אנו מודים מיכאל VanNieuwenhze (אוניברסיטת אינדיאנה) על המתנה של FDAAs בשימוש איור 2 באיור 4. אנו מודים חברי המעבדה חום לקבלת משוב במהלך הכנת כתב היד הזה. המחקר במעבדה חום על צמיחת תאים tumefaciens א וחילוק נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע (IOS1557806).

1. צמיחה של זנים tumefaciens א
<ol><li>
Culturing זנים tumefaciens א
	<ol>
<li>השתמש עצה מקל או pipet עץ סטרילי כדי לחסן 1 מ"ל של צמיחה ATGN מדיה (ראה רשימת חומרים על המתכון) עם מושבה בודדת של המתח הרצוי. הערה: עבור זנים דלדול א tumefaciens , ATGN צריכה להכיל 1 מ"מ IPTG כמו משרן כדי לשמור על ביוסינטזה של החלבון חיוני.</li>
		<li>גדלים זנים tumefaciens א לילה ב- ATGN ב- 28 מעלות צלזיוס ברעידות-225 סל ד.</li>
		<li>למדוד את הצפיפות האופטית של התאים על 600 nm (OD600) באמצעות ספקטרופוטומטרים. לדלל את התרבות התא כדי OD600 = ~0.2 ולהמשיך לגדול עד OD600 = ~0.6 מתמלאת. עבור זנים דלדול, להמשיך לגדול עם משרן עד OD600 = ~0.6 מתמלאת.</li>
		<li>השתמש wildtype ו מוטנטים זני tumefaciens א -OD600 = ~0.6 במטרה להכתים ו/או מיקרוסקופ בצילום מואץ (ראו סעיפים 2 ו- 3.1). עבור זנים דלדול, לשטוף משרן (ראו סעיף 1.2.)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הסרה של משרן פלואורסנציה זנים דלדול חלבון tumefaciens א
	<ol>
<li>גלולה 1 מ"ל של תרבות מעריכית (OD600 = ~0.4-0.6) על ידי צנטריפוגה-7,000 g x עבור 5 דקות ב צנטריפוגה שולחנית בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לשטוף, להסיר את תגובת שיקוע resuspend בגדר בתקשורת טריים ללא משרן ו הצניפה התאים כפי שתואר לעיל (1.2.1). לשטוף התאים סך של 3 פעמים בתקשורת טריים.</li>
		<li>Resuspend בגדר הסופי בתקשורת טריים ותתרכזו לתאים יתר600 = ~0.8 עבור צביעת מיידית עם יעד ספציפיות צבע (סעיף 2 ו- 4B איור-D) או מיקרוסקופ בצילום מואץ (סעיף 3.2 ואיור 4A) . לחלופין, מראש לרוקן את התאים עבור משך הזמן הרצוי על ידי גידול התאים בתקשורת ללא משרן לפני צביעת והדמיה של התאים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. במטרה להכתים של תאים tumefaciens א
<ol><li>
תיוג פלורסנט דופן התא חומצה אמינו d הערה: FDAAs הן רעיל חומצות אמינו d פלורסנט אשר משולבים ברצון פפטידוגליקן tumefaciens א . הליך זה תיוג פשוטות רגשים צמיחה תכנים תאים חיים6. פרוטוקולים של סינתזה של ארבעה FDAAs הינם זמינים38.<ol>
<li>גלולה 500 µL של תרבות מעריכית (OD600 = ~0.4-0.6) על ידי צנטריפוגה-7,000 g x עבור 5 דקות ב צנטריפוגה שולחנית. Resuspend בגדר תא ב- 100 µL של התקשורת טריים.</li>
		<li>להוסיף 5 µL של 5 מ מ FDAA כדי לשטוף מרוכז התאים ואת תקופת דגירה של 2 דקות בחושך. הערה: להגביל FDAA חשיפה לאור. תקופת הדגירה משתנה בהתאם אחוז הצמיחה של המתח. בדרך כלל, דגירה פעמים צריך להיות 5-10% של זמן ההכפלה6.</li>
		<li>גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ולשטוף תא כדורי בתמיסת פוספט buffered (PBS) שלוש פעמים.</li>
		<li>Resuspend צנפה ב- PBS µL ~ 50. הערה: הנפח של PBS משמש resuspension עשויים להשתנות בהתבסס על גודל גלולה.</li>
		<li>החלת 0.8-1 µL תאים agarose pad ולאחר התמונה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence מיד (ראה סעיפים 3.1 ו- 3.2).<ol>
<li>לחלופין, לעצור עוד תווית התאגדות על ידי תיקון התאים עם אתנול 70% קר כקרח. Resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל אתנול 70% קר כקרח, דגירה על קרח למשך 15 דקות.</li>
			<li>איסוף תאים על ידי צנטריפוגה, resuspend, נפח קטן של PBS עבור הדמיה במועד מאוחר יותר. חנות תא המתלים ב 4 ° C ו תמונה בתוך 48 שעות.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA מכתים עם דאפי או כתם כתום הערה: כדי לצפות דנ א מבנה תאים מסומנים עם דאפי או כתום (הכתם תאים מתים). למרות בסגנון קלאסי מתואר "כתם תאים מתים", כתום הוא permeant, photostable, ואינו משפיע על הצמיחה של תאים חיידקיים, המאפשרים לחיות תאים DNA הדמיה10. ב א tumefaciens, יצירות תיוג תפוזים טוב בתאים חיים ומתאים לכל זמן לשגות מיקרוסקופ (איור 3). לעומת זאת, אולטרה סגול (UV) אור החשיפה הכרחי עבור תאים שהוכתמו דאפי הדמיה הוא פוטוטוקסי (איור 3) והוא ובכך דאפי מכתים המתאימה ביותר עבור צביעת תאים חיים מיידית הדמיה או צביעת תאים קבוע.<ol>
<li>דאפי צביעת תאים<ol>
<li>גלולה 1 מ"ל של תרבות מעריכית (OD600 = ~0.4-0.6) על ידי צנטריפוגה-7,000 g x עבור 5 דקות ב צנטריפוגה שולחנית.</li>
			<li>לחלופין, כדי לתקן תאים לפני צביעת, resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל אתנול 70% קר כקרח. דגירה על קרח במשך 10-15 דקות לאסוף התאים על ידי צנטריפוגה כפי שמתואר 2.2.1.1.</li>
			<li>Resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של PBS המכיל 1 µL של דאפי מניות פתרון (1 מ"ג/מ"ל; ראה טבלת חומרים). לערבב בעדינות על-ידי pipetting, תקופת דגירה של 5 דקות בחושך.</li>
			<li>גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב g x כ-7,000 במשך 5 דקות, resuspend ב 1 מ"ל של PBS כדי להסיר עודפי דאפי. רוחצים את התאים עוד פעמיים את resuspend בגדר PBS 50 µL או מדיה.</li>
			<li>החלת 0.8-1 µL תאים agarose pad ולאחר התמונה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence מיד. ראה סעיפים 3.1 ו- 3.2. הערה: פרוטוקול זה אינה אופטימלית עבור זמן לשגות מיקרוסקופ להתבונן כרומוזום דינמיקה (איור 3). שקול להשתמש מכתים כתום כחלופה (ראו סעיף 2.2.2).</li>
		</ol>
</li>
		<li>כתמים כתומים של תאים חיים</li>
		<li>גלולה 1 מ"ל של תרבות מעריכית (OD600 = ~0.4-0.6) על ידי צנטריפוגה-7,000 g x עבור 5 דקות ב צנטריפוגה שולחנית. Resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל של PBS המכיל 1 µL של תפוז פתרון מניות (ראה רשימה). לערבב בעדינות על-ידי pipetting, תקופת דגירה של 5 דקות בחושך.</li>
		<li>גלולה תאים על ידי צנטריפוגה, resuspend ב 1 מ"ל של PBS כדי להסיר עודפי כתום. רוחצים את התאים עוד פעמיים את resuspend בגדר ב- 50 µL PBS.</li>
		<li>החלת 0.8-1 µL תאים agarose pad ולאחר התמונה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence מיד. ראה סעיפים 3.1 ו- 3.2. הערה: פרוטוקול זה עובד היטב עם תאים חיים ומתאים לכל זמן לשגות מיקרוסקופ להתבונן כרומוזום דינמיקה (איור 3). אם זה לא נוח ליצור תמונה מיד, ניתן לתקן תאים ב- 70% קר כקרח אתנול (ראו סעיף 2.2.1.2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ממברנה תיוג הערה: הפלורסנט יפה lipophilic styryl 4-64 כבר בשימוש נרחב להתבונן הקרום של תאים חיידקיים. בניגוד חיידקים רבים, 4-64 הנקרא tumefaciens א תאים לא תווית בצורה אחידה, אבל מעדיף לעתים קרובות להציג "פרסה" דפוס14,15. למרבה הפלא, הקוטב הצמיחה היא כמעט ריק הכתם בעוד הקוטב הישן תוצמד באופן אינטנסיבי. לפיכך, 4-64 מאפשר הדמיה של דפוסי הצמיחה התא והן מבנה הממברנה tumefaciens א.<ol>
<li>להוסיף FM 4-64 ריכוז הסופי של µg/mL 8 ב- 1 מ"ל של תרבית תאים שלב מעריכית, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות בחושך.</li>
		<li>גלולה תאים עם תוויות על ידי צנטריפוגה ב g x כ-7,000 במשך 5 דקות ב צנטריפוגה שולחנית, resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל ל- PBS. לשטוף התאים בסך הכל שלוש פעמים כדי להסיר צבע עודף.</li>
		<li>Resuspend בתאים נפח קטן של PBS, כתם על רכיב pad agarose לשיקוף מיד. (ראה סעיפים 3.1 ו- 3.2) התראה: תאים חייב לדימות מיד לבחון דפוסי תיוג אופיינית.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הדמיה של תאים tumefaciens א
<ol><li>
הכנת משטח Agarose הערה: איור 1 כולל, רצף תמונות (לוח א') ו סכמטית כרית agarose טיפוסי מוכן מיקרוסקופ בצילום מואץ (לוח ב'). רפידות Agarose מוכנים בדרך כלל לפי הצורך.<ol>
<li>3.1.1. השתמש coverslip מדריך, חתך 22 מ מ x 22 מ מ מרובע של מעבדה סרט (ראה רשימה) על-ידי הפעלת אזמל בקצוות.</li>
		<li>לגזור ריבוע במרכז הסרט מעבדה עוזב ~ 2-5 מ מ הגבול כדי לשמש אטם עבור משטח agarose. למחוק את מרכז אזור החיתוך.</li>
		<li>מקם את האטם הסרט לשקופית זכוכית (75 מ"מ x 25 מ"מ) ניקיתי עם אמוניה, מנקה ללא אלכוהול (ראה רשימה) וחום עד הסרט מעט נמס על גבי זכוכית (תמונה עליונה באיור 1A). להמיס הסרט מעבדה, להשתמש בקצה ערכה גוש חום עד 70 ° C או להמיס בקלילות מעל להבה.</li>
		<li>הכן agarose פתרון על ידי ערבוב ~0.075 g agarose (ראה רשימה) ב 5 מ של התקשורת בקבוקון קטן. מחממים את הפתרון במיקרוגל עם מתערבל תקופתיים לערבב עד התפרקה agarose הפתרון ברור. לשמור את הפתרון agarose 55-70 ° C ולהשתמש לבנייה של רפידות agarose מרובים תוך 48 שעות.</li>
		<li>פיפטה המדיה המכילה 1.2-1.5% agarose אל מרכז האטם. הערה: הנפח של המדיה הוא בדרך כלל 50-60 µL אך ישתנו בהתבסס על גודל האטם. הוספת מדיה לשקופית קר יכולה לגרום agarose שבמהלכו מהר מדי, כך לשקופית יש לשמור על משטח חם. הקצה של גוש חום מוגדר 70 ° C עובד טוב. מים agarose או agarose במאגר פתרונות כגון פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) יכול לשמש במקום המדיה המכילה agarose עבור יישומים שבהם תא המשך הצמיחה אינה נדרשת. עבור הדמיה דלדול זנים, משרן ניתן להציג או נעדר בתקשורת. נוכחות של משרן יכול לשמש בתור פקד ואילו היעדר משרן תחשוף את דלדול פנוטיפ.</li>
		<li>המקום coverslip מעל האטם לפיזור אחיד של agarose.</li>
		<li>במקום שקופיות על משטח קריר, רמת שבמהלכו עבור ~ 2 מינימלית להימנע overdrying של משטח agarose כמו התוצאה תהיה משטח קמטים על משטח agarose ואיגום של התליה תא כאשר מוחל על פני השטח.</li>
		<li>החלק בזהירות את coverslip את משטח agarose. התראה: אל תאיץ שלב זה. משטח agarose יכול לקרוע בקלות, רכיב pad agarose לא אחידה עלולה להקשות הדמיה.</li>
		<li>לאפשר משטח agarose מהאוויר להתייבש במשך 1-2 דקות בטמפרטורת החדר להופעת המשטח יבש. באמצעות אזמל, להסיר רצועה קטנה של agarose כדי ליצור כיס אוויר (האמצעי תמונה, איור 1A); לכיס אוויר בדרך כלל ~ 2 מ"מ x 7-10 מ"מ, tumefaciens א התאים נוטים לגדול ביותר ליד לכיס אוויר (איור 1C). הערה: עבור הדמיה של תאים קבוע או בתנאים שבו הצמיחה שאינו מפוקח, כיס אוויר אינו הכרחי.</li>
		<li>ספוט 0.8-1 µL של תאים על משטח agarose, לכסות עם coverslip החדש. הנח בעדינות את coverslip מעל משטח agarose להפיץ את התאים על פני משטח agarose.</li>
		<li>לאטום את הקצוות של coverslip באמצעות VALAP נמס (ראה את הטבלה חומרים למתכון; איור 1A, בתחתית התמונה). כשל לאטום לאורך כל בקצוות ובפינות של coverslip יכולה לגרום התייבשות משטח agarose, אשר יוביל נסחף של תאים במהלך דימות. הערה: איטום coverslip נדרשת רק עבור הדמיה בצילום מואץ לטווח ארוך.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56497/56497fig1.jpg"> איור 1: הכנת משטח Agarose. (א) תמונה רצף פרוטוקול הכנה agarose pad. תמונה 1 הוא שקופית עם gasket הסרט מעבדה. בתמונה 2, הם דמיינו את משטח agarose ואת כיס אוויר. בסופו של דבר, התמונה 3 מראה את משטח agarose מלאה עם התאים תחת coverglass ואטום עם VALAP. (B) A תרשים סכמטי של רכיב pad agarose עבור זמן לשגות מיקרוסקופ מסופק. תכונות מפתח של משטח agarose מסומנות על התרשים. (ג) לכיס אוויר לקדם צמיחה של tumefaciens א -agarose רפידות. מוצגות תמונות של תאים tumefaciens א wildtype גדל על רכיב pad agarose במשך 20 שעות. התמונות צולמו ב עמדות יותר ויותר רחוק לכיס אוויר. המרחק מהקצה הקרוב ביותר של התמונה לכיס אוויר מוצג מעל כל תמונה. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56497/56497fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol start="2"><li>
הדמיה הערה: התערבות דיפרנציאלית ניגודיות, חדות שלב ו epifluorescence הדמיה מתבצע באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מצויד autofocusing שותק מבוססי חומרה, שלב אוטומטיות, מסננים רגיל, מקור אור LED, טבילה שמן X 60 מטרות (1.4 NA) עבור שלב חדות או התערבות דיפרנציאלית ניגודיות (DIC), מצלמה 1 ג הכפלת אלקטרון תשלום מצמידים-התקן (EMCCD). המיקרוסקופ יוצב בחדר מבוקרת טמפרטורה. לחלופין, הבמה החמים או קאמרית יכול לשמש כדי לשמור על טמפרטורה עקבית במהלך דימות.<ol>
<li>מיקרוסקופ Epifluorescence הערה: עבור קרינה פלואורסצנטית הדמיה של תאים חיים, זה הכרחי להגביל את מספר התמונה רכישות ולמטב את זמן החשיפה כדי למזער את photobleaching ואת phototoxicity. עבור הדמיה של כל צבע, מומלץ למצוא זמן חשיפה אופטימלית בלתי מספקת זיהוי קרינה פלואורסצנטית מספיק אך לא תוביל photobleaching או phototoxicity. דמויות 2-4פעמים חשיפה של 200 ms שימשו לכל התמונות זריחה. עבור רצפי זמן לשגות בתרשים 3, תמונות נרכשו בכל 10 דקות במשך 3 שעות.<ol>
<li>במקום שמן טבילה על המטרה הרצויה ומניחים את השקופית הפוך לתוך מחזיק שקופיות על הבמה. השימוש בידית התמקדות להביא את התאים להתמקד.</li>
			<li>לרכוש תמונות שלב (או DIC) ומסנן קרינה פלואורסצנטית הרצוי. הערה: מקסימלי עירור, פליטה אורכי הגל עבור שהכתמים בשימוש איור 2, איור 3ו- 4 איור הם כדלקמן: HADA (405/460), נאדה (450/555), ג'אר (555/570), 4-64 (515/640), דאפי (360/460), כתום (547/570).</li>
		</ol>
</li>
		<li>מיקרוסקופ בצילום מואץ הערה: במהלך זמן לשגות מיקרוסקופ התכונות הבאות הן מחשב הנשלט: x, y ו- z עמדה, תריסים, קרינה פלואורסצנטית ומסננים. מערכת פוקוס אוטומטי המבוסס על חומרה היא אופטימלית כדי לשמור על ריכוז במהלך דימות זמן לשגות. לחלופין, ניתן להשתמש הלולאה-מבוססות תוכנה מיקוד אוטומטי.<ol>
<li>במקום שמן טבילה על המטרה הרצויה ומניחים את השקופית הפוך לתוך מחזיק שקופיות על הבמה. השימוש בידית התמקדות להביא את התאים להתמקד.</li>
			<li>אופציונלי: לרכוש מרובים (x, y) עמדות. לבחור באקראי 10 שדות של תאים בסמיכות לכיס אוויר של הידיות agarose.</li>
			<li>הגדרת זמן רצף רכישת תמונת שלב או DIC במרווח הזמן הרצויים. הערה: את הרצף זמן לשגות המוצג באיור 4, DIC תמונות נרכשו עם 30 ms חשיפה בכל 10 דקות במשך 14 שעות. בעת שימוש פלורסצנטיות דימות במהלך זמן לשגות מיקרוסקופ, להתאים את רכישת מרווח וחשיפה הזמן כדי למזער את photobleaching ואת phototoxicity.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מכיל סדרה של הליכי החקירה של זנים wildtype מוטציה, דלדול tumefaciens א . ראוי לציין כי כל הנהלים המפורטים בסעיף פרוטוקול יכול להיות מותאם בקלות זני חיידקים אחרים עם שינויים נוספים חשבון צמיחה מדיה, טמפרטורות של שיעורי צמיחה.
השימוש של צבעי במטרה הוא כלי רב ערך עבור מת?...

התקדמות דרך מחזור התא חיידקית מחייבת התיאום של תהליכים רבים כולל ביוסינטזה ממברנה, דופן התא, שכפול ה-DNA, סגרגציה של חלוקת התא. כדי להבין באופן מלא את המורכבות של ביולוגיה של התא חיידקי, זה הכרחי לחקור אירועים אלה חיוניים; עם זאת, זוהי משימה לא טריוויאלי שכן הכדאיות תא בסכנה כאשר רכיבי מפתח של המסלולים הללו הם mutagenized. מיקרוסקופ Epifluorescence יחד עם צבעי במטרה היא גישה רב-עוצמה כדי לחקור תהליכים חיוניים אלה wildtype, זני חיידקים מוטנטים.
צבע ספציפי פפטידוגליקן לכלול אנטיביוטיקה פלורסנט (ואנקומיצין-FL, bocillin-FL) וחומצות אמינו פלורסנט-d (לדוגמה: 7-hydroxycoumarin-3-קרבוקסילית חומצה-3-אמינו-d-אלנין, HADA; d 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino--אלנין , נדא; tetramethylrhodamine-3-אמינו-d-אלנין; ג'אר). חיידקים גראם חיוביים, השימוש של ריכוזים לא קטלני של פלורסנט תחליפי אנטיביוטיקה כדי לחקור אתרים של פפטידוגליקן ביוסינטזה כבר אסטרטגיית יעיל כדי לחשוף פפטידוגליקן ההכנסה דפוסי1,2, 3,4. בעוד תיוג פלורסנט ואנקומיצין שימש כדי לקבל תובנות פפטידוגליקן ההכנסה דפוסים קבועים חיידקים גראם שליליים5, הממברנה החיצונית בדרך כלל מספק מחסום חדירות שמונעת שימוש פלורסנט אנטיביוטיקה כמו בדיקה של הביוסינתזה פפטידוגליקן בתאים חיים. לעומת זאת, בפולסים של חומצות אמינו פלורסנט-d או חומצות אמינו d עם קבוצות פונקציונליות biorthogonal תווית covalently מחוזות ההכנסה פפטידוגליקן האחרונות במגוון רחב של חיים תאים חיידקיים6,7. דפוסי פפטידוגליקן ההכנסה שנצפו עם חומצות אמינו d סינתטי כוללים punctate במחיצה הבין-פרוזדורית (Escherichia coli ו- Bacillus subtilis), קוטב ו במחיצה הבין-פרוזדורית (Agrobacterium tumefaciens , ליסטריה), במחיצה הבין-פרוזדורית היחידה (Staphylococcus aureus), הפסגה (Streptomyces venezuelae)6,7. מקרים אלה מצביעים על חיידקים מפגינים דפוסי מגוונות של דופן התא להן כי השימוש של חומצות אמינו d סינתטיים כמו הגששים לבחינת המתבנת הצמיחה היא אסטרטגיה יקר בחיידקים רבים.
צובעים את תווית כרומוזומים חיידקי כוללים חומצה deoxyribonucleic (DNA) ספציפיים groove קטין הקלסר (4, 6-diamidino-2-phenylindole; דאפי) צובעת cyanine זיקה גבוהה (ירוק וכתום; ראה רשימת חומרים). דאפי צביעת תאים קבוע מסייע ספירה של חיידקים מן הסביבה דגימות8, ואילו דאפי מכתים של תאים חיים משמש לציון הכדאיות חיידקי9. לעומת זאת, cyanine צבענים כמו כתום וירוק מתוארים לעתים קרובות כמו קרום התא "מת" impermeant כתמי לספור תאים כלכלית9. למרבה הפלא, כאשר נוגדנים אלה משמשים כדי לחקור את המורפולוגיה של נוקלאואיד חיידקי במהלך צמיחת תאים, דאפי, כתום וירוק כל הוצגו להיות קרום permeant, ובעל יכולת תיוג תאים חיים10. E. coli תאים חיים, דאפי צביעה של DNA מופיע ' מאטום לשקוף ' עקב אוטומטי-זריחה של הציטופלסמה, חשיפות חוזרות ונשנות של תאים שהוכתמו דאפי אור אולטרה סגול (UV) perturbs את מבנה נוקלאואיד10. E. coli מכתימים או B. subtilis עם תפוז מגלה כי זה צבע ממברנה permeant ומספק לאורך זמן זריחה על הכריכה ל- DNA בתאים חיים מבלי להשפיע על צמיחת תאים, שכפול ה-DNA או סגרגציה כרומוזום10 . מקרים אלה מצביעים על כך שניתן להשתמש cyanine DNA צבעי לפקח המורפולוגיה של nucleoids במהלך גידול תאים של חיידקים רבים.
Phospholipid-specific stryl צבענים כמו N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) phenyl) hexatrienyl) dibromide pyridinium (4-64; ראה רשימה) הם תרכובות cationic ולשייך מעדיפים אניון פוספוליפידים כגון cardiolipin ו- phosphatidylglycerol11. דפוסים ברורים הם נצפו כאשר 4-64 משמש להוספת תווית הקרום של חיידקים שונים. Escherichia coli, 4-64 מועשר בתמציות הפולנים, בלהקות לאורך החומה לרוחב, ולאחר12תאים האתרים חטיבת pre-divisional של המנוח. ב. Bacillus subtilis, 4-64 תיוג מאפשר את החזיית השומנים ספירלות13. Agrobacterium tumefaciens, 4-64 תוויות הממברנה החיצונית, הוא ציין תבנית אופיינית "פרסה" שבו הקוטב צמיחה נטול תיוג14,15. תצפיות אלה מציינים כי חיידקים אלו שהפגינו הפצות השומנים הטרוגנית בשל נוכחותם של השומנים תחומים אשר תורמים אסימטריה הסלולר. שינויים בדפוסי תיוג 4-64, כגון הנוכחות של תיוג ' מאטום לשקוף ', מגדלים פורחים או שלפוחית, invaginations או הצטמקות קרום יכול להיות אינפורמטיבי באפיון מוטציות להשפיע על ההפצה או ביוסינטזה של ליפידים.
מעבר צביעת תאים, הקובע את הפונקציה של חלבונים המשתתפים בתהליכים חיוניים הכרחי. האפיון של חלבונים חיוניים היא טכנית מאתגר כי זה בלתי אפשרי למחוק גנים חיוניים וללמוד את ההשלכות פנוטיפי. לפיכך, גישות אלטרנטיביות המדלדלים החלבון הופיעו. לדוגמה, ניתן לשים על גנים חיוניים תחת השליטה של יזם inducible ולא יזם מקורי שלה. היזמים inducible הם מגיבים מולקולות קטנות כגון; אבץ vanillate17,23, אראבינוז22, איזופרופיל β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21,16 xylose23, ובכך שעתוק של הגן היעד מפסיק, החלבון עניין תיגמר כאשר משרן מוסר. גישות חלופיות עבור depleting חלבונים חיוניים עניין כוללים riboswitches סינתטי24 אשר השתמש מולקולה קטנה-RNA אינטראקציות לעכב שעתוק של גנים היעד, CRISPR הפרעות25,26 כדי לחסום שעתוק של גנים היעד, חלבון inducible השפלה27,28 אשר משתמש בתגי פפטיד חלבונים היעד עבור השפלה על ידי פרוטאז ClpXP. דלדול זנים לספק זמן קצר בלבד עבור אפיון לפני התאים מאבד הכדאיות, לכן, הדמיה מיקרוסקופי של תאים לאורך זמן במהלך דלדול חלבון היא גישה רב-עוצמה עבור אפיון. אכן, מיקרוסקופיה של תאים חיידקיים חי איפשר לחוקרים לקבל תובנות לגבי התהליכים הביולוגיים הבסיסיים, כולל את המנגנונים של תחזוקה צורת התא, הפרשת מידור29.
Tumefaciens א הוא פתוגן חיידקי הצמח30 ,31,טבעי המהנדס הגנטי32. לפיכך, מנגנונים הקשורים פתוגניות, לרבות פתוגן-פונדקאי אינטראקציות33,34,35, הפרשת36מארח טרנספורמציה30,31, 37 נחקרו בהרחבה. לתכנן אסטרטגיות במניעת מחלות tumefaciens א מתווכת או לשפר את הצמח טרנספורמציה, תהליכים חיוניים להישרדות tumefaciens א צריך להיות מובן יותר. השימוש של צבעי במטרה ופיתוח אסטרטגיה דלדול חלבון tumefaciens א18 האחרונות מספק אמצעים כדי לחקור תהליכים חיוניים.
. הנה, פרוטוקולים מפורט לבדיקה מיקרוסקופית wildtype מוטציה, חלבון דלדול זנים של tumefaciens א הינם מסופקים. הפרוטוקולים שני הראשונים מתארים כיצד להכין תאים, התווית אותם עם צבע במטרה. הפרוטוקול השלישי מספק הנחיות צעד אחר צעד עבור הכנת agarose רפידות (איור 1) והדמיה של תאים חיידקיים (איור 2, איור 3, איור 4). פרוטוקולים אלה יכול להיות גם מתאים חיידקים אחרים עם עיבודים נוספים לקחת בחשבון תנאים מדיה שונים, שיעורי צמיחה, דרישות החמצן של מבנה התא.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt; C58</td><td>ATCC</td><td>33970</td><td>Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of &lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt;. J Bacteriol 123:255-264.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt; C58&amp;Delta;tetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-&lt;em&gt;ctrA &amp;Delta;ctrA&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen &lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt;. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Media Components&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATGN Minimal Medium</td><td></td><td></td><td>To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 &amp;deg;C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose.</td></tr><tr><td>20X AT Buffer</td><td></td><td></td><td>Add 214 g/L KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP359</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Chemical</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>20X AT Salts</td><td></td><td></td><td>Add 40 g/L (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 3.2 g/L MgSO4&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.2 g/L CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, and 0.024 g/L MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to water. Autoclave.</td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Chemical</td><td>A701</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP213</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Chemical</td><td>M114</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16</td><td>Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1423</td><td>Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Optional Media Additives&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>GoldBio</td><td>K-120</td><td>Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 &amp;micro;g/ml.</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>GoldBio</td><td>I2481C5</td><td>Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopy Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550D</td><td>25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.</td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisherbrand</td><td>12-541-B</td><td>22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.</td></tr><tr><td>Sparkle Glass Cleaner</td><td>Home Depot</td><td>203261385</td><td>Ammonia and alcohol free.</td></tr><tr><td>Ultra Pure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-100</td><td>Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP399500</td><td>10X solution to be diluted to 1X with sterile water.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-999</td><td>Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.</td></tr><tr><td>VALAP</td><td></td><td></td><td>Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 &amp;deg;C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.</td></tr><tr><td>Lanolin Butter</td><td>SAAQIN</td><td>SQ-LAB-R1</td><td></td></tr><tr><td>Petroleum Jelly</td><td>Target Corp.</td><td>06-17644</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin Wax</td><td>Crafty Candles</td><td>263012</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Target-specific dyes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>Use to dilute stock solutions of dyes as needed.</td></tr><tr><td>FDAAs (NADA, HADA,TADA)</td><td></td><td></td><td>FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62247</td><td>Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 &amp;micro;g/ml.</td></tr><tr><td>SYTOX Orange Nucleic Acid Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S11368</td><td>Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 &amp;micro;M.</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T3166</td><td>Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 &amp;micro;g/ml.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry bath</td><td>Sheldon Manufacturing, Inc.</td><td>52120-200</td><td></td></tr><tr><td>Metallic thermal beads</td><td>Lab Armor</td><td>42370-002</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera</td><td></td><td></td><td>Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.</td></tr></tbody></table>

live cell fluorescence microscopy to observe essential processes during microbial cell growth

תהליכים תאיים ליבה כגון שכפול ה-DNA וסגרגציה, סינתזה של חלבון, ביוסינטזה דופן התא, חלוקת התא להסתמך על תפקידו של חלבונים, המהווה מרכיב חיוני להישרדות החיידק. ניתן להשתמש סדרת צבעי במטרה כפי הגששים טוב יותר להבין תהליכים אלה. צביעת עם צבעי lipophilic מאפשר התבוננות מבנה הממברנה, ויזואליזציה של השומנים microdomains, גילוי של קרום מגדלים פורחים. השימוש של חומצות אמינו פלורסנט-d (FDAAs) כדי לחקור את האתרים של פפטידוגליקן ביוסינטזה ניתן לציין פגמים פוטנציאליים להן קיר התא או המתבנת צמיחת תאים. לבסוף, חומצת גרעין כתמי ניתן לציין ליקויים אפשריים-סגרגציה שכפול או כרומוזום ה-DNA. Cyanine DNA כתמי תווית לחיות תאים ומתאימים ל זמן לשגות מיקרוסקופ שמאפשר מתצפיות נוקלאואיד מורפולוגיה של במהלך גדילת התאים. ניתן להחיל פרוטוקולים עבור תיוג התא חלבון המוטנטים דלדול לזהות פגמים מבנה הממברנה, דופן התא להן או כרומוזום סגרגציה. יתר על כן, זמן לשגות מיקרוסקופ ניתן לעקוב אחר שינויים מורפולוגיים כמו חלבון חיוני יוסר ולא יכולה לספק תובנות פונקציה של חלבונים נוספים. לדוגמה, דלדול של חלבונים חיוניים חלוקת התא תוצאות filamentation או הסתעפות, ואילו דלדול של התא צמיחה חלבונים עלול לגרום לתאים להפוך קצר יותר או עגולות. כאן, פרוטוקולים צמיחת תאים, במטרה תיוג של מיקרוסקופיית זמן לשגות ניתנים עבור המחלה חיידקי צמח Agrobacterium tumefaciens. יחד, במטרה צבעי ומיקרוסקופיה זמן לשגות מאפשרים אפיון תהליכים חיוניים ב א tumefaciens. לבסוף, הפרוטוקולים הניתנים ניתן לשנות בקלות כדי לחקור חיוני בתהליכי חיידקים אחרים.

במטרה תיוג של wildtype א tumefaciens תאים כדי להמחיש את המורפולוגיה תא לא מושפע על ידי שטיפת מדרגות או טיפול עם 1% דימתיל סולפוקסיד (אשר נמצא בשימוש כדי לדלל את צבעי פלורסנט), התאים היו עם תמונה ישירות מתרבות (איור 2 א, לוח השמאלי), לא?...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth at JoVE.com

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

הבנת תפקידה של תהליכים חיוניים של חיידקים הוא מאתגר. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ עם צבעי במטרה יכול לספק תובנות מפתח לתוך התא מיקרוביאלי התקדמות וצמיחה של מחזור התא. כאן, Agrobacterium tumefaciens משמש חיידק דגם כדי לסמן שיטות הדמיה תא חי פלואורסנציה לאפיון תהליכים חיוניים.

חיים התא מיקרוסקופ פלורסצנטיות לבחון תהליכים חיוניים במהלך צמיחת תאים מיקרוביאלי

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

live-cell-fluorescence-microscopy-to-observe-essential-processes

Research

JoVE Journal

Biology

15.7K Views.  University of Missouri. הבנת תפקידה של תהליכים חיוניים של חיידקים הוא מאתגר. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ עם צבעי במטרה יכול לספק תובנות מפתח לתוך התא מיקרוביאלי התקדמות וצמיחה של מחזור התא. כאן, Agrobacterium tumefaciens משמש חיידק דגם כדי לסמן שיטות הדמיה תא חי פלואורסנציה לאפיון תהליכים ח...

Video: Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Immunology and Infection

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

לטווח ארוך לחיות תאים הדמיה כדי להעריך את גורל בתגובה פקליטקסל

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Cancer Research

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes underlying central cell cycle events. However, imaging of these molecules in slow-growing bacteria represents a challenge due to photobleaching of fluorophores and phototoxicity during image acquisition. Here, we describe a simple protocol to circumvent these limitations in the case of Myxococcus xanthus (which has a generation time of 4 - 6 h). To this end, M. xanthus cells are grown on a thick nutrient-containing agar pad in a temperature-controlled humid environment. Under these conditions, we determine the doubling time of individual cells by following the growth of single cells. Moreover, key cellular processes such as chromosome segregation and cell division can be imaged by fluorescence live-cell imaging of cells containing relevant fluorescently labeled marker proteins such as ParB-YFP, FtsZ-GFP, and mCherry-PomX over multiple cell cycles. Subsequently, the acquired images are processed to generate montages and/or movies.

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Bacterial cells are spatially highly organized. To follow this organization over time in slow growing Myxococcus xanthus cells, a set-up for fluorescence live-cell imaging with high spatiotemporal resolution over several generations was developed. Using this method, spatiotemporal dynamics of important proteins for chromosome segregation and cell division could be determined.

קרינה פלואורסצנטית Live-תא הדמיה של שלמה וגטטיבי תא מחזור של חיידק חברתית גידול איטי Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

Biochemistry

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

שימוש בחלבוני ניאון כדי לחזות ולכמת<em&gt; כלמידיה</em&gt; חלולית דינמיקת צמיחה בתאים חיים

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence microscopy as observations made at a population level may not truly reflect what occurs at a single cell level. Live-cell timelapse microscopy allows investigators to monitor the changes in cell division or cell morphology which provide valuable insights regarding subcellular localization of proteins and timing of gene expression, as it happens, to potentially aid in answering important biological questions. Here, we describe our protocol to monitor phenotypic changes in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus using a high-resolution deconvolution microscope. The objective of this report is to provide a simple and clear protocol that can be adopted by other investigators interested in conducting fluorescence microscopy experiments to study different biological processes in bacteria as well as other organisms.

This article provides a step-by-step guide to investigate protein subcellular localization dynamics and to monitor morphological changes using high-resolution fluorescence microscopy in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית החיה כדי לחקור את הלוקליזציה של חלבון Subcellular ושינויי מורפולוגיה של תאים בחיידקים

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

הדמיה קינטית של אינטראקציות חיידקים בין-מינים חד-תאיים

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

לחיות תא הדמיה של אירועי autophagy מוקדמים: Omegasomes ומעבר

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation. 
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi&#230;, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.

Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

הפנמה והתבוננות של פלורסנט מולקולות ביולוגיים במיקרואורגניזמים שחיים דרך Electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

חיים התא מיקרוסקופ פלורסצנטיות לבחון תהליכים חיוניים במהלך צמיחת תאים מיקרוביאלי

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST