Z.C. מאשר התמיכה של קרן הפעלה דארטמאות והחברה ברנקו וייס - לאחווה המדע, מנוהל על ידי ETH ציריך. המחברים תודה ד"ר לארי א טאבר, Benjamen א Filas, גואו Qiaohang, ו Yunfei שי לדיונים מועיל, כמו גם הבודקים אנונימי להערות. חומר זה מתבסס על עבודה נתמכת על-ידי הלאומית למדע קרן בוגר מחקר לאחווה תחת גרנט מס DGE-1313911. כל דעה, ממצאים, מסקנות או המלצות לידי ביטוי בחומר זה הם אלה של המחברים (s), אינן משקפות בהכרח את הנופים של הקרן הלאומית למדע.

1. הכנת תרביות רקמה מדיה
<ol><li>השתמש בקבוק חצי ליטר בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) עם גלוקוז 4.5 g/L, סודיום ביקרבונט-גלוטמין כבסיס לתקשורת תרבות.</li>
	<li>ב תא סטרילי למינארי, להוסיף 10 מ של אנטיביוטיקה חצי ליטר של DMEM.</li>
	<li>באמצעות פיפטה סטרילי, להעביר צינור חרוטי סטרילי 50 מ ל 50 מ של הפתרון אנטיביוטיקה DMEM.</li>
	<li>להוסיף 50 מ של נסיוב החתיכה הפתרון אנטיביוטיקה DMEM שנותרו בבקבוק 0.5 L בשכונה סטרילי.</li>
	<li>לאחסן הפתרון הסופי (המכונה מכאן והלאה צ'יק תרבות המדיה [CCM]) ב- 50 מ ל aliquots צינור חרוטי ב-20 ° C.</li>
</ol>2. דגירה
<ol><li>שימוש עדין מגבונים עם 70% אתנול לנקות מופרית ספציפי פתוגן-חופשית לגהורן לבן ביצי תרנגולת. לארגן ביצים כיוון האורך על מחזיקי.</li>
	<li>הפעל אינקובטור ביצים להגדיר יעד לטמפרטורה של 37.5 ° C ולשמור על הלחות ב 48-55%. הלחות נשלטת על-ידי הוספת כמות מספקת של מים החממה.</li>
	<li>דגירה הביצים HH11-13, כ 40-44 h.</li>
	<li>תן שהביצים להתקרר בטמפרטורת החדר במשך כ- 15-30 דקות לפני הריסוס/ניקוי עם 70% אתנול.</li>
</ol>3. משוך נימים זכוכית
<ol><li>הר של צינורות קפילר באורך ס מ זכוכית 10 עם הקוטר החיצוני של 1.0 מ מ, של הקוטר הפנימי של 0.5 מ מ- פולר micropipette.</li>
	<li>הגדר את החום ומשוך פרמטרים 750, 400, בהתאמה. לחץ על לחצן משיכה כדי לגרור את צינור קפילרי מחטים דק.</li>
</ol>4. נייר סינון הספק שיטה
<ol><li>חותכים עיגולים של 3 ס מ קוטר מסנן נייר.</li>
	<li>חותכים מלבן בערך 1 ס מ על ידי 2 ס מ מן המעגל באמצעות צעצועים. הקפד להסיר כל בולטות או פינות חדות.</li>
</ol>5. העובר קציר והכנות
<ol><li>לפצח את הביצים מלמטה, להפריד את הקליפה בעדינות, היטב להפקיד תוכן לתוך צלחת פטרי 150 מ"מ x 15 מ"מ. כדי להבטיח שהצד העובר קורה, לשמור את הביצים באותו הכיוון שהם היו מתפשט תוך פיצוח אותם.</li>
	<li>הסר את אלבומין דק בעזרת פיפטה חד פעמיות של פסטר.</li>
	<li>להפריד את אלבומין עבה החלמון באמצעות מלקחיים שהסתיימה בוטה. ודא כי אלבומין עבה הוסר על ידי גירוד בקלילות העליון של החלמון עם המלקחיים שהסתיימה בוטה.</li>
	<li>להשתמש מלקחיים שקצהו הקנס מרכז ולמקם טבעת נייר סינון על העובר, התאמת לציר הארוך של הטבעת עם הציר הארוך של העובר.</li>
	<li>חותכים את החלמון המקיפים את הטבעת נייר סינון עם מספריים.</li>
	<li>למשוך את הטבעת ואת העובר את החלמון אלכסוני לכיוון האתר שבו החלמון תחילה נחתך.</li>
	<li>יש לשטוף את העוברים בתוך שתי מנות 100-מ מ רציפים עם טמפרטורת החדר 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS).</li>
	<li>במקום הראשון טבעת נייר סינון לתוך צלחת פטרי 35 מ מ. אז במקום הצד הגבי העובר על גבי נייר הסינון כבר בצלחת פטרי 35 מ מ.</li>
	<li>במקום טבעת נירוסטה על גבי נייר סינון הכריך. ודא שלא יגרמו נזק העובר.</li>
	<li>להוסיף 3 מ"ל של CCM מוכן קודם לכן כל צלחת פטרי.</li>
	<li>להסיר את ה-VM של כל העובר על ידי בקלילות מרמה את המחט נימי משך לרוחב החלק העליון של העובר, פילינג VM משם, החל מהקצה הקדמי (מעל הקדמי), שימשיך מיתר הגב (איור 1 א').</li>
	<li>מקום 8 35 מ מ צלחות פטרי לתוך צלחת אחת של 150 מ מ זה היה רצוף מים רווי המשימה העדינה מגבונים (כדי לשמור על לחות).</li>
	<li>המקום הפטרי 150-מ מ לתוך שקית ניילון sealable ואז למלא את התיק עם תערובת גז המורכב 95% O2 ו- 5% CO2.</li>
	<li>לסגור את השקית ולמקם אותו חממה 37.5 ° C.</li>
	<li>דגירה העוברים עבור h 27 נוספים עד HH15-HH16 (איור 1B).</li>
</ol>6. גרימת מתח פנים
<ol><li>להסיר את העוברים מן החממה ולהשתמש מערכת אופטית קוהרנטית טומוגרפיה (אוקטובר) תמונה אותם. שימוש OCT כדי לקבוע את זווית הכיווניות הצינור העצבי (NT) (איור 2).</li>
	<li>להעביר את העוברים מיקרוסקופ אור והמחש בהגדלה X 10. להשתמש על פיפטה 200 microliter בהדרגה להסיר את 0.2 מ"ל של מדיה הפטרי.</li>
	<li>קח תמונות brightfield בכל פרק זמן לבחון את ההשפעות של ממשק מדיה-אייר על העובר.</li>
	<li>להסיר מדיה עד המתח על פני העובר גורם פיתול (איור 1C).</li>
	<li>תמונה העובר באמצעות מערכת OCT פעם נוספת כדי לקבוע זווית הפיתוליות הסופי להשוואה לשלוט עוברי.  הערה: התמונות ברייט-שדה נרכשו באמצעות מיקרוסקופ ויבתר. מערכת טומוגרפיה אופטית קוהרנטית עם מיקרוסקופ המצורפת שימש לרכוש אוספי תמונות חתך של העוברים בשידור חי. תמונות היו שהושגו בתחום 3 x 10 מ"מ x 3 מ"מ3 סריקה ולאחר מכן מעובד בתוכנת הדמיה. לבסוף, מודל פיזיקלי התמונות צולמו באמצעות מצלמה דיגיטלית רפלקס יחיד-עדשה.</li>
</ol>7. פיזית מידול של כוחות מתח/VM
<ol><li>לפתח הגיאומטריה 3D פשוטה הדומה העובר בין 17-HH14 בתוכנה מסחרית דוגמנות (איור 3 א).</li>
	<li>עיצוב כייר שלילי של הגיאומטריה 3D תירחסמ 3D גרפיקה תוכנה.</li>
	<li>שימוש במדפסת תלת-ממד נטען עם מ מ 1.75 בוטאדיאן טבעי styrene פילמנט תלת-ממד הדפס מעוצב העובש, בתבנית stereolithographic (.stl).</li>
	<li>להטיל את התבנית, לערבב את הרכיבים גומי סיליקון של אלסטומר A ו- B בחלקים שווים, יוצקים את התערובת לתבנית באופן מיידי; הגדר את עובש הליהוק לרפא בטמפרטורת החדר במשך 12 שעות (איור 3B).</li>
	<li>סמן את מודל פיזיקלי של העובר לאורך NT בצד הגבי להמחיש פיתול.</li>
	<li>השתמש coverslip כדי לשכפל את כוח להחיל על דגם התלת-ממד פיזי אשר מחקה את זה של VM או מתח (דמות תלת-ממד).</li>
	<li>הכנס של סדרת נוקשה חוטים באורך שווה לצד של המודל הפיזי. לאחר coverslip מפעילה כוח חיצוני על המודל המוח, החוטים להיות מוטה בזווית תלוי במיקום. לקבוע את זווית הסיבוב על ידי arctan של אורך המוקרנת על אורך כל חוט (איור 3E) המקורי.</li>
</ol>8. שינוי הכיוון של הלולאה הלב
<ol><li>בצע את השלבים ב 3.1 ו- 3.2 לקבל צינור קפילרי משך.</li>
	<li>בצע את השלבים ב- 5.1 דרך 5.10 להכין את העובר.</li>
	<li>השתמש זוג מלקחיים כדי להפוך נייר הסינון כך העובר הופכת הגחוני /-צד-up.</li>
	<li>השתמש את צינור קפילרי משך לחתוך חתך ממברנה splanchnopleure (SPL).</li>
	<li>השתמש את צינור קפילרי להפעיל כוח מכני כדי לדחוף את הלב מן הצד הימני בצד שמאל.</li>
	<li>בצע את השלבים ב- 5.12 דרך 5.15 כדי לבחון את השינוי שחל פיתול.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanics+of+Growth,+Remodeling,+and+Morphogenesis.">Biomechanics of Growth, Remodeling, and Morphogenesis.</a> Appl. Mech. Rev. 48, 487-545 (1995).</li><li>Wyczalkowski, M. A., Chen, Z., Filas, B. A., Varner, V. D., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+models+for+mechanics+of+morphogenesis.">Computational models for mechanics of morphogenesis.</a> Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 96, 132-152 (2012).</li><li>Savin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+growth+and+form+of+the+gut.">On the growth and form of the gut.</a> Nature. 476, 57-62 (2011).</li><li>Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanics+of+development:+Models+and+methods+for+tissue+morphogenesis.">The mechanics of development: Models and methods for tissue morphogenesis.</a> Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 90, 193-202 (2010).</li><li>Shyer, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Villification:+how+the+gut+gets+its+villi.">Villification: how the gut gets its villi.</a> Science. 342, 212-218 (2013).</li><li>Ambrosi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+biological+growth+and+remodeling.">Perspectives on biological growth and remodeling.</a> Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 59, 863-883 (2011).</li><li>Chen, Z., Majidi, C., Srolovitz, D. J., Haataja, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+helical+ribbons.">Tunable helical ribbons.</a> Appl. Phys. Lett. 98, (2011).</li><li>Gerbode, S. J., Puzey, J. R., McCormick, A. G., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+cucumber+tendril+coils+and+overwinds.">How the cucumber tendril coils and overwinds.</a> Science. 337, 1087-1091 (2012).</li><li>Armon, S., Efrati, E., Kupferman, R., Sharon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+and+mechanics+in+the+opening+of+chiral+seed+pods.">Geometry and mechanics in the opening of chiral seed pods.</a> Science. 333, 1726-1730 (2011).</li><li>Filas, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+role+for+differential+contractility+in+early+brain+development+and+evolution.">A potential role for differential contractility in early brain development and evolution.</a> Biomech. Model. Mechanobiol. 11, 1251-1262 (2012).</li><li>Xu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axons+pull+on+the+brain,+but+tension+does+not+drive+cortical+folding.">Axons pull on the brain, but tension does not drive cortical folding.</a> J. Biomech. Eng. 132, 71013 (2010).</li><li>Chen, Z., Guo, Q., Dai, E., Forsch, N., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+embryonic+chick+brain+twists.">How the embryonic chick brain twists.</a> J. R. Soc. Interface. 13, (2016).</li><li>Manca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+regulates+axial+rotation+during+early+stages+of+chick+embryo+development.">Nerve growth factor regulates axial rotation during early stages of chick embryo development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2009-2014 (2012).</li><li>Shi, Y., Yao, J., Xu, G., Taber, L. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bending+of+the+looping+heart:+differential+growth+revisited.">Bending of the looping heart: differential growth revisited.</a> J. Biomech. Eng. 136, 1-15 (2014).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bending+and+twisting+the+embryonic+heart:+A+computational+model+for+c-looping+based+on+realistic+geometry.">Bending and twisting the embryonic heart: A computational model for c-looping based on realistic geometry.</a> Front. Physiol. 5, (2014).</li><li>Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphomechanics:+Transforming+tubes+into+organs.">Morphomechanics: Transforming tubes into organs.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 27, 7-13 (2014).</li><li>Hosseini, H. S., Beebe, D. C., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+effects+of+the+surface+ectoderm+on+optic+vesicle+morphogenesis+in+the+chick+embryo.">Mechanical effects of the surface ectoderm on optic vesicle morphogenesis in the chick embryo.</a> J. Biomech. 47, 3837-3846 (2014).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev. Dyn. 88, 49-92 (1951).</li><li>Shi, Y., Varner, V. D., Taber, L. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+is+cytoskeletal+contraction+required+for+cardiac+fusion+before+but+not+after+looping+begins?.">Why is cytoskeletal contraction required for cardiac fusion before but not after looping begins?.</a> Phys. Biol. 12, 16012 (2015).</li><li>Garcia, K. E., Okamoto, R. J., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contraction+and+stress-dependent+growth+shape+the+forebrain+of+the+early+chicken+embryo.">Contraction and stress-dependent growth shape the forebrain of the early chicken embryo.</a> J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 65, 383-397 (2017).</li><li>Faisst, A. M., Alvarez-Bolado, G., Treichel, D., Gruss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotatin+is+a+novel+gene+required+for+axial+rotation+and+left-right+specification+in+mouse+embryos.">Rotatin is a novel gene required for axial rotation and left-right specification in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 113, 15-28 (2002).</li><li>Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. a., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex-ovo+chicken+embryo+culture+system+suitable+for+imaging+and+microsurgery+applications.">An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li><li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier.">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Dev. Dyn. 220, 284-289 (2001).</li><li>Camp&#224;s, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cell-generated+mechanical+forces+within+living+embryonic+tissues.">Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues.</a> Nat. Methods. 11, 183-189 (2014).</li><li>Schierenberg, E., Junkersdorf, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+eggshell+and+underlying+vitelline+membrane+for+normal+pattern+formation+in+the+early+C.+elegans+embryo.">The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo.</a> Roux's Arch. Dev. Biol. 202, 10-16 (1992).</li><li>Chuai, M., Weijer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanisms+Underlying+Primitive+Streak+Formation+in+the+Chick+Embryo.">The Mechanisms Underlying Primitive Streak Formation in the Chick Embryo.</a> Current Topics in Developmental Biology. 81, 135-156 (2008).</li><li>Voronov, D. A., Alford, P. W., Xu, G., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mechanical+forces+in+dextral+rotation+during+cardiac+looping+in+the+chick+embryo.">The role of mechanical forces in dextral rotation during cardiac looping in the chick embryo.</a> Dev. Biol. 272, 339-350 (2004).</li><li>Raya, A., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+the+establishment+of+left-right+asymmetry+in+the+chick+embryo.">Unveiling the establishment of left-right asymmetry in the chick embryo.</a> Mechanisms of Development. 121, 1043-1054 (2004).</li><li>Voronov, D. A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+looping+in+experimental+conditions:+Effects+of+extraembryonic+forces.">Cardiac looping in experimental conditions: Effects of extraembryonic forces.</a> Dev. Dyn. 224, 413-421 (2002).</li><li>Chen, Z., Huang, G., Trase, I., Han, X., Mei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Self-Assembly+of+a+Strain-Engineered+Flexible+Layer:+Wrinkling,+Rolling,+and+Twisting.">Mechanical Self-Assembly of a Strain-Engineered Flexible Layer: Wrinkling, Rolling, and Twisting.</a> Phys. Rev. Appl. 5, (2016).</li><li>Manner, J., Seidl, W., Steding, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+cervical+flexure:+an+experimental+study+on+chick+embryos.">Formation of the cervical flexure: an experimental study on chick embryos.</a> Acta Anat. (Basel). 152, 1-10 (1995).</li><li>Ware, M., Schubert, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+early+axon+scaffold+in+the+rostral+brain+of+the+chick+embryo.">Development of the early axon scaffold in the rostral brain of the chick embryo.</a> J. Anat. 219, 203-216 (2011).</li><li>Ramasubramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+intrinsic+and+extrinsic+forces+in+early+cardiac+S-looping.">On the role of intrinsic and extrinsic forces in early cardiac S-looping.</a> Dev. Dyn. 242, 801-816 (2013).</li><li>Hoyle, C., Brown, N. a., Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+left/right+handedness+in+the+chick+heart.">Development of left/right handedness in the chick heart.</a> Development. 115, 1071-1078 (1992).</li><li>Nerurkar, N. L., Ramasubramanian, A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+adaptation+of+the+looping+embryonic+heart+to+altered+mechanical+loads.">Morphogenetic adaptation of the looping embryonic heart to altered mechanical loads.</a> Dev. Dyn. 235, 1822-1829 (2006).</li><li>Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+asymmetry+and+the+chick+embryo.">Left-right asymmetry and the chick embryo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 9, 67-76 (1998).</li><li>Roebroek, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+of+ventral+closure+and+axial+rotation+in+embryos+lacking+the+proprotein+convertase+Furin.">Failure of ventral closure and axial rotation in embryos lacking the proprotein convertase Furin.</a> Development. 125, 4863-4876 (1998).</li><li>Peebles, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+proton+spectroscopy+and+diffusion+weighted+imaging+of+chick+embryo+brain+in+ovo.">Magnetic resonance proton spectroscopy and diffusion weighted imaging of chick embryo brain in ovo.</a> Dev. Brain Res. 141, 101-107 (2003).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerberus+regulates+left-right+asymmetry+of+the+embryonic+head+and+heart.">Cerberus regulates left-right asymmetry of the embryonic head and heart.</a> Curr. Biol. 9, 931-938 (1999).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

בעוד פיסיקליות לשחק תפקיד אינטגרלי מורפוגנזה26,27,28,29,30, למנגנונים מכאניים הספציפיים, יחד עם קואורדינציה של מכונות, המנגנונים המולקולריים, להישאר נחקרו במידה רבה. זה ידוע כי flexure הגחוני של פיתול rightward ש?...

ביולוגיה התפתחותית מודרנית המחקר מתמקד בעיקר פיתוח ההבנה מנקודת המבט של גנטיקה מולקולרית1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. ידוע כי התופעה הפיזית לשחק תפקיד מרכזי מורפוגנזה, או הדור של ביולוגית טופס14,15,16,17; עם זאת, מנגנונים מכניים ספציפי של פיתוח נשארים מחקר כלשהו. Flexure הגחוני פיתול rightward של הצינור המוח הפרימיטיבי לאחר המבורגר-המילטון שלב 11 (HH 11)18 הם שני תהליכים עיקריים שתורמים צורה עוברית לשנות19,20. בפרט, המנגנון הפיזי שבבסיס פיתוח הכיווניות של המוח העוברי נשאר שהיישום מובן.
פיתול מתחלקים ב צ'יק העובר הוא בין האירועים morphogenetic המוקדם של אסימטריה (Lr) משמאל בפיתוח. כאשר התהליך של אסימטריה L-R הוא מוטרד, מומים מולדים כגון סיטוס אינברסוס, isomerismאו heterotaxia תתרחש21. כאן אנו מציגים פרוטוקול המשלב לשעבר-ovo ניסויים22,23 עם מידול הפיזי כדי לאפיין כוחות מכני במהלך התפתחות המוח העוברי מוקדמת. מטרת השיטה המובאת היא לזהות את הכוחות מכני אחראי פיתול המוח ואת הגורמים המשפיעים על מידת פיתול במהלך התפתחות מוקדמת12. על סמך התצפית ניסיוני קרום vitelline (VM) מגבילה את הצד הגבי של העובר, שיערנו כי ה-VM מספק את. הכוח הדרוש לגרום פיתול של המוח המתפתח. לכן, בשיטה זו, אנו להסיר את החלק של ה-VM שמכסה את האזור במוח כדי לגלות את ההשפעות על פיתול המוח. יתר על כן, השיטה של החלת נוזלים מתח נעשה שימוש כדי לאשר את תפקיד מכני של VM ולספק הערכה של הכוח הדרוש עבור פיתול המוח, אשר לא נעשה בעבר. מדידת הכוחות במהלך מורפוגנזה עובריים הוא משימה מאתגרת. ראוי לציין, במחקר חלוצי, Campàs ועמיתים24 פיתח שיטה לכמת את הלחצים הסלולר באמצעות microdroplets מוזרק. עם זאת, שיטה זו הייתה מוגבלת למדידת כוחות ברמה התאית, ולכן לא ניתן ליישום כדי לחקור את הכוחות על רקמות או אורגניזם-ברמת. פרוטוקול הציג נייר זה פותחה כדי חלקית למלא את החלל הזה.

<table><tbody><tr><td>Fertilized Specific pathogen-free White Leghorn chicken eggs</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optical Coherent Tomography Microscope</td><td>Thorlabs</td><td>GAN220C1</td><td></td></tr><tr><td>Silicone elastomer</td><td>Smooth-On, Inc.</td><td>EcoFlex 00-50</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Sigma</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>Chick serum</td><td>Sigma</td><td>C5405</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>Model P-30</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Whatman</td><td>5202-110</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Comsol MultiPhysics</td><td>Comsol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D computer graphics software</td><td>Rhino 5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope attached with OCT</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>FN1</td><td></td></tr><tr><td>Digital single-lens reflex camera</td><td>EOS&amp;nbsp;</td><td>Rebel T3i</td><td></td></tr></tbody></table>

probing the roles of physical forces in early chick embryonic morphogenesis

התפתחות באופן מסורתי נלמדת מנקודת המבט של גנטיקה למערכות ביולוגיות, אך החשיבות הבסיסית של מכניקה ב מורפוגנזה מזוהה הופכת יותר ויותר. בפרט, הבחורה עובריים הלב והמוח התחתית, אשר עוברים שינויים מורפולוגיים דרסטי כפי שהם מפתחים, הן בקרב המועמדים הממשלה ללמוד את התפקיד של הכוחות הפיזיקליים במערכת מורפוגנזה. כיפוף הגחון מתקדמת, פיתול rightward של המוח צ'יק עובריים צינורי יקרה בשלב המוקדם של איברים ברמת משמאל המשווע התפתחות האפרוח. קרום vitelline (VM) מגבילה את הצד הגבי של העובר, היה מעורב במתן את. הכוח הדרוש לגרום פיתול של המוח המתפתח. כאן אנו מציגים שילוב של ניסויים לשעבר-ovo חדשים ובאופן פיזי מידול כדי לזהות את המכניקה של פיתול המוח. המבורגר-המילטון שלב 11, העוברים הם קצרו ותרבותית ex ovo (בתקשורת). ה-VM יוסר לאחר מכן באמצעות צינור קפילרי משך. על ידי השליטה הרמה של הנוזל ובאיומים העובר לממשק נוזל-אייר, מתח הפנים נוזלים של התקשורת יכול לשמש כדי להחליף את תפקיד מכני של VM. תיאום הניסויים בוצעו גם לשנות את המיקום של הלב למצוא תוצאות השינוי כיראליות של פיתול המוח. תוצאות של פרוטוקול זה להמחיש את תפקידי היסוד של המכניקה נהיגה מורפוגנזה.

במחקר זה, ה-VM של העובר-HH11 הוסר מהקצה הקדמי כדי flexure בית החזה. העוברים היו עם תמונה באמצעות מערכת OCT. בשלב זה, פיתול המוח צינור לא התחיל (איור 1 א'). לאחר להיות מודגרות עד HH15-16, העוברים עם שלהם VM הוסר הציג פיתול המוח מופחתת שפופרת, כ-35 מעלות (איור 1B) ...

Watch this Scientific Journal Video about Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis at JoVE.com

Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

בודק את התפקידים של הכוחות הפיזיקליים במערכת מורפוגנזה עובריים מוקדם של הבחורה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול היכרות עם ערכת ניסויים לשעבר-ovo חדשים וגישות מודלים פיזיים ללמוד את המכניקה של מורפוגנזה במהלך המוקדמות פיתול המוח העוברי צ'יק.

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis ...

probing-roles-physical-forces-early-chick-embryonic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.2K Views.  Dartmouth College. כאן, אנו מציגים פרוטוקול היכרות עם ערכת ניסויים לשעבר-ovo חדשים וגישות מודלים פיזיים ללמוד את המכניקה של מורפוגנזה במהלך המוקדמות פיתול המוח העוברי צ'יק.

Video: Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression and activation of signal transduction pathways. This technique allows the delivery of signaling molecules at precisely defined developmental stages for specific times. After this embryos can be harvested and gene expression examined, for example by in situ hybridization, or activation of signal transduction pathways observed with immunostaining.
In this video heparin beads soaked in FGF18 or AG 1-X2 beads soaked in U0126, a MEK inhibitor, are grafted into the limb bud in ovo. This shows that FGF18 induces expression of MyoD and ERK phosphorylation and both endogenous and FGF18 induced MyoD expression is inhibited by U0126. Beads soaked in a retinoic acid antagonist can potentiate premature MyoD induction by FGF18.
This approach can be used with a wide range of different growth factors and inhibitors and is easily adapted to other tissues in the developing embryo.

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

הארכת חרוזים לפיתוח איברי העובר עוף לזהות מסלולי העברת אותות המשפיעים על ביטוי גנים

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Developmental Biology

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness following surgical intervention are key experimental strengths. Mica plates were the first barriers used to prevent chick limb bud initiation1. Protocols that use aluminum foil as an impermeable barrier to wing bud or leg bud induction and or initiation are described. We combine this technique with bead placement lateral to the barrier to exogenously supply candidate endogenous factors that have been blocked by the barrier. The results are analyzed using in situ hybridization of subsequent gene expression. Our main focus is on the role of retinoic acid signaling in the induction and later initiation of the chick embryo fore and hindlimb. We use BMS 493 (an inverse agonist of retinoic acid receptors (RAR)) soaked beads implanted in the lateral plate mesoderm (LPM) to mimic the effect of a barrier placed between the somites (a source of retinoic acid (RA)) and the LPM from which limb buds grow. Modified versions of these protocols could also be used to address other questions on the origin and timing of inductive cues. Provided the region of the chick embryo is accessible at the relevant developmental stage, a barrier could be placed between the two tissues and consequent changes in development studied. Examples may be found in the developing brain, axis extension and in organ development, such as liver or kidney induction.

Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

יישום של חסמים בלתי חדירים בשילוב עם חרוזים ספוגים פקטור מועמד ללמוד איתותי אינדוקטיבי של צ&#39;יק

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biology

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Assay עבור אינדוקציה עצבית בעובר צ&#39;יק

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Chicken Recombinant Limbs Assay to Understand Morphogenesis, Patterning, and Early Steps in Cell Differentiation

Cell differentiation is the fine-tuned process of cell commitment leading to the formation of different specialized cell types during the establishment of developing tissues and organs. This process is actively maintained in adulthood. Cell differentiation is an ongoing process during the development and homeostasis of organs. Understanding the early steps of cell differentiation is essential to know other complex processes such as morphogenesis. Thus, recombinant chicken limbs are an experimental model that allows the study of cell differentiation and pattern generation under embryonic patterning signals. This experimental model imitates an in vivo environment; it assembles reaggregated cells into an ectodermal cover obtained from an early limb bud. Later, ectoderms are transferred and implanted in a chick embryo receptor to allow its development. This assay was mainly used to evaluate mesodermal limb bud cells; however, it can be applied to other stem or progenitor cells from other organisms.

Recombinant limbs are a powerful experimental model that allows for studying the process of cell differentiation and the generation of patterns under the influence of embryonic signals. This protocol presents a detailed method for generating recombinant limbs with chicken limb-mesodermal cells, adaptable to other cell types obtained from different organisms.

גפיים רקומביננטיות של עוף בודקות כדי להבין את מורפוגנזה, דפוסים וצעדים מוקדמים בהתמיינות תאים

Cell differentiation is the fine-tuned process of cell commitment leading to the formation of different specialized cell types during the establishment of ...

Analysis of Cell Differentiation, Morphogenesis, and Patterning During Chicken Embryogenesis Using the Soaked-Bead Assay

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of somatic cells, tissues, and organs. The precise activation of these genetic programs is regulated by morphogens, diffusible molecules that direct cell fate at different thresholds. Understanding how genetic activation coordinates morphogenesis requires the study of local interactions triggered by morphogens during development. The use of beads soaked in proteins or drugs implanted into distinct regions of the embryo enables studying the role of specific molecules in the establishment of digits and other developmental processes. This experimental technique provides information on the control of cell induction, cell fate, and pattern formation. Thus, this soaked bead assay is an extremely powerful and valuable experimental tool applicable to other embryonic models.

The soaked bead assay involves targeted delivery of test reagent at any developmental time point to study the regulation of cell differentiation and morphogenesis. A detailed protocol, applicable to any experimental animal model, for preparing three different types of soaked beads and implanting these in the interdigit of a chicken embryo is presented.

ניתוח התמיינות תאים, מורפוגנזה ותבניות במהלך עוברי עוף באמצעות בדיקת החרוזים המושרים

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of ...

סקירה מקיפה של פרוטוקולי תרבית צמחילת עור עוברי בעופות

Using Avian Skin Explants to Study Tissue Patterning and Organogenesis

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin explant cultures to examine different aspects of skin development are described. First, ex vivo organ cultures and manipulations offer researchers opportunities to observe and study the development of feather buds directly. Skin explant culture can grow for 7 days enabling direct analysis of cellular behavior and 4D imaging at intervals during this growth period. This also allows for physical and molecular manipulations of culture conditions to visualize tissue response. For example, growth factor-coated beads can be applied locally to induce changes in feather patterning in a limited area. Alternatively, viral transduction can be delivered globally in the culture media to up or downregulate gene expression. Second, the skin recombination protocol allows researchers to investigate tissue interactions between the epidermis and mesenchyme that are derived from different skin regions, different life stages, or different species. This affords an opportunity to test the time window in which the epithelium is competent to respond to signals and its ability to form different skin appendages in response to signals from different mesenchymal sources. Third, skin reconstitution using dissociated dermal cells overlaid with intact epithelium resets skin development and enables the study of the initial processes of periodic patterning. This approach also enhances our ability to manipulate gene expression among the dissociated cells before creating the reconstituted skin explant. This paper provides the three culture protocols and exemplary experiments to demonstrate their utility.

מחבר זרקור: תובנה לגבי המתודולוגיות הניסיוניות הנוכחיות של צמחי עור העופות

Here we describe protocols for three types of avian embryonic skin explant cultures that can be used to examine tissue interactions, 4D imaging timelapse movie (3D plus time), global or local perturbation of molecular function, and systems biology characterization.

שימוש בעציצים מעור העופות לחקר תבניות רקמות ואורגנוגנזה

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin ...

בודק את התפקידים של הכוחות הפיזיקליים במערכת מורפוגנזה עובריים מוקדם של הבחורה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הארכת חרוזים לפיתוח איברי העובר עוף לזהות מסלולי העברת אותות המשפיעים על ביטוי גנים

יישום של חסמים בלתי חדירים בשילוב עם חרוזים ספוגים פקטור מועמד ללמוד איתותי אינדוקטיבי של צ'יק

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ'יק מוקדם

Assay עבור אינדוקציה עצבית בעובר צ'יק

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

גפיים רקומביננטיות של עוף בודקות כדי להבין את מורפוגנזה, דפוסים וצעדים מוקדמים בהתמיינות תאים

ניתוח התמיינות תאים, מורפוגנזה ותבניות במהלך עוברי עוף באמצעות בדיקת החרוזים המושרים

שימוש בעציצים מעור העופות לחקר תבניות רקמות ואורגנוגנזה

שימוש בעציצים מעור העופות לחקר תבניות רקמות ואורגנוגנזה

שימוש בעציצים מעור העופות לחקר תבניות רקמות ואורגנוגנזה