מחקר זה נתמך על ידי קרן מדעי רפואי של ראש העיר של העיר וינה, את und Laboratoriumsmedizin לדנציג Österreichische בווריה Chemie פסיכולוג קליני.

כל השיטות המתוארות כאן מאושר על ידי חיה אכפת ועל שימוש הוועדה של אוניברסיטת וינה רפואי, שנערכו לפי הפדרציה של אירופה מעבדה חיה המדע שיוכי (FELASA). אנא שימו לב כי כל ההליכים המתוארים פרוטוקול זה רק לבצע לאחר אישור מוסדי וממשלתיים, כמו גם על ידי צוות כי הם בקיאים טכנית.
1. HFD-fed עכברים
הערה: לשמור על כל C57BL/6J עכברים על מחזור/כהה 12 שעות ביממה עם גישה חופשית מזון ומים.
<ol><li>בגיל 6 שבועות, במקום עכברים במשך 8-12 שבועות על HFD (40-60% שומן קלוריות) כדי לגרום להשמנה, בזמן האכלה קבוצת הביקורת רזה דיאטה דלת שומן (LFD) (10% שומן קלוריות).</li>
	<li>לקבוע את משקל הגוף של העכברים על בסיס שבועי. עקומות משקל צריך להראות דפוסים דומים בשתי הקבוצות, עם מדרון גבוהה יותר בקבוצה הניזונה HFD.</li>
</ol>2. OGTT
הערה: אם נקודות זמן דגימה דם נבחרו במהלך OGTT כל 15 דקות, הניסוי צריכה להתבצע עם מקסימום של 15 עכברים במקביל, על מנת לקבל לפחות 1 דקות טיפול-זמן לכל העכבר.
<ol><li>ההכנות ביום שלפני OGTT<ol>
<li>להעביר את העכברים לתוך כלוב עם מצעים טרי ומהר אותם לילה לפני בדיקות (14 h), תוך הבטחת כי העכברים יש גישה למי שתייה (למשללהסיר את האוכל בשעה 6 בערב במשך זמן התחלה למחרת בבוקר בשעה 8 בבוקר). הערה: צום עכברים הוא הגישה רגיל, בין לילה אולם מהיר יותר קצר (5-6 h) הוא יותר פיזיולוגית עבור עכברים (לפרטים, ראה דיון ).</li>
	</ol></li>
	<li>ההכנות ביום של הניסוי (אך לפני הניסוי)<ol>
<li>הכינו 10 מ"ל של תמיסת גלוקוז 20% (להמיס D-(+)-גלוקוז במים מזוקקים). הערה: כל ריאגנטים המנוהלים החיות חייב להיות תרופתי כיתה וסטרילי.</li>
		<li>להכין צלחת 96-ובכן האוסף פלזמה, על ידי מילוי טוב אחד על כל נקודת זמן הדגימה ועכבר כל, עם 5 µL NaEDTA (0.5 M EDTA, pH 8.0 ב- 0.9% NaCl, אחסון ב- RT). במהלך הניסוי, לאחסן את הצלחת הזו על קרח. הערה: ראה איור 1 משלים עבור רשימה מפורטת.</li>
	</ol></li>
	<li>למדוד את משקל הגוף של עכברים כל ולסמן הזנבות שלהם עם סמן קבוע על מנת להפוך עכברים בקלות ניתן להבחנה (למשל, העכבר 1 = 1 מקף, מקפים העכבר 2 = 2, וכו ').</li>
	<li>גלוקוז מדידה ודגימה הדם (איור 2)<ol>
<li>בזהירות לחתוך 1-2 מ מ של קצה הזנב באמצעות מספריים חדות ("חלופה א' באיור2). תמיד לנגב את טיפת הדם כדי למנוע המוליזה או זיהום בנוזל רקמות לפני לקיחת דגימות דם חדש עבור קביעת גלוקוז הדם הראשונה. להוציא דגימת דם קטנים (µL ~ 3) לשקילת הבזליים רמת הסוכר בדם (= נקודת זמן 0) עם סוכר. התראה: לבדוק ולהתאים מספר תשלום לבדוק רצועות על סוכר. הערה: כמו שיטת דגימה דם אלטרנטיביים, ניק את וריד הזנב לרוחב של עכבר עם להב סכין חדה (Variant B" באיור2). תקחי את הזנב לרוחב מתבצעת בדרך כלל כשליש לאורכו של הזנב מקצה הזנב, נע לכיוון הבסיס של הזנב לדוגמאות מרובים. השימוש בקרם הרדמה מקומית מומלצת. לעצור את זרימת הדם על ידי הפעלת לחץ אצבע על הרקמות הרכות לפחות 30 s לפני החיה מוחזר לכלוב שלו.</li>
		<li>לאסוף דגימת דם (כ-30 µL) באמצעות צינור קפילרי טריים (שמור את הציר האופקי צינור קפילרי). רוקן את צינור קפילרי באמצעות פיפטה על ידי לשים את הטיפ פיפטה בחלק העליון של צינור קפילרי הסוף על בקפידה דוחפים את הדם שנאספו לבאר של צלחת 96-ובכן, תוך הימנעות בועות אוויר. חזור על הליך זה עבור כל העכברים - אחד בכל פעם. הערה: חלופה עבור איסוף דם דרך צינור קפילרי, להשתמש פיפטה התרגלו האחסון הנכון (למשל, 30 µL) לאיסוף דם, או לאסוף את טיפת דם לכיוון הזנב על הסרט פרפין, ו pipet זה לתוך הפתרון-EDTA. אך ורק למנוע המגע של וזלין עם רצועות בדיקת דם או סוכר, כמו זה עשוי להשפיע עוקבות מדדים גלוקוז, אינסולין. התראה: OGTT זה מלחיץ מאוד עבור עכברים: עכברים רזה יכול לאבד כ 15% ממשקל גופם במהלך מהיר לילה. בנוסף, לקיחת דמים בנקודות זמן שונות מוביל לאובדן משמעותי של דם. עבור דגימה דם קל יותר, זה אפשרי לעסות היטב את mouse-tail עם וזלין. הערה: המוסדיים הנחיות עשוי להגביל את כמות הדם שנאספו בתוך תקופת מוגדרת המותר. הדגימה ואמצעי timepoints צריך להיות מותאם לא תעלה על ערכים מרביים מותרים. משקל הגוף של העכברים יש להשתמש כדי לחשב את הסכום הכולל דם נסיגה מותרת.</li>
	</ol></li>
	<li>חישוב נפח תמיסת גלוקוז מבוסס על משקל הגוף (1 גרם גלוקוז/ק"ג משקל גוף; הזה יכול להיות מוגברת עד 3 g/kg) נדרש להיות מנוהל על ידי אוראלי gavage עבור כל עכבר. לדוגמה, עם משקל הגוף של 30 g העכבר צריך 150 µL של גלוקוז 20% פתרון לניהול 30 מ"ג של גלוקוז. הערה: כדי לבסס את המינון של גלוקוז על המשקל של העכבר זה הליך רגיל. אם גוף הרכב נתונים זמינים, המינון של גלוקוז עבור OGTT יש לחשב על בסיס לין מסת הגוף (לפרטים, ראה דיון ).</li>
	<li>ניהול גלוקוז<ol>
<li>להכין כל מה נדרש במהלך הניסוי כולו מראש (טיימר, גיליון הרשומה ניסוי, מזרקים צג, רצועות, נימים, גלוקוז, תמיסת גלוקוז, צלחת 96-ובכן, אזמל, מחשבון, איזון, בטוש, ספסל ניירות, פיפטה עם טיפ, כפפות).</li>
		<li>ליישום גלוקוז, לרסן את העכבר על-ידי בחוזקה אוחז אותו יתלה. חלות מספיק מוצקות העור סביב הצוואר כדי למנוע פיתול מגבילות העכבר וכדי כראוי הטה את ראשו לאחור. גם להבטיח כי העכבר יכול לנשום כמו שצריך. הערה: לאחר ניהול גלוקוז מופעל, ניהול זמן טוב חשוב מאוד.</li>
		<li>בזהירות לנהל את תמיסת גלוקוז (מבוסס על שלב 2.5) ישירות לתוך הקיבה באמצעות מחט האכלה. בזהירות לכוון את המחט האכלה דרך הפה לכיוון הוושט. לאפשר את העכבר כדי לבלוע את המחט: המחט לחלוטין שוקעת לתוך הוושט התחתון/הקיבה של העכבר. להזריק את תמיסת גלוקוז (איור 3 א).<ol>
<li>אם התנגדות כלשהי, או אם החיה נאבק באופן מיידי, לשלוף את המחט ולמקם אותו מחדש. להתחיל את הטיימר מיד לאחר gavage הראשונה ולפקח גלוקוז כל לעכברים אחרים במרווחים 1 דקות. הערה: זה עשוי להיות שימושי להחיל טיפת תמיסת גלוקוז ישירות מן המחט האכלה על הפה של העכבר, אשר יגרה מלקקת, בבליעה, ובכך להקל על החדרת המחט האכלה קל יותר. אל תחיל לחץ בעת החדרת המחט האכלה כמו זה עלול לפצוע את החיה.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר 15 דקות, למדוד את רמות הגלוקוז בדם עם סוכר, בנוסף לקחת דגימות דם (µL ~ 30) (כפי שמתואר פרט בשלב 2.4) של העכבר בכל באותו סדר כפי שהם היו מזריקים. הערה: ניהול זמן הוא מאוד חשוב; בצע כמו צמוד ככל האפשר באמצעות ממרווחי הזמן אותו באשר gavage. תן העכברים לנוע באופן חופשי ככל האפשר, מגבלת הרחקה למינימום במהלך כל התהליך כדי להפחית את הלחץ, אשר עשויים לשנות את התוצאות. חלב הזנב עם יד אחת ולאסוף את הדם עם האחר.</li>
	<li>חזור על שלב 2.7 בנקודות זמן נבחר בהתאם התוצאות הצפויות (למשל, ב 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 דקות לאחר ניהול גלוקוז). אם נקודות זמן נבחר הן יותר מ 120 דקות, ודא כי העכברים יש גישה למי שתייה. ודא כי העכברים יש תמיד גישה למי שתייה. לאחר סיום הניסוי, להחזיר את העכברים לכלובים הביתה מצוידים עם מים ואוכל. התראה: OGTT זה מתיש מאוד עבור העכברים לכן לחכות לפחות שבוע אחד לפני ביצוע המבדק מטבולית הבאה, כגון ITT</li>
	<li>לאחר הניסוי, צנטריפוגה דגימות דם-2,500 x g, 30 דקות, 4 מעלות צלזיוס. להעביר את תגובת שיקוע (פלזמה) לרוקן בארות של הצלחת ולאחסן אותו ב-20 ° C עד הניתוח.<ol>
<li>להקליט המוליזה של דגימות אם קיים (ראה סעיף 3).</li>
	</ol></li>
	<li>לקבוע רמות אינסולין פלזמה באמצעות אליסה זמינים מסחרית של קיט (ראה את הטבלה של חומרים) בעקבות הוראות היצרן של הערכה. הערה: בהתאם למצב צום וגם על חילוף החומרים של העכברים ובדוקים, קשיים במהלך assay זו עלולה להתרחש: רמות של אינסולין בצום לילה (נקודת זמן 0) קרובים מאוד נמוך, ולכן מגבלת זיהוי. כדי להימנע מבעיה זו, להכפיל את הכמות של נפח פלזמה מומלצת, בהתאם צונחים בחצי התוצאה של אליסה וזמינותו. מצד שני, אם עכברים להגיע לפסגה אינסולין במהלך OGTT, בעיקר בעכברים HFD-fed, רמות האינסולין עלול חורגת מהמגבלה של זיהוי: לדלל את הדגימה (למשל, 10-fold עם 0.9% NaCl) וחזור וזמינותו אליסה. המוליזה בדגימות הפלסמה עלול להוביל ההשפלה של אינסולין, וכתוצאה מכך ירידה של ערכי הבדיקה. ההשפלה תלוי זמן, טמפרטורה, ריכוז המוגלובין במדגם. תמיד לשמור דגימות hemolyzed קר או על קרח כדי להפחית אינסולין השפלה.</li>
</ol>3. ITT
הערה: אמצעי הזהירות אותם תיאר עבור OGTT (טיפול של עכברים, דם, סוכר ושימוש וזלין) יש גם להחיל בעת ביצוע של ITT. לדוגמה, זריקות כל צריכה להתבצע בתוך 15 דקות במרווחים 1 דקות אם עכברים 15 נבדקים במקביל. עבור ITT, אוסף עוקבות של דגימות דם עם צינורות קפילר הוא אופציונלי.
<ol><li>ההכנות לפני הניסוי<ol>
<li>מהר עכברים כבר לפחות שעתיים לפני הזרקת אינסולין, תוך הבטחת כי העכברים יש גישה למי שתייה (למשללהסיר מזון ב־8: 00, מבחן עכברים 2-5 שעות מאוחר יותר).</li>
		<li>לדלל אינסולין 1:1,000 ב- 0.9% NaCl (מניות: אינסולין U/mL 100; ריכוז בעבודה 0.1 U/mL) ולהכין 20% גלוקוז (D-(+)-תמיסת גלוקוז מומס מים מזוקקים) ינוהלו אם והעכברים הופכים מתת. הערה: ITT מבוצעת בדרך כלל לאחר מהיר קצר כדי למנוע היפוגליקמיה אשר ייתכן אחרת מתרחשים בין לילה התענה חיות. ריאגנטים כל המנוהלים החיות חייב להיות תרופתי כיתה וסטרילי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מודדים את משקל גוף של עכברים, לסמן את הזנב, חותכים קצה הזנב באמצעות מספריים חדות, למדוד את רמות הגלוקוז בדם הבזליים כמתואר קודם לכן OGTT בשלב 2.4.</li>
	<li>הזרקת אינסולין<ol>
<li>כדי להזריק אינסולין intraperitoneally (0.75 U אינסולין/ק"ג משקל גוף, מחושב מראש), לרסן את העכבר בשיטת עורפה.</li>
		<li>השתמש רעננה, סטרילי 27 או 30 מד מחט עבור כל חיה למנוע אי נוחות, את הסיכון של זיהום כלשהו-ההזרקה. הערה: עיקור של העור יכולים להאריך את משך הזמן של אינסולין המינהל, ובכך עלול לגרום הפרעות נוספות לחיה. לכן, לא מומלץ.</li>
		<li>להטות את הראש העכבר מטה בזווית קלה כדי לחשוף את הצד הבטני של החיה. הצב מחט סטרילית עם שפוע, בזווית של 30 מעלות הרביע הימני. התחתון של הבטן של החיה (איור 3b). התחל את הטיימר מיד לאחר מוזרק העכבר הראשון. הערה: במינון נמוך ITTs (0.1 U/kg) ניתן לבצע כדי להעריך באופן ספציפי את הרגישות לאינסולין בכבד. באשר OGTT, חישוב הנפח הזרקת מבוסס על משקל הגוף הוא הליך רגיל, בעוד מבסס את המינון על גוף רזה מסה היא עדיפה אם נתוני הרכב גוף הינם זמינים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>למדוד את רמות הגלוקוז בדם בנקודות זמן נבחר (למשל, לאחר 15, 30, 45, 60, 90 דקות). הערה: כמו אינסולין יש חצי-זמן קצר של ~ 10 דקות עכברים13, ההבדלים מאוחר לאחר ניהול אינסולין (למשל, לאחר 2 h) אינן משקפות בהכרח השפעה ישירה של פעילות האינסולין. להזריק תמיסת גלוקוז 20% למקרה עכבר הופך hypoglycemic (את רמות הגלוקוז בדם מתחת 35 מ"ג/ד"ל) נמצא בסיכון למות.</li>
	<li>אחרי הפעם האחרונה נקודות, מקום העכברים בחזרה לתוך הכלובים הביתה מוכן עם שפע של מזון ומים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Qatanani, M., Lazar, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+obesity-associated+insulin+resistance:+many+choices+on+the+menu.">Mechanisms of obesity-associated insulin resistance: many choices on the menu.</a> Genes Dev. 21 (12), 1443-1455 (2007).</li><li>Wilcox, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+and+insulin+resistance.">Insulin and insulin resistance.</a> Clin Biochem Rev. 26 (2), 19-39 (2005).</li><li>Reaven, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+insulin+resistance+in+human+disease.">Pathophysiology of insulin resistance in human disease.</a> Physiol Rev. 75 (3), 473-486 (1995).</li><li>Kahn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+diabetes:+when+insulin+secretion+fails+to+compensate+for+insulin+resistance.">Type 2 diabetes: when insulin secretion fails to compensate for insulin resistance.</a> Cell. 92 (5), 593-596 (1998).</li><li>Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+in+obesity.">Inflammatory mechanisms in obesity.</a> Annu Rev Immunol. 29, 415-445 (2011).</li><li>Odegaard, J. I., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+actions+of+insulin+resistance+and+inflammation+in+metabolic+homeostasis.">Pleiotropic actions of insulin resistance and inflammation in metabolic homeostasis.</a> Science. 339 (6116), 172-177 (2013).</li><li>Srinivasan, K., Ramarao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+type+2+diabetes+research:+an+overview.">Animal models in type 2 diabetes research: an overview.</a> Indian J Med Res. 125 (3), 451-472 (2007).</li><li>Surwit, R. S., Kuhn, C. M., Cochrane, C., McCubbin, J. A., Feinglos, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+type+II+diabetes+in+C57BL/6J+mice.">Diet-induced type II diabetes in C57BL/6J mice.</a> Diabetes. 37 (9), 1163-1167 (1988).</li><li>Winzell, M. S., Ahren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+high-fat+diet-fed+mouse:+a+model+for+studying+mechanisms+and+treatment+of+impaired+glucose+tolerance+and+type+2+diabetes.">The high-fat diet-fed mouse: a model for studying mechanisms and treatment of impaired glucose tolerance and type 2 diabetes.</a> Diabetes. 53, S215-S219 (2004).</li><li>Ayala, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+operating+procedures+for+describing+and+performing+metabolic+tests+of+glucose+homeostasis+in+mice.">Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice.</a> Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).</li><li>Jais, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heme+oxygenase-1+drives+metaflammation+and+insulin+resistance+in+mouse+and+man.">Heme oxygenase-1 drives metaflammation and insulin resistance in mouse and man.</a> Cell. 158 (1), 25-40 (2014).</li><li>Teperino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+partial+agonism+drives+Warburg-like+metabolism+in+muscle+and+brown+fat.">Hedgehog partial agonism drives Warburg-like metabolism in muscle and brown fat.</a> Cell. 151 (2), 414-426 (2012).</li><li>Cresto, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half+life+of+injected+125I-insulin+in+control+and+ob/ob+mice.">Half life of injected 125I-insulin in control and ob/ob mice.</a> Acta Physiol Lat Am. 27 (1), 7-15 (1977).</li><li>First report of the BVA/FRAME/RSPCA/UFAW joint working group on refinement. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+blood+from+laboratory+mammals+and+birds.">Removal of blood from laboratory mammals and birds.</a> Lab Anim. 27 (1), 1-22 (1993).</li><li>McGuill, M., Rowan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Effects+of+Blood+Loss:+Implications+for+Sampling+Volumes+and+Techniques.">Biological Effects of Blood Loss: Implications for Sampling Volumes and Techniques.</a> ILAR. 31 (4), 5-18 (1989).</li><li>Hoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Blood+Collection+in+the+Mouse.">Methods of Blood Collection in the Mouse.</a> Lab Animal. 29 (10), 47-53 (2000).</li><li>Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterregulatory+deficits+occur+within+24+h+of+a+single+hypoglycemic+episode+in+conscious,+unrestrained,+chronically+cannulated+mice.">Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 290 (4), E678-E684 (2006).</li><li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035.">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes Res Clin Pract. 103 (2), 137-149 (2014).</li><li>Freeman, H. C., Hugill, A., Dear, N. T., Ashcroft, F. M., Cox, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+nicotinamide+nucleotide+transhydrogenase:+a+new+quantitive+trait+locus+accounting+for+glucose+intolerance+in+C57BL/6J+mice.">Deletion of nicotinamide nucleotide transhydrogenase: a new quantitive trait locus accounting for glucose intolerance in C57BL/6J mice.</a> Diabetes. 55 (7), 2153-2156 (2006).</li><li>Pelleymounter, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+obese+gene+product+on+body+weight+regulation+in+ob/ob+mice.">Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice.</a> Science. 269 (5223), 540-543 (1995).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+diabetes+gene+encodes+the+leptin+receptor:+identification+of+a+mutation+in+the+leptin+receptor+gene+in+db/db+mice.">Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice.</a> Cell. 84 (3), 491-495 (1996).</li><li>Rossini, A. A., Like, A. A., Dulin, W. E., Cahill, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+beta+cell+toxicity+by+streptozotocin+anomers.">Pancreatic beta cell toxicity by streptozotocin anomers.</a> Diabetes. 26 (12), 1120-1124 (1977).</li><li>Bailey, C. J., Flatt, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+control+of+glucose+homeostasis+during+development+and+ageing+in+mice.">Hormonal control of glucose homeostasis during development and ageing in mice.</a> Metabolism. 31 (3), 238-246 (1982).</li><li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexually+different+actions+of+leptin+in+proopiomelanocortin+neurons+to+regulate+glucose+homeostasis.">Sexually different actions of leptin in proopiomelanocortin neurons to regulate glucose homeostasis.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (3), E630-E639 (2008).</li><li>Collins, S., Martin, T. L., Surwit, R. S., Robidoux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+vulnerability+to+diet-induced+obesity+in+the+C57BL/6J+mouse:+physiological+and+molecular+characteristics.">Genetic vulnerability to diet-induced obesity in the C57BL/6J mouse: physiological and molecular characteristics.</a> Physiol Behav. 81 (2), 243-248 (2004).</li><li>Heijboer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sixteen+hours+of+fasting+differentially+affects+hepatic+and+muscle+insulin+sensitivity+in+mice.">Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice.</a> J Lipid Res. 46 (3), 582-588 (2005).</li><li>Kohsaka, A., Bass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sense+of+time:+how+molecular+clocks+organize+metabolism.">A sense of time: how molecular clocks organize metabolism.</a> Trends Endocrinol Metab. 18 (1), 4-11 (2007).</li><li>Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incretin+action+in+the+pancreas:+potential+promise,+possible+perils,+and+pathological+pitfalls.">Incretin action in the pancreas: potential promise, possible perils, and pathological pitfalls.</a> Diabetes. 62 (10), 3316-3323 (2013).</li><li>Andrikopoulos, S., Blair, A. R., Deluca, N., Fam, B. C., Proietto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+glucose+tolerance+test+in+mice.">Evaluating the glucose tolerance test in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 295 (6), E1323-E1332 (2008).</li><li>Ahren, B., Winzell, M. S., Pacini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+augmenting+effect+on+insulin+secretion+by+oral+versus+intravenous+glucose+is+exaggerated+by+high-fat+diet+in+mice.">The augmenting effect on insulin secretion by oral versus intravenous glucose is exaggerated by high-fat diet in mice.</a> J Endocrinol. 197 (1), 181-187 (2008).</li><li>Bowe, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+phenotyping+guidelines:+assessing+glucose+homeostasis+in+rodent+models.">Metabolic phenotyping guidelines: assessing glucose homeostasis in rodent models.</a> J Endocrinol. 222 (3), G13-G25 (2014).</li><li>Arioli, V., Rossi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+related+to+different+techniques+of+intraperitoneal+injection+in+mice.">Errors related to different techniques of intraperitoneal injection in mice.</a> Appl Microbiol. 19 (4), 704-705 (1970).</li><li>Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+mice.">Intraperitoneal injection of mice.</a> Appl Microbiol. 17 (2), 250-251 (1969).</li><li>Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+glucose+homeostasis.">Evaluation of glucose homeostasis.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter. , 23 (2007).</li><li>Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+approaches+for+assessing+insulin+sensitivity+and+resistance+in+vivo:+advantages,+limitations,+and+appropriate+usage.">Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (1), E15-E26 (2008).</li><li>McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+experiment+in+centralized+mouse+phenotyping:+the+Vanderbilt+experience+and+recommendations+for+evaluating+glucose+homeostasis+in+the+mouse.">NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 297 (4), E849-E855 (2009).</li><li>Pacini, G., Omar, B., Ahren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+models+for+metabolic+assessment+in+mice.">Methods and models for metabolic assessment in mice.</a> J Diabetes Res. 2013, 986906 (2013).</li><li>Polonsky, K. S., Rubenstein, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-peptide+as+a+measure+of+the+secretion+and+hepatic+extraction+of+insulin.+Pitfalls+and+limitations.">C-peptide as a measure of the secretion and hepatic extraction of insulin. Pitfalls and limitations.</a> Diabetes. 33 (5), 486-494 (1984).</li><li>Hughey, C. C., Wasserman, D. H., Lee-Young, R. S., Lantier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+assessing+determinants+of+glucose+homeostasis+in+the+conscious+mouse.">Approach to assessing determinants of glucose homeostasis in the conscious mouse.</a> Mamm Genome. 25 (9-10), 522-538 (2014).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

עם שכיחות גבוהה של סוכרת ומחלות המשויך באוכלוסיית העולם, יש דרישה חזקה למחקר פונה את המנגנון המולקולרי, מניעה וטיפול של מחלות19. פרוטוקול הציג מתאר שיטות ומבוססת על הדור של עכברים HFD, מודל בעלי חיים חזקים בשימוש עבור מחקר מטבולית, כמו גם את הולכה של OGTT, ITT, אשר הם כלי חזק ההערכה של...

בעולם המפותח, השמנת יתר, סוכרת הגיעו ממדי מגפה עקב חוסר פעילות גופנית, צריכת עודף של מזון מעובד, תופעות אשר מונעים על ידי עיור מהיר, תיעוש, כמו גם הגלובליזציה. למרות מחקר על עמידות לאינסולין ועל זה morbidities משותף, כגון היפרליפידמיה, טרשת עורקים, צברה לגדולה במהלך העשורים האחרונים, המנגנונים הביולוגיים מורכבים אשר לווסת את חילוף החומרים על בריאות ומחלה נשארים שהיישום מובן עדיין קיים צורך דחוף הקדמה חדשה למנוע ולטפל במחלות אלה1.
אינסולין, גלוקגון הורמון counter-regulatory זה לשמש הרגולטורים העיקריים של האנרגיה התאית אספקת חומר מזין ואיזון, וכך גם שמירה על ריכוזי גלוקוז נאותה דם מערכתית2. גלוקוז עצמה פועלת כאחת תכשירים הראשי הפרשת האינסולין על ידי תאי β בלבלב, בעוד אחרים macronutrients, גורמים ההורמונאלית וכן לקלט העצבי עוד יותר לשנות תגובה זו. אינסולין וכתוצאה מכך מפעיל את התהליכים האנאבוליים של המדינה מוזן על ידי הקלת פעפוע של עודפי הסוכר לתוך שריר, תאי שומן נוסף מפעיל גליקוליזה וכן חלבון או חומצות סינתזה, בהתאמה. בנוסף, אינסולין הסתרת פלט גלוקוז בכבד על ידי עיכוב גלוקונאוגנזה. צריכת אנרגיה עודף כרוני ודלקת meta להוביל hyperinsulinemia ו היקפית לאינסולין בשל למטה-ויסות לביטוי קולטן לאינסולין, כמו גם שינויים איתות המסלולים במורד הזרם, ובעקבותיה לקוי רגישות גלוקוז בתיווך האינסולין לרשותו וכן עיכוב לא מספיקות של גלוקוז בכבד ייצור3,4,5,6.
מגוון רחב של מודלים עם אינדוקציה גנטי, תזונתי או ניסיוני של מחלת הוכחו להיות כלי מצוין כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של תנגודת לאינסולין ואת צורות שונות של סוכרת, כמו גם מחלות הנלוות שלה7 . דוגמה הוא הדגם בשימוש נרחב וותיקה HFD-induced העכבר, אשר מאופיין על ידי עלייה מהירה במשקל עקב תזונה מוגברת בשילוב עם מופחתת יעילות מטבולית, וכתוצאה מכך אינסולין התנגדות8, 9. הן בבעלי חיים ובבני אדם, ובחרמון צום גלוקוז, אינסולין ברמות בדם, כמו גם סובלנות לקוי גלוקוז למינהל הם אינדיקטורים בשימוש תכוף של תנגודת לאינסולין והשינויים מערכתית אחרים של גלוקוז חילוף החומרים. ניטור גלוקוז, אינסולין רמות בדם המדינה הבזליים או לאחר גירוי ולכן הם המפרט נגיש בקלות.
בפרוטוקול הנוכחי מתאר את הדור של עכברים HFD-fed, כמו גם שתי שיטות נפוצות, הבדיקה סובלנות גלוקוז דרך הפה (OGTT) ואת הבדיקה עמידות לאינסולין (ITT), אשר שימושיים כדי לאפיין את פנוטיפ מטבולית וכדי לחקור שינויים בחילוף החומרים של גלוקוז. אנו מתארים את OGTT בפירוט, הבודק לרשות הפרשת עומס, אינסולין גלוקוז אוראלית לאורך זמן. יתר על כן, אנו מספקים ההוראות כיצד לנהל את ITT לחקור לכל הגוף לאינסולין-פעולה על-ידי ניטור ריכוז הגלוקוז בדם בתגובה סיילין של אינסולין. הפרוטוקולים המתוארות במאמר זה ומבוססת, נעשה שימוש במספר מחקרים10,11,12. בנוסף שינויים קלים אשר עשוי לסייע להגביר הצלחה, אנו מספקים הנחיות תכנון ניסויים, ניתוח נתונים, כמו גם עצות שימושיות להימנע ממלכודות הפוטנציאל. הפרוטוקולים המפורטים להלן יכולים להיות כלי רב עוצמה כדי לחקור את ההשפעה של גורמים סביבתיים גנטי תרופתי, תזונתיים, אחרים על חילוף החומרים של הגלוקוז בגוף כל ועל הפרעות המשויכת שלו כמו תנגודת לאינסולין. בנוסף גירוי עם גלוקוז או אינסולין, מגוון רחב של תרכובות אחרות עשוי לשמש לגירוי בהתאם למטרת מחקר אישיים. למרות מחוץ הטווח של כתב יד זה, יישומים רבים אחרים במורד הזרם ניתן לבצע את דגימות הדם נמשך, כגון הניתוח של דם ערכים שאינם גלוקוז, אינסולין (למשל, שומנים בדם, כולסטרול # ליפופרוטאינים פרופילי) כמו גם נתונים היסטוריים ניתוח של סמנים מטבוליים (למשל, על ידי בזמן אמת כמותיים פולימראז תגובת שרשרת (PCR), ניתוח תספיג Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (אליסה)). בהמשך flow cytometry, קרינה פלואורסצנטית מופעל התא מיון (FACS) ניתן להחיל לחקור את ההשפעות אוכלוסיות נפרדות תא בודד, בעוד transcriptomic פרוטיאומיה מבנית, גישות metabolomic עשוי גם להיות מנוצל עבור ניתוח untargeted.
בסך הכל, אנו מספקים פרוטוקול פשוט כדי ליצור מודל HFD-induced העכבר, בעוד נוסף המתאר שתי גישות עוצמה ללמוד שינויים מטבוליים לכל הגוף, את OGTT, ITT, אשר יכול להיות כלים שימושיים ללימוד בפתוגנזה של המחלה, פיתוח טיפולים חדשים, בעיקר בתחום של חילוף החומרים-הקשורים למחלות כמו תנגודת לאינסולין & סוכרת.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse strain: C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td>LFD/HFD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu Chek Performa - Glucometer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6870228</td>
			<td>OGTT/ITT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu Chek Performa - Strips</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6454038</td>
			<td>OGTT/ITT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td>OGTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actrapid - Insulin</td>
			<td>Novo Nordisk</td>
			<td>417642</td>
			<td>ITT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable Feeding Needles</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#18061-22</td>
			<td>OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix-Fine dosing syringes</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>OGTT/ITT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Insulin needle (30G x 1/3&#34;; &#248; 0.30 x 13 mm)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>304000</td>
			<td>ITT; lean mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican (G 27 x 3/4&#34;; &#248; 0.40 x 20 mm)&#160;&#160;</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657705</td>
			<td>ITT; mice on HFD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible</td>
			<td>Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td>SP0016</td>
			<td>OGTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit</td>
			<td>Crystam Chem</td>
			<td>90080</td>
			<td>OGTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Diet with 60% kcal% fat</td>
			<td>Research Diets Inc</td>
			<td>D12492</td>
			<td>mice on HFD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Diet with 10% kcal% fat.</td>
			<td>Research Diets Inc</td>
			<td>D12450B</td>
			<td>mice on LFD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND micro haematocrit capillary</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR749321</td>
			<td>OGTT/ITT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline - creme</td>
			<td>Riviera</td>
			<td>P1768677</td>
			<td>OGTT/ITT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of in vivo glucose metabolism in high-fat diet-fed mice using oral glucose tolerance test (ogtt) and insulin tolerance test (itt)

השמנת יתר מייצג את גורם הסיכון יחיד הכי חשוב בפתוגנזה של סוכרת מסוג 2, מחלה המתאפיינת התנגדות ספיגת הגלוקוז האינסולין, על ההחרפה ברוטו של מטבוליזם הגלוקוז מערכתית. למרות התקדמות ניכרת בהבנת מטבוליזם הגלוקוז, המנגנון המולקולרי של רגולציה שלה על בריאות ומחלה נשארים תחת-חקר, ואילו רומן גישות כדי למנוע ולטפל סוכרת נחוצים בדחיפות. דיאטה גלוקוז נגזר מעוררת הפרשת אינסולין, אשר משמש הרגולטור הראשי של התהליכים האנאבוליים הסלולר במהלך המדינה האכילו ובכך מאזן את רמת הסוכר בדם הלבלב רמות כדי לשמור על מצב האנרגיה מערכתית. האכלת מפעילים מטא-דלקת כרונית, מה שמוביל שינויים בהיקפי אינסולין. הקשורים קולטן איתות, ובכך מפחיתה את הרגישות וחיסול בתיווך אינסולין הגלוקוז. אירועים אלה בסופו של דבר לגרום גלוקוז בצום גבוהות, רמות האינסולין, כמו גם הפחתה גלוקוזה, אשר בתורו לשמש האינדיקטורים החשובים של תנגודת לאינסולין. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להפוך את הדור מטבולית איפיון תזונה עתירת שומן (HFD)-נמאס עכברים כמודל בשימוש תכוף של דיאטה-induced תנגודת לאינסולין. אנו מדגימים בפירוט את המבחן סובלנות גלוקוז דרך הפה (OGTT), אשר עוקב אחר לרשות היקפיים של הפרשת עומס, אינסולין גלוקוז אוראלית לאורך זמן. בנוסף, אנו מציגים פרוטוקול עבור הבדיקה עמידות אינסולין (ITT) לעקוב אחר פעילות לכל הגוף לאינסולין. יחד, שיטות אלה ושימושיהם במורד הזרם מייצגים כלים רבי-עוצמה כדי לאפיין את פנוטיפ מטבולי כללי של עכברים גם לגבי במיוחד להעריך שינויים בחילוף החומרים של גלוקוז. הם עשויים להיות שימושית במיוחד בתחום מחקרית רחבה של תנגודת לאינסולין, סוכרת והשמנה לספק הבנה טובה יותר של פתוגנזה גם כדי לבחון את ההשפעה של התערבויות טיפוליות.

איור 1 מדגימה על לוח זמנים סכמטית phenotyping מטבולית של עכברים על דיאטות. בגיל כ- 6 שבועות, עכברים להניחה על HFD, בעוד קבוצת-LFD עשוי לשמש קבוצת הביקורת. חשוב, משקל הגוף צריך להיות נחוש מדי שבוע כדי לבחון אם יש עלייה במשקל הגוף הצפוי. כל סוג של לחץ (למשל, רעש או הת?...

Watch this Scientific Journal Video about Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT at JoVE.com

מחקר על חילוף החומרים של גלוקוז In Vivo בעכברים המוזנים בדיאטה עתירת שומן באמצעות מבחן סובלנות גלוקוז פומי OGTT ובדיקת סבילות לאינסולין ITT | רפואה | וִידֵאוֹ

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

חקר In Vivo מטבוליזם הגלוקוז עכברים הניזונה דיאטה עתירת שומן באמצעות בדיקת הגלוקוז אוראלי סובלנות (OGTT) ובדיקה עמידות לאינסולין (ITT)

המאמר הנוכחי מתאר את הדור ואת מטבולית איפיון של עכברים-fed דיאטה עתירת שומן כמודל של עמידות לאינסולין הנוצרות על-ידי תזונה והשמנה. עוד כולל פרוטוקולים מפורט לביצוע הבדיקה סובלנות גלוקוז דרך הפה ואת הבדיקה עמידות אינסולין, מעקב אחר שינויים לכל הגוף של גלוקוז חילוף החומרים ויוו.

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to ...

study-vivo-glucose-metabolism-high-fat-diet-fed-mice-using-oral

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Medicine

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT)

Cellular Processes

Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

67.4K Views.  Medical University of Vienna. המאמר הנוכחי מתאר את הדור ואת מטבולית איפיון של עכברים-fed דיאטה עתירת שומן כמודל של עמידות לאינסולין הנוצרות על-ידי תזונה והשמנה. עוד כולל פרוטוקולים מפורט לביצוע הבדיקה סובלנות גלוקוז דרך הפה ואת הבדיקה עמידות אינסולין, מעקב אחר שינויים לכל הגוף של גלוקוז חילו?...

Video: Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

Making Sense of Listening: The IMAP Test Battery

The ability to hear is only the first step towards making sense of the range of information contained in an auditory signal. Of equal importance are the abilities to extract and use the information encoded in the auditory signal. We refer to these as listening skills (or auditory processing AP). Deficits in these skills are associated with delayed language and literacy development, though the nature of the relevant deficits and their causal connection with these delays is hotly debated.
When a child is referred to a health professional with normal hearing and unexplained difficulties in listening, or associated delays in language or literacy development, they should ideally be assessed with a combination of psychoacoustic (AP) tests, suitable for children and for use in a clinic, together with cognitive tests to measure attention, working memory, IQ, and language skills. Such a detailed examination needs to be relatively short and within the technical capability of any suitably qualified professional. Current tests for the presence of AP deficits tend to be poorly constructed and inadequately validated within the normal population. They have little or no reference to the presenting symptoms of the child, and typically include a linguistic component. Poor performance may thus reflect problems with language rather than with AP. To assist in the assessment of children with listening difficulties, pediatric audiologists need a single, standardized child-appropriate test battery based on the use of language-free stimuli.
We present the IMAP test battery which was developed at the MRC Institute of Hearing Research to supplement tests currently used to investigate cases of suspected AP deficits. IMAP assesses a range of relevant auditory and cognitive skills and takes about one hour to complete. It has been standardized in 1500 normally-hearing children from across the UK, aged 6-11 years. Since its development, it has been successfully used in a number of large scale studies both in the UK and the USA. IMAP provides measures for separating out sensory from cognitive contributions to hearing. It further limits confounds due to procedural effects by presenting tests in a child-friendly game-format. Stimulus-generation, management of test protocols and control of test presentation is mediated by the IHR-STAR software platform. This provides a standardized methodology for a range of applications and ensures replicable procedures across testers. IHR-STAR provides a flexible, user-programmable environment that currently has additional applications for hearing screening, mapping cochlear implant electrodes, and academic research or teaching.

A test battery (IMAP) for performing an in-depth assessment of auditory and cognitive abilities contributing to listening skills is described. It is quick to administer, child-friendly and free from linguistic confounds. Stimulus generation and protocol management are controlled via a software platform (IHR-STAR) to ensure replicable procedures.

יצירת תחושה של הקשבה: סוללה מבחן IMAP

The ability to hear is only the first step towards making sense of the range of information contained in an auditory signal. Of equal importance are the ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time and temperature restrictions, technical sophistication, and cost of reagents, in particular monoclonal antibodies to measure CD4 on blood cells, the only currently acceptable method. A commonly used cost-saving and time-saving laboratory strategy is to calculate, rather than measure certain blood values. For example, LDL levels are calculated using the measured levels of total cholesterol, HDL, and triglycerides1. Thus, identification of cell-free correlates that directly regulate the number of CD4+ T cells could provide an accurate method for calculating CD4 counts due to the physiological relevance of the correlates.
The number of stem cells that enter blood and are destined to become circulating CD4+ T cells is determined by the chemokine CXCL12 and its receptor CXCR4 due to their influence on locomotion2. The process of stem cell locomotion into blood is additionally regulated by cell surface human leukocyte elastase (HLECS) and the HLECS-reactive active &alpha;1proteinase inhibitor (&alpha;1PI, &alpha;1antitrypsin, SerpinA1)3. In HIV-1 disease, &alpha;1PI is inactivated due to disease processes 4. In the early asymptomatic categories of HIV-1 disease, active &alpha;1PI was found to be below normal in 100% of untreated HIV-1 patients (median=12 &mu;M, and to achieve normal levels during the symptomatic categories4, 5. This pattern has been attributed to immune inactivation, not to insufficient synthesis, proteolytic inactivation, or oxygenation. We observed that in HIV-1 subjects with &gt;220 CD4 cells/&mu;l, CD4 counts were correlated with serum levels of active &alpha;1PI (r2=0.93, p&lt;0.0001, n=26) and inactive &alpha;1PI (r2=0.91, p&lt;0.0001, n=26) 5. Administration of &alpha;1PI to HIV-1 infected and uninfected subjects resulted in dramatic increases in CD4 counts suggesting &alpha;1PI participates in regulating the number of CD4+ T cells in blood 3.
With stimulation, whole saliva contains sufficient serous exudate (plasma containing proteinaceous material that passes through blood vessel walls into saliva) to allow measurement of active &alpha;1PI and the correlation of this measurement is evidence that it is an accurate method for calculating CD4 counts. Briefly, sialogogues such as chewing gum or citric acid stimulate the exudation of serum into whole mouth saliva. After stimulating serum exudation, the activity of serum &alpha;1PI in saliva is measured by its capacity to inhibit elastase activity. Porcine pancreatic elastase (PPE) is a readily available inexpensive source of elastase. PPE binds to &alpha;1PI forming a one-to-one complex that prevents PPE from cleaving its specific substrates, one of which is the colorimetric peptide, succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA3NA). Incubating saliva with a saturating concentration of PPE for 10 min at room temperature allows the binding of PPE to all the active &alpha;1PI in saliva. The resulting inhibition of PPE by active &alpha;1PI can be measured by adding the PPE substrate SA3NA. (Figure 1). Although CD4 counts are measured in terms of blood volume (CD4 cells/&mu;l), the concentration of &alpha;1PI in saliva is related to the concentration of serum in saliva, not to volume of saliva since volume can vary considerably during the day and person to person6. However, virtually all the protein in saliva is due to serum content, and the protein content of saliva is measurable7. Thus, active &alpha;1PI in saliva is calculated as a ratio to saliva protein content and is termed the &alpha;1PI Index. Results presented herein demonstrate that the &alpha;1PI Index provides an accurate and precise physiologic method for calculating CD4 counts.

The &#945;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

A CD4 enumeration method, the &#x03B1;-test, is described which uses whole saliva to provide rapid and accurate CD4 counts. The &alpha;-test costs pennies and eliminates the need for technical training, costly reagents such as monoclonal antibodies, instrumentation, refrigeration, transport of samples, as well as collection and handling of blood.

Α-מבחן: ראפיד נייד ללא ספירת CD4 באמצעות הרוק שלם

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the arteries (&beta;2). When systemically administered, it increases cardiac demand. Thus, dobutamine unmasks abnormal rhythm or ischemic areas potentially at risk of infarction. 
Monitoring of heart function during a cardiac stress test can be performed by either ecocardiography or cardiac catheterization. The latter is an invasive but more accurate and informative technique that the former.
Cardiac stress test induced by dobutamine and monitored by cardiac catheterization accomplished as described here allows, in a single experiment, the measurement of the following hemodynamic parameters: heart rate (HR), systolic pressure, diastolic pressure, end-diastolic pressure, maximal positive pressure development (dP/dtmax) and maximal negative pressure development (dP/dtmin), at baseline conditions and under increasing doses of dobutamine.
As expected, in normal mice we observed a dobutamine dose-related increase in HR, dP/dtmax and dP/dtmin. Moreover, at the highest dose tested (12 ng/g/min) the cardiac decompensation of high fat diet-induced obese mice was unmasked.

We describe the protocol to perform a cardiac stress test induced by dobutamine and monitored by cardiac catheterization in normal mice. Also we show its application to unmask subclinical cardiac disease in high fat diet-induced obese mice.

בדיקת מאמץ לב הנגרמת על ידי Dobutamine ופיקוח על ידי צנתור בעכברים

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

<em&gt; In vivo</em&gt; Assay לבדיקת חדירות כלי דם

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used techniques require killing of the animals and postmortem recovery of the meal1,2. This approach prevents longitudinal studies to determine changes in gastric emptying with age and progression of disease. The commonly used [13C]-octanoic acid breath test for humans3 has been modified for use in mice4-6 and rats7 and we previously showed that this test is reliable and responsive to changes in gastric emptying in response to drugs and during diabetic disease progression8. In this video presentation the principle and practical implementation of this modified test is explained. As in the previous study, NOD LtJ mice are used, a model of type 1 diabetes9. A proportion of these mice develop the symptoms of gastroparesis, a complication of diabetes characterized by delayed gastric emptying without mechanical obstruction of the stomach10.
This paper demonstrates how to train the mice for testing, how to prepare the test meal and obtain 4 hr gastric emptying data and how to analyze the obtained data. The carbon isotope analyzer used in the present study is suitable for the automatic sampling of the air samples from up to 12 mice at the same time. This technique allows the longitudinal follow-up of gastric emptying from larger groups of mice with diabetes or other long-standing diseases.

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Determination of gastric emptying with a non-invasive [13C]-octanoic acid breath test for tracking gastroparesis in female NOD LtJ mice.

הערכה של ריקון קיבה בעכברים סוכרתיים ללא שימוש בשמנים [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-octanoic בדיקת נשימת חומצה

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used ...

Characterization of Metabolic Status in Nonhuman Primates with the Intravenous Glucose Tolerance Test

The intravenous glucose tolerance test (IVGTT) plays a key role in the characterization of glucose homeostasis. When taken together with serum biochemical profiles, inclusive of blood glucose levels in both the fed and fasted state, HbA1c, insulin levels, clinical history of diet, body composition, and body weight status, an assessment of normal and abnormal glycemic control can be made. Interpretation of an IVGTT is done through measurement of changes in glucose and insulin levels over time in relation to the dextrose challenge. Critical components to be considered are: peak glucose and insulin levels reached in relation to T0 (end of glucose infusion), the glucose clearance rate K derived from the slope of rapid glucose clearance in the first 20 min (T1 to T20), the time to return to glucose baseline, and the area under the curve (AUC). These IVGTT measures will show characteristic changes as glucose homeostasis moves from a healthy to a diseased metabolic state5. Herein we will describe the characterization of nonhuman primates (Rhesus and Cynomolgus macaques), which are the most relevant animal model of Type II diabetes (T2D) in humans and the IVGTT and clinical profiles of these animals from a lean healthy, to obese dysmetabolic, and T2D state 8, 10, 11.

The goal of this protocol is to present a standard method to perform intravenous glucose tolerance tests (IVGTTs) to assess glycemic control in nonhuman primates and assess their metabolic status from healthy to dysmetabolic.

אפיון המצב המטבולי ב אנושיות פרימטים עם מבחן העמסת סוכר תוך ורידי

The intravenous glucose tolerance test (IVGTT) plays a key role in the characterization of glucose homeostasis. When taken together with serum biochemical ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Determining Glucose Metabolism Kinetics Using 18F-FDG Micro-PET/CT

This paper describes the use of 18F-FDG and micro-PET/CT imaging to determine in vivo glucose metabolism kinetics in mice (and is transferable to rats). Impaired uptake and metabolism of glucose in multiple organ systems due to insulin resistance is a hallmark of type 2 diabetes. The ability of this technique to extract an image-derived input function from the vena cava using an iterative deconvolution method eliminates the requirement of the collection of arterial blood samples. Fitting of tissue and vena cava time activity curves to a two-tissue, three compartment model permits the estimation of kinetic micro-parameters related to the 18F-FDG uptake from the plasma to the intracellular space, the rate of transport from intracellular space to plasma and the rate of 18F-FDG phosphorylation. This methodology allows for multiple measures of glucose uptake and metabolism kinetics in the context of longitudinal studies and also provides insights into the efficacy of therapeutic interventions.

Determining Glucose Metabolism Kinetics Using 18F-FDG Micro-PET/CT

This study describes a protocol that uses 18F-FDG and positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) imaging, together with kinetic modelling, to quantify the in vivo, real-time uptake of 18F-FDG into tissues.

קביעת קינטיקס והגלוקוז שימוש<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG מיקרו-PET / CT

This paper describes the use of 18F-FDG and micro-PET/CT imaging to determine in vivo glucose metabolism kinetics in mice (and is transferable to rats). ...

Improving Strength, Power, Muscle Aerobic Capacity, and Glucose Tolerance through Short-term Progressive Strength Training Among Elderly People

This protocol describes the simultaneous use of a broad span of methods to examine muscle aerobic capacity, glucose tolerance, strength, and power in elderly people performing short-term resistance training (RET). Supervised progressive resistance training for 1 h three times a week over 8 weeks was performed by RET participants (71&#177;1 years, range 65-80). Compared to a control group without training, the RET showed improvements on the measures used to indicate strength, power, glucose tolerance, and several parameters of muscle aerobic capacity. Strength training was performed in a gym with only robust fitness equipment. An isokinetic dynamometer for knee extensor strength permitted the measurement of concentric, eccentric, and static strength, which increased for the RET group (8-12% post- versus pre-test). The power (rate of force development, RFD) at the initial 0-30 ms also showed an increase for the RET group (52%). A glucose tolerance test with frequent blood glucose measurements showed improvements only for the RET group in terms of blood glucose values after 2 h (14%) and the area under the curve (21%). The blood lipid profile also improved (8%). From muscle biopsy samples prepared using histochemistry, the amount of fiber type IIa increased, and a trend towards a decrease in IIx in the RET group reflected a change to a more oxidative profile in terms of fiber composition. Western blot (to determine the protein content related to the signaling for muscle protein synthesis) showed a rise of 69% in both Akt and mTOR in the RET group; this also showed an increase in mitochondrial proteins for OXPHOS complex II and citrate synthase (both ~30%) and for complex IV (90%), in only the RET group. We demonstrate that this type of progressive resistance training offers various improvements (e.g., strength, power, aerobic capacity, glucose tolerance, and plasma lipid profile).

The effect of short-term resistance training on elderly people was investigated through the simultaneous use of several methods. Compared to a control group, many improvements were seen, including on muscle aerobic capacity, glucose tolerance, strength, power, and muscle quality (i.e., protein involved in cell signaling and muscle fiber type composition).

שיפור כוח, כוח, יכולת שריר אירובי, סובלנות גלוקוז באמצעות אימון לטווח קצר כוח מתמשך בקרב אנשים קשישים

This protocol describes the simultaneous use of a broad span of methods to examine muscle aerobic capacity, glucose tolerance, strength, and power in ...

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues contributes to type 2 diabetes mellitus (T2DM) development and appetite regulation in the hypothalamus. Chemokine CCL5 and C-C chemokine receptor type 5 (CCR5) levels have been suggested to mediate arteriosclerosis and glucose intolerance in type 2 diabetes mellitus (T2DM). In addition, CCL5 plays a neuroendocrine role in the hypothalamus by regulating food intake and body temperature, thus, prompting us to investigate its function in hypothalamic insulin signaling and the regulation of peripheral glucose metabolism.
The micro-osmotic pump brain infusion system is a quick and precise way to manipulate CCL5 function and study its effect in the brain. It also provides a convenient alternative approach to generating a transgenic knockout animal. In this system, CCL5 signaling was blocked by intracerebroventricular (ICV) infusion of its antagonist, MetCCL5, using a micro-osmotic pump. The peripheral glucose metabolism and insulin responsiveness was detected by the Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). Insulin signaling activity was then analyzed by protein blot from tissue samples derived from the animals.
After 7-14 days of MetCCL5 infusion, the glucose metabolism and insulin responsiveness was impaired in mice, as seen in the results of the OGTT and ITT. The IRS-1 serine302 phosphorylation was increased and the Akt activity was reduced in mice hypothalamic neurons following CCL5 inhibition. Altogether, our data suggest that blocking CCL5 in the mouse brain increases the phosphorylation of IRS-1 S302 and interrupts hypothalamic insulin signaling, leading to a decrease in insulin function in peripheral tissues as well as the impairment of glucose metabolism.

This protocol studies the role of chemokine (C-C motif) ligand 5 (CCL5) in the hypothalamus by delivering an antagonist, MetCCL5, into the mouse brain using a micro-osmotic pump brain infusion system. This transient inhibition of CCL5 activity interrupted hypothalamic insulin signaling, leading to glucose intolerance and peripheral systemic insulin sensitivity.

לומדים את האות ההיפותלמוס אינסולין סובלנות גלוקוז היקפי עם מערכת עירוי רציף סמים לתוך המוח העכבר

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

חקר In Vivo מטבוליזם הגלוקוז עכברים הניזונה דיאטה עתירת שומן באמצעות בדיקת הגלוקוז אוראלי סובלנות (OGTT) ובדיקה עמידות לאינסולין (ITT)

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST