We would like to acknowledge Connecticut Children's Medical Center Strategic Research Funding for supporting this work.

ביופסיות ושט התקבלו לאחר הסכמה מהדעת התקבלה ההורים / אפוטרופוסים של מטופלי ילדים ובהתאם לוח הסקירה מוסדי (IRB # 13-094). פתרון 1. מכשירי חיטוי לטין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחי חיטוי, סכיני גילוח ומספרי לפני טיפול רקמות על מנת למנוע זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך 200 מ&quot;ל של תמיסת הג&#39;לטין 0.1%, לשלב 200 מ&quot;ל מים מזוקקים עם 0.2 גרם של ג&#39;לטין. חיטוי וקריר לפני שימוש. </li></ol> 2. תרבות צלחות רקמות ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 2 שעות לפני בידוד תא, להוסיף מספיק 0.1% ג&#39;לטין לכסות צלחת בתרבית רקמה (100 מ&quot;מ) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס חממה תרבית תאים. הערה: אלה צלחות יכולות גם להתבצע מראש והמשיכו בחממה לפני השימוש. </li></ol> 3. ביצוע פתרון אנזימים עבור דיסוציאציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ -30 דקות לפני בידוד תא, לשקול את10 יחידות של dispase על איזון על בסיס יחידות לכל ריכוז מיליגרם על הבקבוקון. מניחים את אבקת צינור חרוטי 15 מ&quot;ל עם 10 מ&quot;ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) ומניחים באמבט מים C ° 37. </li></ol> 4. Cell ביצוע בינוני תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך 50 מ&quot;ל של מדיום תכנות מחדש מותנה, לערבב את החומרים הבאים לתוך צינור חרוטי סטרילי: 35 מ&quot;ל של F12 (בינוני של Ham), 11.5 מ&quot;ל של DMEM, 0.5 מ&quot;ל של L- גלוטמין, 0.5 מ&quot;ל של 100x פניצילין / סטרפטומיצין, 2.5 מ&quot;ל של בסרום שור העובר (FBS), 250 מיקרוגרם של אינסולין אנושי, 500 ננוגרם של גורם הגדילה באפידרמיס האדם (EGF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך 500 מ&quot;ל של 3T3 בינוני, לערבב 50 מ&quot;ל של FBS, 5 מ&quot;ל של 100x פניצילין / סטרפטומיצין ו 5 מ&quot;ל של L- גלוטמין עם 500 מ&quot;ל של DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך 500 מ&quot;ל של מדיום סרום ללא keratinocyte, להפשיר EGF ותמצית יותרת המוח שור (BPE) תוספי מזון (מסופק עם התקשורת). מוסיפים את ונספחי בקבוק מ&quot;ל 500 של המדיום בסיס ולהוסיף 5 מ&quot;ל של 10פניצילין 0x / סטרפטומיצין </li></ol> 5. Culturing ו irradiating 3T3 תאים כמקור מזין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני 3T3, המהווים DMEM, 10% FBS, 1x פניצילין / סטרפטומיצין ו -2 מ&quot;מ L- גלוטמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות 3T3 תאי צלוחיות רקמות שטופלו T-75 לפחות 3 ימים לפני ההגעה של דגימות חולות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן קצר לפני הגעתו של דגימות חולות, trypsinize 3T3 תאים באמצעות 5 מיליליטר של 0.25% טריפסין- EDTA לכל בקבוק לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות או עד שרוב התאים צפו </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של 3T3 בינוני כדי לעצור את התגובה. לשאוב את ההשעיה תא ולהעביר צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. ספין במשך 5 דקות ב g 300 x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב הבינוני resuspend תאים בנפח מוגדר של כחול Trypan עבור ספירת תאים. שלב 10 μL של תאים עם 10 μL של Trypan כחול להוציא תאים מתים. טען 10 μL של פתרון זה על hemocytometer עבור ספירת תאים. הערה: לקבלת פרוטו זהcol, צפיפות זריעה עבור 3T3 תאים מוקרן הוא 10,900 תאים לס&quot;מ 2, אשר שווה 600,000 תאים לכל צלחת 100 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot את מספר התאים הדרושים צלחת צלחת 100 מ&quot;מ לדגימה המטופל resuspend ב 25 מ&quot;ל של 3T3 בינוניים צינור חרוטי 50 מ&quot;ל ו מקרינים עם 3000 rads. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הקרנה, ספין התאים למשך 5 דקות ב 300 XG ו resuspend במדיום תכנות מחדש מותנה ב 5 מ&quot;ל לכל 100 צלחת מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את צינור הצידה עד הציפוי של תאי חולה מתרחש מאוחר יותר בפרוטוקול (ראה שלב 7.6). </li></ol> 6. קבלה, שימור הובלת ביופסיות Pediatric ושט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של סרום ללא בינוני keratinocyte להשלים עם 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​primocin עד 15 צינורות חרוטי מ&quot;ל ולהביא אותו למוקד רפואי על הקרח. הערה: אלה צינורות של המדיום יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד 2 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג כ 8 ביופסיות הוושט בבית tiלי אנדוסקופיה ונפרד כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים שש ביופסיות של חרוטי 15 מ&quot;ל המכיל בינוני חופשי בסרום keratinocyte להשלים עם 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​primocin ומניחים על קרח רטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח ביופסיה אחד ב 5 מיליליטר של פורמלין שנאגר ומניחים על קרח רטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח ביופסיה אחת ביופסיה קטנה cryomold עם מתחם טמפרטורת חיתוך אופטימלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד טיפה עובש זה לתוך מבחנה של איזופנטאן להציב בחנקן נוזלי. לאחר קפוא, למקם את cryomold בשקית הדגימה ולאחסן על קרח יבש במיכל קצף פוליסטירן. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינורות המכילים ביופסיות במדיום או פורמלין בתוך שקית סגר ולאחר מכן לתוך קופסת משלוח המכיל קרח רטוב. חותם תווית בתיבה עם תווית Biohazard ולהעביר אותה למעבדה. הערה: המכל המכיל את הקרח היבש הביופסיה קפוא הוא חתום גם ומסומן עם תווית Biohazard. </li></ol> עיבוד 7.רקמות חולות לתרבות ניתוח Downstream <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהגיעם במעבדה, להעביר הביופסיה קפוא על קרח יבש כדי מקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך חתך במורד הזרם או מיצוי RNA. מניחים את המדגם בפורמלין. אחסן במקרר 4 ° C ולאפשר לתקן לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין הביופסיות הנותרים למטה ב 300 XG, לשאוב את המדיום. הוסף 10 מיליליטר של dispase פתרון הצינור, חותם חרוטים ולאפשר לו לדגור על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה, לסובב את הביופסיות ב g 300 x. לשאוב ביופסיות בינוני ו resuspend ב 5 מ&quot;ל של 0.05% טריפסין- EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את 5 מ&quot;ל של-EDTA טריפסין המכיל הביופסיות לצלחת 100 מ&quot;מ סטרילית לרכך את ביופסיות באמצעות 2 סכיני גילוח מעוקרים כמו קנס ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את 5 מ&quot;ל של-EDTA טריפסין המכיל ביופסיות טחון חרוטי 15 מ&quot;ל חדש. יש לשטוף את הצלחת פעמים עם 5 מיליליטר נוסף של 0.05% טריפסין- EDTA ומוסיף החרוטיםצינור. דגירה הצינור במשך 10 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה, לסובב את הביופסיות למטה XG ב 300 (1.4 סל&quot;ד) במשך 5 דקות ו לשאוב את המדיום. הוסף 5 מ&quot;ל של מדיום תכנות מחדש מותנה צינור חרוטי וכן 5 מ&quot;ל של מדיום תכנות מחדש מותנה המכיל את התאים מזין מוקרן (ראה שלב 5.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מעכב ROCK (1 μL / מ&quot;ל) אל 10 מ&quot;ל של השעיה תא צלחת לאחר aspirating את הג&#39;לטין מצלחת בתרבית רקמה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס. </li></ol> Culturing 8. תאי הרחבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כ 5 ימים של תרבות, לשאוב את המדיום הראשוני המכיל את חתיכות טחון-ביופסיה ולשטוף את צלחת 2-3 פעמים עם 5 מ&quot;ל PBS סטרילית. הוסף בינוני חדש לצלחת כולל מעכבי ROCK ב 10 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהגיעם 70% confluency, להרחיב את התאים. הוסף 5 מ&quot;ל של 0.05% טריפסין- EDTA לצלחת דגירה של 37 מעלות צלזיוס חממה לא יותר מ -2.5 דקות כדי להסיר התאי מזין דואר. לאחר דגירה כי, לשאוב טריפסין-EDTA ולשטוף את צלחת עם 5 מ&quot;ל של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS ולהוסיף 5 מ&quot;ל של 0.25% טריפסין- EDTA לצלחת דגירה במשך 5-10 דקות או עד שהתאים רופפים מהצלחת. להוסיף כמויות שווות של מדיום לצלחת כדי לעצור את התגובה ולהעביר את כל הנוזל לצינור 50 מיליליטר חרוטים והמסובב ב XG 300 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend בנפח מוגדר בינוני תכנות מחדש מותנה ומערבבים 10 μL של ההשעיה עם 10 μL של trypan כחול. סמוך על hemocytometer לקבוע מספר תא הכולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להרחיב את התאים, להוסיף 1 מיליון תאים אנושיים הוושט לצלחת 150 מ&quot;מ יחד עם 1.2 מיליון מוקרן 3T3 תאים בנפח כולל של 15 מ&quot;ל. הוסף מעכב ROCK הטרי 10μM ולהוסיף את השעית התא בצלחת ג&#39;לטין צופה 150 מ&quot;מ. </li></ol> 9. להקפיא חנות אדם תאי הוושט אפיתל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך הקפאה בינונית, מוסיף 10%DMSO עד בינוני תכנות מחדש על תנאי. לאחר trypsinizing ועוד היד נטויה, aliquot התאים להקפיא לתוך צינור 50 מ&quot;ל חרוטי חדש ומסובב ב XG 300 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב הבינוני ומוסיף הקפאה בינונית בהיקף של 2 מיליליטר לכל cryovial. לאחר ההשעיה התא הוא הומוגני, aliquot 10 6 תאים cyrovials מראש שכותרתו. מקום במיכל הקפאה ב -80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות לפני הזזת צלוחיות אחסון חנקן נוזלי לטווח ארוך. </li></ol>

<ol>
	<li>Clark, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esophageal+atresia+and+tracheoesophageal+fistula.">Esophageal atresia and tracheoesophageal fistula.</a> Am Fam Physician. 59 (4), 910-920 (1999).</li><li>Soon, I. S., Butzner, J. D., Kaplan, G. G., deBruyn, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+prevalence+of+eosinophilic+esophagitis+in+children.">Incidence and prevalence of eosinophilic esophagitis in children.</a> J Pediatr Gastroenterol Nutr. 57 (1), 72-80 (2013).</li><li>Sj&#246;qvist, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+orthotopic+transplantation+of+a+tissue-engineered+oesophagus+in+rats.">Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats.</a> Nat Commun. 5, 3562 (2014).</li><li>Saxena, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esophagus+tissue+engineering:+designing+and+crafting+the+components+for+the+'hybrid+construct'+approach.">Esophagus tissue engineering: designing and crafting the components for the 'hybrid construct' approach.</a> Eur J Pediatr Surg. 24 (3), 246-262 (2014).</li><li>Saxena, A. K., Ainoedhofer, H., H&#246;llwarth, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+ovine+esophageal+epithelial+cells+and+in+vitro+esophagus+tissue+engineering.">Culture of ovine esophageal epithelial cells and in vitro esophagus tissue engineering.</a> Tissue Eng Part C Methods. 16 (1), 109-114 (2010).</li><li>Saxena, A. K., Kofler, K., Ainodhofer, H., Hollwarth, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esophagus+tissue+engineering:+hybrid+approach+with+esophageal+epithelium+and+unidirectional+smooth+muscle+tissue+component+generation+in+vitro.">Esophagus tissue engineering: hybrid approach with esophageal epithelium and unidirectional smooth muscle tissue component generation in vitro.</a> J Gastrointest Surg. 13 (6), 1037-1043 (2009).</li><li>Macheiner, T., Kuess, A., Dye, J., Saxena, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+isolation+of+epithelial+cells+from+ovine+esophagus+for+tissue+engineering.">A novel method for isolation of epithelial cells from ovine esophagus for tissue engineering.</a> Biomed Mater Eng. 24 (2), 1457-1468 (2014).</li><li>Mishra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+Mouse+Models+in+Dissecting+the+Mechanism+of+Human+Eosinophilic+Gastrointestinal+Diseases+(EGID).">Significance of Mouse Models in Dissecting the Mechanism of Human Eosinophilic Gastrointestinal Diseases (EGID).</a> J Gastroenterol Hepatol Res. 2 (11), 845-853 (2013).</li><li>Medvedev, S. P., Shevchenko, A. I., Zakian, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+Problems+and+Advantages+when+Applying+them+in+Regenerative+Medicine.">Induced Pluripotent Stem Cells: Problems and Advantages when Applying them in Regenerative Medicine.</a> Acta Naturae. 2 (2), 18-28 (2010).</li><li>Metallo, C. M., Azarin, S. M., Ji, L., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+tissue+from+human+embryonic+stem+cells.">Engineering tissue from human embryonic stem cells.</a> J Cell Mol Med. 12 (3), 709-729 (2008).</li><li>Lee, H., Park, J., Forget, B. G., Gaines, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+in+regenerative+medicine:+an+argument+for+continued+research+on+human+embryonic+stem+cells.">Induced pluripotent stem cells in regenerative medicine: an argument for continued research on human embryonic stem cells.</a> Regen Med. 4 (5), 759-769 (2009).</li><li>Ghaedi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPS+cell-derived+alveolar+epithelium+repopulates+lung+extracellular+matrix.">Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix.</a> J Clin Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).</li><li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. , (2013).</li><li>Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cost-effective+system+for+differentiation+of+intestinal+epithelium+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells.</a> Sci Rep. 5, 17297 (2015).</li><li>Ehrhardt, C., Kim, K. J., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+human+alveolar+epithelial+cells.">Isolation and culture of human alveolar epithelial cells.</a> Methods Mol Med. 107, 207-216 (2005).</li><li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methods+for+the+isolation+of+human+breast+epithelial+and+myoepithelial+cells.">Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 32 (2015).</li><li>Spurrier, R. G., Speer, A. L., Hou, X., El-Nachef, W. N., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+and+human+tissue-engineered+esophagus+form+from+sufficient+stem/progenitor+cells+and+do+not+require+microdesigned+biomaterials.">Murine and human tissue-engineered esophagus form from sufficient stem/progenitor cells and do not require microdesigned biomaterials.</a> Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 906-915 (2015).</li><li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon.">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods Mol Med. 50, 15-20 (2001).</li><li>Southgate, J., Hutton, K. A., Thomas, D. F., Trejdosiewicz, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+human+urothelial+cells+in+vitro:+proliferation+and+induction+of+stratification.">Normal human urothelial cells in vitro: proliferation and induction of stratification.</a> Lab Invest. 71 (4), 583-594 (1994).</li><li>Kalabis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mouse+and+human+esophageal+epithelial+cells+in+3D+organotypic+culture.">Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture.</a> Nat Protoc. 7 (2), 235-246 (2012).</li><li>Geraghty, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+of+cell+lines+in+biomedical+research.">Guidelines for the use of cell lines in biomedical research.</a> Br J Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).</li><li>Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cell Biology. , (2000).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells.">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).</li><li>Suprynowicz, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+reprogrammed+cells+represent+a+stem-like+state+of+adult+epithelial+cells.">Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20035-20040 (2012).</li><li>Davis, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+that+retains+epithelial+characteristics+after+prolonged+culture.">A human retinal pigment epithelial cell line that retains epithelial characteristics after prolonged culture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (5), 955-964 (1995).</li><li>Carro, O. M., Evans, S. A., Leone, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+inflammation+on+the+proliferation+of+human+gingival+epithelial+cells+in+vitro.">Effect of inflammation on the proliferation of human gingival epithelial cells in vitro.</a> J Periodontol. 68 (11), 1070-1075 (1997).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

הצעדים החשובים ביותר על מנת לבודד להרחיב בתאי אפיתל הוושט ביופסיות המטופל הם: 1) כראוי מתנער הדגימה יחד מוות של תאים מינימלי; 2) להבטיח מעכב ROCK מתווסף בינוני תרבית תאים בכל החלפה בינונית; 3) אין להשתמש תאים מזינים יותר ממומלץ; 4) לשמור על תרבות מזוהמת נקיה; ו -5) תאים מעבר ר?...

הנדסת רקמות בושט דלקת ושט אאוזינופילית (EOE) הייתה במוקד המחקר במעבדות רבות בעשור האחרון. מומים מולדים, כגון atresia ושט, נראים כ 1 ב -4,000 לידה חייה, שתוצאתה הפיתוח השלם של הוושט המוביל את חוסר היכולת לאכול 1. שכיחות ושכיחות EOE היו במגמת עלייה מאז זיהוי של הישות המחלה בשנת 1993. תחולת EOE נע בין 0.7 כדי 10 / 100,000 לנפש שנים והשכיחות נע מ -0.2 כדי 43 / 100,000 2. גישה כירורגית אטרקטיבית חדשה בטיפול atresia ושט פער ארוך מורכבת ביצירת מבני רקמות להשתלת ניצול התא של החולה עצמו. תאים אלה בשיתוף עם פיגומים סינטטיים יפיקו מבנה עצמי שאינו דורש דיכוי מערכת חיסוני. חלק מהקבוצות כבר החלו לחקור את לנודואר של תאים דמויי גזע עבור הנדסת רקמות ושט 3 וכן שימוש בתאי אפיתל ושט יליד לאכלס מחדש את הרירית 4 - 7. מחלות שנמצאים הוושט של מטופלים ילדים הם לעתים קרובות קשה לאבחן או ללמוד ללא התערבות. יתר על כן, מודלים של בעלי חיים תוך ניצול או במבחנה הנציחו מודלי שורת תאים למחל ילדים כמו EOE לא להקיף את בהיווצרות המחלה המדויקת או הבדלים מסוימים חולה 8. לכן, היכולת ללמוד תהליך מחלתו של מטופל במבחנה כדי לזהות אנטיגנים מפעילים מחלה ספציפי, להעריך מנגנונים ולחקור טיפולים תרופתיים יהיה רומן ולספק לרופאים עם מידע שיכול לסייע בטיפול בחולה. היו הרבה סוגי תאים עצמיים או חולה ספציפי כי הוצעו לשימוש tissuהנדסת דואר ולומד בהיווצרות מחלה אנושית. עם זאת, חלק של סוגי תאים אלו מוגבלים ביכולת שלהם לייצר מספיק תאים של פנוטיפ ספציפי זרע פיגום גדול או לבצע העברת נתונים גבוהות במבחנה. השימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים או מולטיפוטנטיים כבר נושא לדיון מחקר רב, עם זאת, מגבלות וליקויים עבור באמצעות תאים אלה כבר היטיב לתאר 9. השימוש בתאי גזע עובריים אנושיים הוא התווכח מאוד ומציג שאלות אתיות רבות. והחשוב מכל, תאים אלה יוצרים teratomas, דומי גידול, אם הם אינם מובחנים מן פלוריפוטנטיים מדינתם לפני מתן אותם שורת חיים 10. יתר על כן, השימוש בתאי גזע עובריים לא יהיה חולה ספציפי ויכול לעורר תגובה אלוגנאית וצורך דיכוי מערכת חיסוני 10. תאי גזע מושרים (iPSCs) הם תאים פלוריפוטנטיים שיכולהלהיות שמקורם בתאים עצמו חולה. תאים סומטיים, כגון תאי עור, יכולים להיגרם למדינה פלוריפוטנטיים תוך שימוש במגוון של טכניקות אינטגרטיבית בלתי משתלבות. תאים אלה לשמש מקורות תא ספציפי לחולה עבור הנדסת רקמות או חקירת מחלה. השילוב של חומר גנטי לא רצוי לתוך התאים אלה הוא דאגה רבה תארה וגם אם רצפים הם הוסרו לחלוטין iPSCs להופיע לשמר אפיגנטיים &quot;זיכרון&quot; לקראת סוג התא שממנו הם נגזרו 11. תאים אלה גם יהוו teratomas in vivo אם לא הבדיל לפני ההשתלה 11. פרוטוקולי בידול רבים נחקרו התמקדות שושלות אפיתל 12, 13, 14, לעומת זאת, חשוב מאוד לציין כי סוגי התא וכתוצאה מכך בסוף הבידול אינם עשויים מקשה אחת ו- Only להחזיק חלק מן סוג התא של עניין. התוצאה היא תשואה נמוכה והצורך לטהר את סוג התא הרצוי. למרות iPSCs הוא מקור תא חולה ספציפי פוטנציאל, התהליך כדי לקבל סוג תא של עניין עבור הנדסה או רקמות או חקירת מחלה הוא מאוד לא יעיל. תאי אפיתל אדם בודדו בהצלחת ממגוון הוא לרקמות חולות ולא חולה בגוף האדם כולל: ריאות 15, שד 16, מעי דק 17, מעי גס 18, שלפוחית שתן 19 ו -20 ושט. חשוב לציין כי תאים ראשוניים אדם יש מספר סופי של הקטעים שבהם הפנוטיפ נשמר 21, 22. למרבה הצער, זה אומר כי מספר התאים הדרושים לחקירת מחלה או זריעת פיגום מהונדסלהשתלה לא יכול להיות מושגת. לכן, טכניקות חדשות נדרשות להרחיב תאי מטופל, תוך שמירה על פנוטיפ אפיתל. תכנות מחדש מותנה של תאי אפיתל תקינים ותאי סרטן ניצול מזין תאים ו מעכב ROCK תוארה בשנת 2012 על ידי Liu et al. 2 3. טכניקה זו נוצלה כדי להרחיב לתאי האפיתל סרטניים המתקבלים ביופסיות של סרטן הערמונית וסרטן השד באמצעות תאי מזין מוקרנים, מעכב ROCK ובינוני תכנות מחדש על תנאי. המטרה היתה לייצר תאים מספיק עבור מבחני חוץ גופית כגון הקרנת סמים. טכניקה זו מסוגלת הרחבת תאי אפיתל ללא הגבלת זמן על ידי &quot;תכנות מחדש&quot; של תאים אלה גבעול או המדינה- כמו אבי, שהוא שגשוג מאוד. הוכח כי התאים האלה הם בלתי tumorigenic ואינם בעלי יכולת לגבש teratomas 23, 24. יתר על כן, לאפגמים בכרומוזומים או מניפולציות גנטיות נכחו לאחר passaging תאים אלה בתרבות באמצעות טכניקה זו 23, 24. והחשוב מכל, תאים אלה הם רק מסוגלים להתמיין לסוג תא יליד העניין. לכן, טכניקה זו מציעה מאגר גדול של תאי אפיתל מטופל ספציפי לחקירת מחלה או הנדסת רקמות ללא צורך הנצחה. קבלת רקמות אפיתל מאיבר מסוים על מנת ללמוד תהליכי מחלה עשויה להיות מצומצמת ולא תמיד אפשרית בשל סיכון מטופל. עבור אותם חולים הסובלים ממחלת ושט או פגמים, תחזור ביופסיה אנדוסקופית היא גישה פולשנית להשגת רקמת אפיתל שניתן ניתקת לתכנות מחדש על התנאי לספק מקור תא מוגדר ספציפי הרירי של אותו הוושט חולה. אז זה מאפשר ללימודי חוץ גופיתשל תאי אפיתל להעריך תהליכי מחלה ומסך עבור הרפוי פוטנציאלי. תהליך המחלה אחד שיכול להפיק תועלת רבה מן גישה זו היא דלקת ושט אאוזינופילית, אשר תוארה מחלות אלרגיות של הוושט 8. בדיקות אלרגיה כמו גם גישות טיפוליות ניתן היה להעריך במבחנה תוך שימוש בתאי האפיתל של החולה עצמו ונתונים אלה לאחר מכן ניתן עברו על הרופא המטפל לפתח תוכניות טיפול אישיות. הטכניקה של תכנות מחדש מותנה בשיתוף עם קבלת ביופסיות אנדוסקופיות מחולי ילדים מציעה את היכולת להרחיב את תאי אפיתל ושט נורמלים ללא הגבלה זמן מכל חולה. מקור תא זה יכול אפוא להיות חבריו בפיגום טבעי או סינטטי לספק אפשרות כירורגית מטופל ספציפי עבור פגמים, מחלה או טראומה. לאחר מספר תאים בלתי מוגדר יעזור להנדס בונת ושט המשתלטת על reseeded לחלוטיןלומן עם תאי אפיתל הוושט כדי לעזור להקל על התחדשות של תאים מסוגים הנותרים.

<table><tbody><tr><td>Primocin</td><td>InVivogen</td><td>ant-pm2</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>277258-1L</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin From Porcine Skin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>TissueTek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>Cryomatrix OCT</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conical Tubes</td><td>Denville Scientific</td><td>C1017-p</td><td></td></tr><tr><td>Complete Keratinocyte Serum Free Medium</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10724011</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Insulin Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ml</td><td></td></tr><tr><td>Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>ROCK Inhibitor (Y-27632)</td><td>Fisher Scientific</td><td>125410</td><td></td></tr><tr><td>F-12 Medium&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Denville Scientific</td><td>FB5001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Dishes</td><td>Denville Scientific</td><td>T1110-20</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Dishes</td><td>Denville Scientific</td><td>T1115</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conicals</td><td>Denville Scientific</td><td>&amp;nbsp; C1062-9&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811</td><td></td></tr><tr><td>9&quot; Pasteur Pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3 Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL1658</td><td></td></tr></tbody></table>

conditional reprogramming of pediatric human esophageal epithelial cells for use in tissue engineering and disease investigation

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient's symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.

<html> סיכום של צעדי מפתח לבודד תאי אפיתל ושט ביופסיות חולה מסוכם באיור 1. מושבות של תאי אפיתל תהווינה כ 4-5 ימים ויהיו מוקפות תאי מזין פיברובלסטים (איור 2 א). כמו מושבות אלה להרחיב הם יתמזגו עם מושבות אחרות כדי ליצור מושבות גדולות יותר <str...

Watch this Scientific Journal Video about Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation at JoVE.com

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

הרחבת תאי אפיתל ושט ילדים אנושיים ניצול תכנות מחדש מותנה מספקת חוקרים עם אוכלוסיית חולים ספציפיים של תאים שיכולים להיות מנוצלת עבור הנדסת בונת ושט להשתלה אוטולוגית לטיפול פגמים או פציעה ומגיש כמאגר מבחני מיון טיפוליים.

תכנות מחדש מותנה של תאי אפיתל ושט האדם Pediatric לשימוש בהנדסת רקמות וחקירת מחלות

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

conditional-reprogramming-pediatric-human-esophageal-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.9K Views.  UConn Health.  הרחבת תאי אפיתל ושט ילדים אנושיים ניצול תכנות מחדש מותנה מספקת חוקרים עם אוכלוסיית חולים ספציפיים של תאים שיכולים להיות מנוצלת עבור הנדסת בונת ושט להשתלה אוטולוגית לטיפול פגמים או פציעה ומגיש כמאגר מבחני מיון טיפוליים. 

Video: Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They are also involved in many airway diseases through their innate immune response and interaction with immune and airway stromal cells. NECs are of particular interest for studies in children due to their accessibility during clinical visits. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been generated from multiple cell types and are a powerful tool for modeling human development and disease, as well as for their potential applications in regenerative medicine. This is the first protocol to lay out methods for successful generation of iPSCs from NECs derived from pediatric participants for research purposes. It describes how to obtain nasal epithelial cells from children, how to generate primary NEC cultures from these samples, and how to reprogram primary NECs into well-characterized iPSCs. Nasal mucosa samples are useful in epidemiological studies related to the effects of air pollution in children, and provide an important tool for studying airway disease. Primary nasal cells and iPSCs derived from them can be a tool for providing unlimited material for patient-specific research in diverse areas of airway epithelial biology, including asthma and COPD research.

This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

טפח תאי אפיתל באף הראשי מיילד לתכנת מחדש לתאי גזע מושרים

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

ייצור, אפיון ופוטנציאל שימושים של הוושט רירי דגם אדם מהונדס-רקמות 3D

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Bioengineering

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues. 
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRP&#945; and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

בניית רקמות לב Engineered האנושית תחם לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

הקמתו של ארגון Human אפיתל Enteroids וColonoids מרקמות שלמות וביופסיה

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Medicine

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants that circumvent histocompatibility barriers. However, progression through a pluripotent state and subsequent complete differentiation into desired lineages remains a roadblock for the clinical translation of iPSC technology because of the associated neoplastic potential and genomic instability. Recently, we and others showed that somatic cells cannot only be converted into iPSCs but also into different types of multipotent somatic stem cells by using defined factors, thereby circumventing progression through the pluripotent state. In particular, the direct conversion of human fibroblasts into induced neural progenitor cells (iNPCs) heralds the possibility of a novel autologous cell source for various applications such as cell replacement, disease modeling and drug screening. Here, we describe the isolation of adult human primary fibroblasts by skin biopsy and their efficient direct conversion into iNPCs by timely restricted expression of Oct4, Sox2, Klf4, as well as c-Myc. Sox2-positive neuroepithelial colonies appear after 17 days of induction and iNPC lines can be established efficiently by monoclonal isolation and expansion. Precise adjustment of viral multiplicity of infection and supplementation of leukemia inhibitory factor during the induction phase represent critical factors to achieve conversion efficiencies of up to 0.2%. Thus far, patient-specific iNPC lines could be expanded for more than 12 passages and uniformly display morphological and molecular features of neural stem/progenitor cells, such as the expression of Nestin and Sox2. The iNPC lines can be differentiated into neurons and astrocytes as judged by staining against TUJ1 and GFAP, respectively. In conclusion, we report a robust protocol for the derivation and direct conversion of human fibroblasts into stably expandable neural progenitor cells that might provide a cellular source for biomedical applications such as autologous neural cell replacement and disease modeling.

Generation of induced pluripotent stem cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants. However, progression through a pluripotent state and laborious re-differentiation still hinders clinical translation. Here we describe the derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into induced neural progenitor cells and the subsequent differentiation into neural lineages.

גזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה ישירה שלהם לתאים להרחבה עצבי אב

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Neuroscience

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant technique with nutritional support. Recently, there have been many attempts at esophageal tissue engineering, but the success rate has been limited due to difficulty in early epithelization in the special environment of peristalsis. Here, we developed an artificial esophagus that can improve the regeneration of the esophageal mucosa and muscle layers through a two-layered tubular scaffold, a mesenchymal stem cell-based bioreactor system, and a bypass feeding technique with modified gastrostomy. The scaffold is made of polyurethane (PU) nanofibers in a cylindrical shape with a three-dimensional (3D) printed polycaprolactone strand wrapped around the outer wall. Prior to transplantation, human-derived mesenchymal stem cells were seeded into the lumen of the scaffold, and bioreactor cultivation was performed to enhance cellular reactivity. We improved the graft survival rate by applying surgical anastomosis and covering the implanted prosthesis with a thyroid gland flap, followed by temporary nonoral gastrostomy feeding. These grafts were able to recapitulate the findings of initial epithelialization and muscle regeneration around the implanted sites, as demonstrated by histological analysis. In addition, increased elastin fibers and neovascularization were observed in the periphery of the graft. Therefore, this model presents a potential new technique for circumferential esophageal reconstruction.

Esophageal reconstruction is a challenging procedure, and development of a tissue-engineered esophagus that enables regeneration of esophageal mucosa and muscle and that can be implanted as an artificial graft is necessary. Here, we present our protocol to generate an artificial esophagus, including scaffold manufacturing, bioreactor cultivation, and various surgical techniques.

רקמת הנדסה לשיקום שחזור הוושט בחולדות

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in regenerative medicine and bioreactor technologies offer opportunities to produce lab-grown functional tissue and organ constructs that can be used to screen drugs, model disease, and engineer tissue replacements. Here, a miniaturized bioreactor coupled with an imaging modality that allows in situ visualization of the inner lumen of explanted rat trachea during in vitro tissue manipulation and&#160;culture is described. Using this bioreactor, the protocol demonstrates imaging-guided selective removal of endogenous cellular components while preserving the intrinsic biochemical features and ultrastructure of the airway tissue matrix. Furthermore, the delivery, uniform distribution, and subsequent prolonged culture of exogenous cells on the decellularized airway lumen with optical monitoring in situ are shown. The results highlight that the imaging-guided bioreactor can potentially be used to facilitate the generation of functional in vitro airway tissues.

The protocol describes an imaging-enabled bioreactor that allows the selective removal of the endogenous epithelium from the rat trachea and homogenous distribution of exogenous cells on the lumen surface, followed by long-term in vitro culture of the cell-tissue construct.

ביוריאקטור מונחה הדמיה ליצירת רקמת נתיב אוויר מהונדסת ביולוגית

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional (3D) structures. One of the main functions of epithelia is the formation of barriers that protect the underlining tissues against physical and chemical insults and infectious agents. In addition, epithelia mediate the transport of nutrients, hormones, and other signaling molecules, often creating biochemical gradients that guide cell positioning and compartmentalization within the organ. Owing to their central role in determining organ-structure and function, epithelia are important therapeutic targets for many human diseases that are not always captured by animal models. Besides the obvious species-to-species differences, conducting research studies on barrier function and transport properties of epithelia in animals is further compounded by the difficulty of accessing these tissues in a living system. While two-dimensional (2D) human cell cultures are useful for answering basic scientific questions, they often yield poor in vivo predictions. To overcome these limitations, in the last decade, a plethora of micro-engineered biomimetic platforms, known as organs-on-a-chip, have emerged as a promising alternative to traditional in vitro and animal testing. Here, we describe an Open-Top Organ-Chip (or Open-Top Chip), a platform designed for modeling organ-specific epithelial tissues, including skin, lungs, and the intestines. This chip offers new opportunities for reconstituting the multicellular architecture and function of epithelial tissues, including the capability to recreate a 3D stromal component by incorporating tissue-specific fibroblasts and endothelial cells within a mechanically active system. This Open-Top Chip provides an unprecedented tool for studying epithelial/mesenchymal and vascular interactions at multiple scales of resolution, from single cells to multi-layer tissue constructs, thus allowing molecular dissection of the intercellular crosstalk of epithelialized organs in health and disease.

The present protocol describes the capabilities and the essential culture modalities of the Open-Top Organ-Chip for the successful establishment and maturation of full-thickness organ-on-chip cultures of primary tissues (skin, alveolus, airway, and intestine), providing the opportunity to investigate different functional aspects of the human epithelial/mesenchymal and vascular niche interface in vitro.

שחזור ציטוארכיטקטורה ותפקוד של רקמות אפיתל אנושיות על שבב-איבר פתוח

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional ...

אורגנואידים של הוושט האנושי ופרוטוקולי תרבית ממשק אוויר-נוזל

Three-Dimensional Cell Culture Models to Investigate the Epithelial Barrier in Eosinophilic Esophagitis

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and microbes. Maintaining the integrity of the epithelial barrier is critical for preventing infections and avoiding inflammation caused by harmless food-derived antigens. This article provides simplified protocols for generating human esophageal organoids and air-liquid interface cultures from patient biopsies to study the epithelial compartment of the esophagus in the context of tissue homeostasis and disease. These protocols have been significant scientific milestones in the last decade, describing three-dimensional organ-like structures from patient-derived primary cells, organoids, and air-liquid interface cultures. They offer the possibility to investigate the function of specific cytokines, growth factors, and signaling pathways in the esophageal epithelium within a three-dimensional framework while maintaining the phenotypic and genetic properties of the donor. Organoids provide information on tissue microarchitecture by assessing the transcriptome and proteome after cytokine stimulation. In contrast, air-liquid interface cultures allow the assessment of the epithelial barrier integrity through transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux measurements. Combining these organoids and air-liquid interface cultures is a powerful tool to advance research in impaired esophageal epithelial barrier conditions.

מחבר זרקור: חקירת הפתופיזיולוגיה של דלקת הוושט האאוזינופילית

Here, a protocol for the culture of human esophageal organoids and air-liquid interface culture is provided. Esophageal organoids' air-liquid interface culture can be used to study the impact of cytokines on the esophageal epithelial barrier.