K Views.  Karolinska University Hospital. Vagus nerve stimulation has proven to have a strong efficacy for decreasing peripheral inflammation. Here, we present a modified vagus nerve stimulation protocol that allows for further examinations of the cholinergic anti-inflammatory mechanisms in limited inflammatory responses.

Video: Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

הבחנת תפקידים פונקציונליים של ביטוי גנים מתאים חיסוניים וללא חיסון בקוליטיס המאוס על ידי השתלת מח עצם

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

אפיון של תגובות דלקתיות במהלך קולוניזציה תוך-אפית עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

השתלה של עור זנב לחקר תגובות תא Allogeneic T מסוג CD4 בעכברים

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We demonstrate the procedure for preparing H. influenzae inoculum, intra-tracheal instillation of H. influenzae into the lung, collection of broncho-alveolar lavage fluid (BALF), analysis of immune cells in the BALF, and RNA isolation for differential gene expression analysis. This procedure can be used to study the lung inflammatory response to any bacteria, virus or fungi. Direct tracheal instillation is mostly preferred over intranasal or aerosol inhalation procedures because it more efficiently delivers the bacterial inoculum into the lower respiratory tract with less ambiguity.

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

מנהל Intra-קנה נשימה של<em&gt; אינפלואנזה המופילוס</em&gt; בעכברי מודל לחקר Airway דלקת

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Retroviral תמרה של Helper T תאים כגישה גנטית לחקר מנגנוני בקרת הבידול והתפקוד שלהם

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

דגם IL-8 עכבר transgenized חולף עבור<em&gt; בויבו</emמעקב ארוך טווח אחר תגובות דלקתיות

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

הקרנת מבחני לאפיין הרגולטורים אנדותל הרומן מעורבים בתגובה דלקתית

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.