Name: rapid in vivo assessment of adjuvant's cytotoxic t lymphocytes generation capabilities for vaccine development
Uploaded: 2018-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development at JoVE.com

אנחנו חבים שלנו סגל: U. Bröder, ה Shkarlet, שעזר לנו במהלך הליכי ניסיוני. עבודה זו מומן בחלקו על ידי האיחוד האירופי (UniVax, חוזה מס 601738 ו- TRANSVAC2, חוזה מס 730964), ומענקים מענק האגודה הלמהולץ (חי-ד ר רודי). מקורות המימון לא להשפיע על המחקר, עיצוב, דור של כתב היד או להגיש את זה לפרסום.

כל העכברים השתמשו במחקר זה היו רקע C57BL/6. כל החיות הוחזקו בתנאים ללא הפתוגן. כל הניסויים בוצעו על פי נורמטיבית של החוק הגרמני להגנת בעלי חיים (TierSchG BGBl. אני S 1105; 25.05.1998), אושרו על ידי ועדת סקסוניה התחתונה על אתיקה לניסויים בבעלי חיים, משרדי המדינה (התחתון סקסוניה המדינה במשרד של הגנת הצרכן ובטיחות מזון), תחת מספר היתר 33.4-42502-04-13/1281 ו- 162280.
1. CFSE מכתים של OT-אני T תאים והעברת המאמצת
הערה: OT-אני עכברים הם חיות transgenically שנוצר המבטאים קולטן תא T (TCR) α קבוע, שרשראות β יחד לזהות את פפטיד חיסונית-הדומיננטי של ביצית, SIINFEKL10,11. כתוצאה מכך, עכברים אלה יש מספר גבוה במידה ניכרת של CD8 ספציפי SIINFEKL+ T תאים (97%)12 בהשוואה עכברים רגילים או חוסנו ביצית (≤ 1%)13.
<ol><li>בידוד של CD8 למעקב+ T תאים מחלון OT-אני עכברים מביע אלל לימפוציטים-T ספציפי Thy1 (Thy1.1):<ol>
<li>המתת חסד בת 6-9 שבועות OT-אני עכברים באמצעות אינהלציה2 CO ואחריו נקע בצוואר הרחם14. לנתח את הטחול ובלוטות הלימפה העיקרי (המפשעתית, בבית השחי, צוואר הרחם זוגות בלבד) על ידי חיתוך העור עם מספריים כירורגיים, ניתוק את העור מהגוף בעזרת צבת כירורגי, מלקחיים ומניחים פטרי (60 x 15 מ מ) המכילים כל אחד 100 מיקרומטר נקבובית גביע רשת לשחרור תא וליטוש רקמות.</li>
		<li>לשמור על צלחות פטרי (כל אחד עם רשת שינוי אחת גביע) ב- 3-5 מ ל בינונית RPMI מלאה (RPMI 1640, 10% v/v FCS, 100 פניצילין U/mL, סטרפטומיצין µg 50/mL) שמרה על קרח.</li>
		<li>מועכים את האיברים בעזרת פומפה מזרק או מכשיר דומה סטרילי (חיתוך מוקדמת לא נדרש) לאסוף את התליה תא בודד שנוצר צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל.</li>
		<li>Centrifuge התליה תא ב 300 גרם x 10 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע. לשטוף את התאים ב- 10 מ"ל של PBS קר על ידי צנטריפוגה ואת lyse של אריתרוציטים מן הטחול על ידי השעיית מחדש בגדר ב 1 mL/טחול מאגר אמוניום כלוריד (מאגר ACK, זמינים מסחרית). דגירה התאים 1.5 דקות בקרח, לאחר מכן לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS קר על ידי צנטריפוגה (כפי).</li>
		<li>מחדש להשעות את צניפה בצינור אותו ב 1 מ"ל של PBS (pH 7.2) המכילה 5% עוברית שור נסיוב לבידוד מגנטי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי לבצע בידוד מגנטי, להמשיך הבחירה שלילי של CD8+ T תאים באמצעות ערכת בידוד מגנטי בהתאם להוראות היצרן או לפרסם פרוטוקולים15.</li>
	<li>כדי לבצע CFSE מכתים, קודם לספור את מספר CD8+ T תאים המתקבל OT-אני עכברים באמצעות מונה הניתן תא אוטומטיות (מונה חלקיקים). כתם 1-5 x 107 תאים/מ ל נפח של 1-5 מ עם 5 מיקרומטר CFSE ב- PBS במשך 7 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור בצינור 15-ml בז.</li>
	<li>להרוות את ההכתמה CFSE על-ידי הוספת נפח זהה (1:1) סרום שור עוברית לתאי ולאחר תקופת דגירה אותם של נוספים 7 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור. לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS פעמיים.</li>
	<li>לספור את התאים באמצעות מונה הניתן תא אוטומטית. להגדיר את מספר תא ל 3-5 x 107 תאים למ"ל של PBS כדי להזריק 3-5 x 106 תאים/עכבר ב 100 µL דרך הווריד (עירוי) דרך הווריד של הזנב.</li>
	<li>כדי לבצע זריקות וריד הזנב, לשתק העכברים ב restrainers המתאים. לחמם את אזור הגב ואת הזנב של עכברים להיות מוזרק באמצעות מנורת אור אדום, בין 20-25 ס"מ מן העכברים למשך 1-3 דקות לאפשר התרחבות וריד הזנב. הערה: פעולה זו מסייעת להקל על הווריד זיהוי וניהול של התליה תא.</li>
	<li>להבטיח (עם היד ממוקם בין העכברים. ואת המנורה) שזה לא יותר מדי חם עבור העכברים והמשך כאשר העורקים הזנב נראה בבירור, הזרקת. להזריק את התאים לתוך הווריד של הזנב לרוחב או הגבי באמצעות על מזרק 1 מ"ל עם מחט בקוטר 2516.</li>
</ol>2. חיסונים (ללא אנדו פשוט + /-אדג'וונט)
<ol><li>הצב והעכברים מושתלים עם OT-תאי (שלב 1.7, איור 1) תא הרדמה ולפקח איזופלוריין חמצן על ידי מכונת הרדמה14.</li>
	<li>כאשר העכבר ישן לגמרי תחת הרדמה, להוציא את זה מהתא ולגלח את הפרווה של העכבר על האזור מעל העכוז השטחי (לרוחב הגב התחתון) באמצעות מכונת קיצוץ שיער חשמלי, על מנת לבצע זריקה נקי עם נוף יפה של האזור יישום.</li>
	<li>מזריקים µL 50 של החיסון, ספורטינג באזור מגולח באמצעות מחט 25-מד.</li>
</ol>3. בידוד של לימפוציטים, צביעת לניתוח Cytometry זרימה
<ol><li>בידוד של לימפוציטים, splenocytes<ol>
<li>המתת חסד העכברים לחסן באמצעות אינהלציה2 CO ואחריו נקע בצוואר הרחם.</li>
		<li>לחלץ את ניקוז ומרוחק הלימפה והטחול ומניחים נפרד פטרי המכילות 100 מיקרומטר נקבובית רשת כוסות לשחרור תא וליטוש רקמות. בצע את שלבים 1.1.2 דרך 1.1.3.</li>
		<li>Decant את תגובת שיקוע לאחר צנטריפוגה, מחדש להשעות את כדורי תאים באותו אמצעי אחסון של שריד PBS (כ- 100 µL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>צביעת לניתוח cytometry זרימה<ol>
<li>בשפופרת צנטרפוגה 15-mL להכין את תערובת הבסיס המכיל את הנוגדנים מכתימים בריכוזים מתואר טבלה 1, ובכך מניב 2 x מיקס מכתימים מרוכז. להכין כמות גדולה מספיק של מיקס מאסטר לי µL 100 לכל דגימה. לערבב את התאים ואת המיקס מאסטר 1:1, דגירה זה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הערה: אמצעי האחסון מכתימים הסופי עבור דגימה צריך להיות µL 200 (100 µL של התא µL צנפה +100 של מיקס מאסטר נוגדנים).</li>
		<li>לשטוף את התאים פעמיים על ידי צנטריפוגה כפי שמתואר 1.1.3, הוספת 10 מ"ל ל- PBS, פעמיים.</li>
		<li>מחדש להשעות את התאים ויטראז'ים ב 0.5-1 מ של PBS עבור הרכישה והעברת ההשעיה כדי זרימת cytometer צינורות. תמיד שומרים את הדגימות על קרח, מוגן מפני אור.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. דנ
<ol><li>תמיד לסנן מראש את דגימות תאים באמצעות 70-100 מיקרומטר מסננים.</li>
	<li>היכונו יחיד פקדים פיצוי מכתימים fluorophores מפורט בטבלה 1 (חרוזים או תאים). הערה: הפיצוי צריך להיות הופיעה cytometer או ניתוח תוכנה17,18,19 וחלים עליהם כל הדגימות.</li>
	<li>בצע את האסטרטגיה המגביל מתואר באיור2. בקצרה, שער אוכלוסיות פיזור קדימה גובה לעומת אזור פיזור קדמי (איור 2 א), ושוב לצד פיזור רחב לעומת פיזור מצידו (הסוכן המיוחד, איור 2B) כדי לא לכלול doublets.</li>
	<li>שער האוכלוסייה מ 2B איור על ידי התוויית BV 650 (auto-זריחה) לעומת FITC (CFSE) כדי להפלות CFSE נכון מוכתם תאים מתאי אוטומטי-פלורסנט גבוהה. כולל חרוזים או תאים צבעונית עם נוגדן מצומדת אל BV 650 לפקדי פיצוי. זו עלילה (איור 2C) של 650 BV לעומת FITC משמש לשער בשטחים הכבושים-אני CFSE צבעונית תאים.</li>
	<li>שער האוכלוסייה מאיור 2 C עבור Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) לעומת APC (CD8) כדי להבחין בין תאים שמקורם התורם לעומת עכברים הנמען. הערה: תאים שמקורם בתנ ך-אני תורם עכברים הם Thy1.1+ (CD90.1), ואילו (C57BL/6, הנמען) תאים WT נגזר עכברים הם Thy1.2+ (CD90.2) (איור דו-ממדי). יש כמה מעבדות OT-אני עכברים Thy1.2 רקע, WT (C57BL/6) ב- Thy1.1. במקרה זה אתה חייב להשתמש נוגדן נגד Thy1.2 OT-אני תא gating.</li>
	<li>מחדש שער CD8+ תאים Thy1.1+ אוכלוסייה על-ידי התוויית אותה על שער הכוללת BV 450 (CD4) לעומת APC (CD8) (2E איור).</li>
	<li>להציג את האוכלוסייה מגודרת ב איור 2E באמצעות תצוגה היסטוגרמה של CD8+ תאים מציג CFSE (FITC, ערוץ 530/15 - לייזר כחול-), שער האוכלוסייה proliferated על-ידי הכללת בעוצמות מ-102 עד רמת איפה השליטה המלאה שאוכלוסיות (עוצמות ~ 105, בהתאם היעילות של ההכתמה CFSE וההגדרה מתח על cytometer הזרימה) (איור 2F).</li>
	<li>לעשות שער נוסף (לא מוצג באיור 2) ההתוויה FITC לעומת L/D סמן (450/20 ערוצים, UV לייזר) על מנת להעריך תאים מתים במקביל הערכת התפשטות.</li>
	<li>רוכשים אירועים לפחות 5000 עבור הפקדים פיצוי ואירועים 10.000 (שער E, איור 2) מדגימות ב cytometer זרימה. הפעל את cytometer בעת זרימה נמוכה או בינונית (לא יעלה על המחירים זרימה של 20.000 אירועים/s).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Krishna, S., Anderson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+Epitope+Discovery+for+Therapeutic+Cancer+Vaccines.">T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines.</a> Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).</li><li>Pinchuk, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD8++T+cell+heptaepitope+minigene+vaccine+induces+protective+immunity+against+Chlamydia+pneumoniae.">A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae.</a> Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).</li><li>Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonates+mount+robust+and+protective+adult-like+CD8(+)-T-cell+responses+to+DNA+vaccines.">Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines.</a> Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).</li><li>Marchant, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+CD8(+)+T+lymphocyte+response+to+viral+infection+during+fetal+life.">Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life.</a> J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).</li><li>Simmons, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+delivery+of+a+respiratory+syncytial+virus+CTL+peptide+with+enterotoxin-based+adjuvants+elicits+protective,+immunopathogenic,+and+immunoregulatory+antiviral+CD8++T+cell+responses.">Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses.</a> Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).</li><li>Fulginiti, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+Virus+Immunizationa+Field+Trial+Of+Two+Inactivated+Respiratory+Virus+Vaccines;+An+Aqueous+Trivalent+Paratnfluenza+Virus+Vaccine+And+An+Alum-Precipitated+Respiratory+Syncytial+Virus+Vaccine1.">Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1.</a> American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).</li><li>Olson, M. R., Varga, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cells+inhibit+respiratory+syncytial+virus+(RSV)+vaccine-enhanced+disease.">CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease.</a> Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).</li><li>Lirussi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+IFN+and+not+TNF,+is+Essential+for+Cyclic+Di-nucleotide-elicited+CTL+by+a+Cytosolic+Cross-presentation+Pathway.">Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway.</a> EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).</li><li>Ebensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bis-(3',5')-cyclic+dimeric+adenosine+monophosphate:+strong+Th1/Th2/Th17+promoting+mucosal+adjuvant.">Bis-(3',5')-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant.</a> Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).</li><li>Hogquist, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection.">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76, 17-27 (1994).</li><li>Clarke, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+ovalbumin-specific+TCR+transgenic+line+OT-I:+MHC+elements+for+positive+and+negative+selection.">Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection.</a> Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).</li><li>Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+antigen+in+the+localization+of+naive,+acutely+activated,+and+memory+CD8(+)+T+cells+to+the+lung+during+influenza+pneumonia.">The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia.</a> Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).</li><li>Le Bon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-priming+of+CD8++T+cells+stimulated+by+virus-induced+type+I+interferon.">Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon.</a> Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).</li><li>Otto, K., Bullock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Laboratory Mouse. , 555-569 (2004).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Activation+of+Murine+Lymphocytes.">Isolation and Activation of Murine Lymphocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , (2016).</li><li>Shimizu, S., Bullock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Laboratory Mouse. , 527-542 (2004).</li><li>Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+human+dendritic+cell+progenitors+by+multiparametric+flow+cytometry.">Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry.</a> Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).</li><li>Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -. H., Sanz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+Flow+Cytometry+and+Bioanalytics+for+B+Cell+Profiling+in+Systemic+Lupus+Erythematosus.">Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus.</a> Methods in molecular biology. 900, 109-134 (2012).</li><li>Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+workshop+on+fluorescence+compensation+settings+in+multicolor+flow+cytometry.">Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry.</a> Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).</li><li>Newrzela, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+receptor+diversity+prevents+T-cell+lymphoma+development.">T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development.</a> Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).</li><li>Iwasaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergen+endotoxins+induce+T-cell-dependent+and+non-IgE-mediated+nasal+hypersensitivity+in+mice.">Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice.</a> J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).</li><li>Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+LPS+in+OVA+inhalations+affects+airway+inflammation+and+AHR+but+not+remodeling+in+a+rodent+model+of+asthma.+American+journal+of+physiology.">The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology.</a> Lung cellular and molecular physiology. , L54-L63 (2012).</li><li>Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+mechanistic+separation+of+cross-presentation+and+endogenous+antigen+presentation.">Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation.</a> Nature. 9, 558-566 (2008).</li><li>Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+lymphocyte+proliferation:+CFSE+kills+dividing+cells+and+modulates+expression+of+activation+markers.">Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers.</a> Cellular immunology. , 79-85 (2009).</li><li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+CD8(+)+antigen-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+after+enrichment+based+on+cytokine+secretion:+comparison+with+the+MHC-tetramer+technology.">Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology.</a> Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).</li><li>Wang, W., Golding, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytotoxic+T+lymphocyte+response+against+a+protein+antigen+does+not+decrease+the+antibody+response+to+that+antigen+although+antigen-pulsed+B+cells+can+be+targets.">The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets.</a> Immunology letters. 100, 195-201 (2005).</li><li>O'Sullivan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+CD8(+)+T+cells+use+cell-intrinsic+lipolysis+to+support+the+metabolic+programming+necessary+for+development.">Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development.</a> Immunity. 41, 75-88 (2014).</li><li>Xu, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+interferon+protects+antiviral+CD8++T+cells+from+NK+cell+cytotoxicity.">Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity.</a> Immunity. 40, 949-960 (2014).</li><li>Volk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+humanized+mouse+models+for+adoptive+T+cell+transfer.">Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer.</a> The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).</li><li>Safinia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+Mice+as+Preclinical+Models+in+Transplantation.">Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation.</a> Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).</li><li>Grover, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+NOG+mice+as+a+model+for+tuberculosis+vaccine-induced+immunity:+a+comparative+analysis+with+the+mouse+and+guinea+pig+models+of+tuberculosis.">Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis.</a> Immunology. 152, 150-162 (2017).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

חיסונים מודרניים הם אידיאלי composedof אנטיגן מטוהרים adjuvants, עם תוספת אפשרית של מערכת המסירה כמו ליפוזומים, חלקיקים דמויי וירוס, חלקיקים או וקטורים בשידור חי. היבט מרכזי בעת עיצוב חיסון היא לבחור את אדג'וונט הנכון בהתאם לצרכים קליניים. חלק הטווח עשוי להיות כרוך העדפה ההורמונאלית לעומת התגובה ה?...

לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות (CTL) גרימת חיסונים הם המפתח התערבויות טיפוליות אשר פותחו כדי להילחם סוגים מסוימים של סרטן1. CTL חשובים גם עבור חיסונים מניעתי נגד פתוגנים תאיים2. יתר על כן, CTL הם אחד כמה המערכת החיסונית מנגנוני ההגנה באופן פונקציונלי פעיל בקרב אוכלוסיות סיכון כגון neonates3,4 למי גם תלוי CTL להילחם זיהומים בתחילת החיים5. בהקשר זה, חיסונים נגד הנשימה Syncytial וירוס (RSV) שפותחו עם אדג'וונט זה לא זכה CTL תגובות (אלום) הביא כישלון מוחלט של החיסון המוביל לסיבוכים רציניים על זיהומים אצל תינוקות6. אלה תופעות שליליות של החיסון יכול להיות הפוך על ידי CD8+ תא T בתגובה7. בעבר הראו כי ציטוקינים הראשי (מסוג האינטרפרונים) שהפיק קצת ממריץ של אינטרפרון גנים (סטינג) אגוניסטים חיוניים התגובות CTL שנוצרו על-ידי אלה adjuvants8, בין השאר על ידי מדידת התפשטות OT-אני T תאים לאחר חיסון ושימוש תוצאות אלו כפי מידת CTL גרימת יכולות שנצפתה מורחב לוחות זמנים חיסון9. מידת ההתפשטות של OT-אני CD8+ T תאי עכבר הנמען של C57BL/6 פראי סוג (WT) על ידי carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE) לצבוע הדילול הוא שערוך חזקים של יכולות אדג'וונט של חיסון כדי ליצור קרוס-לקרקע של SIINFEKL, (פפטיד חיסונית-הדומיננטי של אובלבומין, ביצית). וריאציות של טכניקה זו נמצאים בשימוש נרחב עבור ההערכה של התפשטות OT-אני CD8+ ו CD4 OT-II+ T תאים. לדוגמה, שהשתמשו בה בהיעדרו של ציטוקינים שנבחר (KO עכברים) או כדי למדוד את יעילות החיסון לאחר אנטיגן האחזור ב WT בעלי חיים. אנחנו בדימיון פרוטוקול קצר (4 ימים הניסוי) שבו לאחר העברה פסיבית של שהוכתמו CFSE OT-אני CD8+ T תאים, של חיסונים (ש) תת עורית בהיקף של מנה אחת של 50 µg של ביצית ללא אנדוטוקסין בתוספת מבחן adjuvants מנוהל (איור 1). בצע את התוצאות 48 שעות לאחר החיסון מספק הוכחה אמינה של הקיבולת של אדג'וונט ליצירת רשימת אישורים אמינים תגובות. על ידי אסטרטגיה זו, זה אפשרי להעריך את עוצמת התגובה החיסונית המקומית הצומת לימפה המנקזים לאחר חיסון, כמו גם היקף התגובה על ידי מדידת הפעילות CTL הטחול (או מרוחק בלוטות הלימפה).

<table><tbody><tr><td>BD LSR Fortessa Cell Analyzer</td><td>BD</td><td>Special Order</td><td>Flow Cytometer</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Molecular Probes</td><td>C34554</td><td>Proliferation Dye</td></tr><tr><td>MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit</td><td>Biolegend</td><td>480007</td><td>Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells.</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td><td>Molecular Probes</td><td>L23105</td><td>Dead Cell Marker</td></tr><tr><td>CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-0900-82</td><td>antibody</td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD8a Antibody</td><td>BioLegend</td><td>100712</td><td>antibody</td></tr><tr><td>BV421 Rat Anti-Mouse CD4</td><td>BD</td><td>740007</td><td>antibody</td></tr><tr><td>Z2 coulter Particle count and Size Analyzer</td><td>Beckman Coulter</td><td>9914591DA</td><td>Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter</td></tr><tr><td>EndoGrade Ovalbumin (10 mg)</td><td>Hyglos(Germany)</td><td>321000</td><td>Ovalbumin endotoxin free tested.</td></tr><tr><td>Cell Strainer 100&amp;micro;m nylon</td><td>Corning</td><td>352360</td><td>Cell strainer (100 &amp;micro;m pore mesh cups).</td></tr><tr><td>Sample Vials</td><td>Beckman Coulter</td><td>899366014</td><td>Sample vials for Z2 automated counter</td></tr><tr><td>C57BL/6 mice (CD90.2)</td><td>Harlan (Rossdorf, Germany)</td><td></td><td>Company is now Envigo</td></tr><tr><td>OT-I (C57BL/6 background, CD90.1)</td><td>Harlan (Rossdorf, Germany)</td><td></td><td>Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo</td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>Fischer (Corning)</td><td>14-959-5</td><td>Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL tubes</td><td>Fischer (Corning)</td><td>05-527-90</td><td>Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td></tr><tr><td>PBS (500 mL)</td><td>Fischer (Gibco)</td><td>20-012-027</td><td>Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2</td></tr><tr><td>Red lamp (heating lamp)</td><td>Dirk Rossmann GmbH (Germany)</td><td>405096</td><td>Heating infrred lamp (100 wats)</td></tr><tr><td>IsoFlo (Isoflurane)</td><td>Abbott Laboratories (USA)</td><td>5260.04-05.</td><td>Isoflurane anesthesic (250 mL flask).</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber&lt;/strong&gt;</td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000PK</td><td>Isoflurane anesthesia machine.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td><td>11-875-093</td><td>Base medium with Glutamine (500 mL)</td></tr><tr><td>Pen-Strept antibiotic solution (Gibco)</td><td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td><td>15-140-148</td><td>Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td></tr><tr><td>Fetal Bobine Serum (Gibco)</td><td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td><td>10082147</td><td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer (100 ml)</td><td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td><td>A1049201</td><td>Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also</td></tr><tr><td>Plastic Petri Dishes</td><td>Nunc (distributed by ThermoFischer)</td><td>150340</td><td>60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated</td></tr><tr><td>Cell Clump Filter</td><td>CellTrics (Sysmex)</td><td>04-004-2317</td><td>CellTrics&amp;reg; 50 &amp;mu;m, sterile</td></tr></tbody></table>

rapid in vivo assessment of adjuvant's cytotoxic t lymphocytes generation capabilities for vaccine development

ההערכה של יחידת המשנה מודרני חיסונים מגלה כי הדור של נטרול נוגדנים היא חשובה אך אינה מספקת עבור אדג'וונט הבחירה. לכן, adjuvants עם יכולות חיסונית-מופחתים ההורמונאלית והן הסלולר מסוגלים לקדם ציטוטוקסיים התגובות לימפוציטים (CTL) T נחוצים בדחיפות. לפיכך, ניטור נאמן של מועמדים אדג'וונט זירוז קרוס-לקרקע ולשפר לאחר מכן CTL דור מייצג שלב חיוני בפיתוח החיסון. כאן אנו מציגים יישום שיטה המשתמשת SIINFEKL ספציפיים (OT-אני) ותאי T כדי לפקח על הצלב-המצגת של ה הדגם אנטיגן אובלבומין (פשוט) ויוו בנוכחות המועמדים אדג'וונט שונים. שיטה זו מייצגת בדיקה מהירה כדי לבחור adjuvants עם היכולות קרוס-לקרקע הטוב ביותר. ההתפשטות של CD8+ T תאים הסימן החשוב ביותר של צלב-לקרקע, זה גם נחשב לתאם אדג'וונט-induced קרוס-מצגת. תכונה זו ניתן להעריך באיברים חיסוניים שונים כמו הלימפה והטחול. היקף הדור CTL יכול גם להיות במעקב, ובכך לתת תובנות על טבע מקומי (ניקוז הלימפה בעיקר) או תגובה מערכתית (בלוטות הלימפה רחוק ו/או הטחול). טכניקה זו נוסף מאפשר שינויים מרובים עבור בדיקות סמים יכול לעכב מסלולים קרוס-מצגת מסוימת, מציעה גם את האפשרות שישמש זנים שונים של עכברים מהונדסים קונבנציונאלי. לסיכום, היישום אנחנו מציגים כאן יהיה שימושי עבור מעבדות חיסון תעשייה או אקדמיה לפתח או שינוי כימי adjuvants חיסון למחקר ופיתוח.

על מנת לבדוק את הטיפולים באמצעות שילוב שונה של adjuvants (ADJ1 ו- ADJ2), אנחנו שהערכת את קיבולת דור CTL על ידי מדידת התפשטות הועבר adoptively OT-אני CD8+ T תאים על-ידי cytometry זרימה (איור 2). בשביל זה, אנחנו קודם לכן מוכתם תאים מבודדים ניקוז הלימפה והטחול (טבלה 1). על י...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development at JoVE.com

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

אנו מציגים כאן יישום טכניקה סטנדרטית אימונולוגי (CFSE צבעונית OT-אני התפשטות) נועד לפקח במהירות בתיווך אדג'וונט ציטוטוקסיות לימפוציטים-T (CTL) דור ויוו. זו הערכה מהירה של CTL קיבולות שימושית עבור פיתוח חיסונים מניעתי נגד פתוגנים תאיים, כמו גם חיסונים נוגדי סרטן טיפולית.

מהירה In Vivo ובחינת יכולות הדור של לימפוציטים T ציטוטוקסיות של אדג'וונט לפיתוח חיסון

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

rapid-vivo-assessment-adjuvant-s-cytotoxic-t-lymphocytes-generation

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

8.6K Views.  Helmholtz Centre for Infection Research. אנו מציגים כאן יישום טכניקה סטנדרטית אימונולוגי (CFSE צבעונית OT-אני התפשטות) נועד לפקח במהירות בתיווך אדג'וונט ציטוטוקסיות לימפוציטים-T (CTL) דור ויוו. זו הערכה מהירה של CTL קיבולות שימושית עבור פיתוח חיסונים מניעתי נגד פתוגנים תאיים, כמו גם חיסונים נוגדי סרטן טי?...

Video: Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

במבחנה Assay כדי להעריך את ההשפעה של immunoregulatory מסלולים על פונקצית Effector הנייד HIV-ספציפית T מסוג CD4

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Immunology and Infection

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

השימוש במערכי יעד פלורסנט להערכה של תגובות תא T<em&gt; בvivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

טכניקות הדמיה כל-החיה והזרימה Cytometric לתגובות ניתוח של אנטיגן ספציפי CD8 + T תא לאחר Nanoparticle חיסון

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

אין ויוו Assay גילוי של הפונקציה Cytolytic תא T אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we investigated immunological effects of a novel lipid-DNA immunostimulant in nanoparticle form from different administration routes in the mouse: oral, intranasal, subcutaneous, footpad, intraperitoneal, and intravenous. These injections will directly influence the immune response, and harvesting lymphatic tissues and analysis of dendritic cell (DC) activation in the tissues are crucial parts of these evaluations. The extraction of mediastinal lymph nodes (mLNs) is important but quite complex because of the size and location of this organ. A stepwise procedure for harvesting the inguinal lymph node (iLN), mLN, and spleen and analyzing DC activation by flow cytometry is described.

Experimental procedures for the subsequent extraction of lymphatic tissues to test lymphoid dendritic cell activation are described after treatment of an immunostimulating nanomaterial.

Immunostimulatory הסוכן הערכה: הלימפה רקמות החילוץ, הזרקת תא דנדריטי תלויי-נתיב ההפעלה

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

תפירה Vivo ציטורעילות Assays ללמוד אימונומימינינס ב-CD8 התגובות הספציפיות לגידול של תאים

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

Epitope peptides have attracted widespread attention in the field of tumor vaccines because of their safety, high specificity, and convenient production; in particular, some MHC I-restricted epitopes can induce effective cytotoxic T lymphocyte activity to clear tumor cells. Additionally, nasal administration is an effective and safe delivery technique for tumor vaccines due to its convenience and improved patient compliance. However, epitope peptides are unsuitable for nasal delivery because of their poor immunogenicity and lack of delivery efficiency. Nanoemulsions (NEs) are thermodynamically stable systems that can be loaded with antigens and delivered directly to the nasal mucosal surface. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) is the core pentapeptide of laminin, an integrin-binding peptide expressed by human respiratory epithelial cells. In this study, an intranasal self-assembled epitope peptide NE tumor vaccine containing the synthetic peptide IKVAV-OVA257-264 (I-OVA) was prepared by a low-energy emulsification method. The combination of IKVAV and OVA257-264 can enhance antigen uptake by nasal mucosal epithelial cells. Here, we establish a protocol to study the physicochemical characteristics by transmission electron microscopy (TEM), atomic force microscopy (AFM), and dynamic light scattering (DLS); stability in the presence of mucin protein; toxicity by examining the cell viability of BEAS-2B cells and the nasal and lung tissues of C57BL/6 mice; cellular uptake by confocal laser scanning microscopy (CLSM); release profiles by imaging small animals in vivo; and the protective and therapeutic effect of the vaccine by using an E.G7 tumor-bearing model. We anticipate that the protocol will provide technical and theoretical clues for the future development of novel T cell epitope peptide mucosal vaccines.

Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

Here, we present detailed methods for the preparation and evaluation of the nasal self-assembled nanoemulsion tumor vaccine in vitro and in vivo.

הכנה, מאפיינים, רעילות והערכת יעילות של החיסון לגידול ננו-תחליב באף בהרכבה עצמית במבחנה וב-Vivo

Epitope peptides have attracted widespread attention in the field of tumor vaccines because of their safety, high specificity, and convenient production; ...

In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

As a principal ingredient of vaccines, adjuvants can directly induce or enhance the powerful, widespread, innate, and adaptive immune responses associated with antigens. Ophiopogonin D (OP-D), a purified component extracted from the plant Ophiopogon japonicus, has been found to be useful as a vaccine adjuvant. The problems of the low solubility and toxicity of OP-D can be effectively overcome by using a low-energy emulsification method to prepare nanoemulsion ophiopogonin D (NOD). In this article, a series of in vitro protocols for cellular activity evaluation are examined. The cytotoxic effects of L929 were determined using a cell counting kit-8 assay. Then, the secreted cytokine levels and corresponding immune cell numbers after the stimulation and culture of splenocytes from immunized mice were detected by ELISA and ELISpot methods. In addition, the antigen uptake ability in bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs), which were isolated from C57BL/6 mice and matured after incubation with GM-CSF plus IL-4, was observed by laser scanning confocal microscopy (CLSM). Importantly, macrophage activation was confirmed by measuring the levels of IL-1&#946;, IL-6, and tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) cytokines by ELISA kits after coculturing peritoneal macrophages (PMs) from blank mice with the adjuvant for 24 h. It is hoped that this protocol will provide other researchers with direct and effective experimental approaches to evaluate the cellular response efficacies of novel vaccine adjuvants.

In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

The protocol presents detailed methods for evaluating whether the nanoemulsion ophiopogonin D adjuvant promotes effective cellular immune responses.

במבחנה הערכת פעילות תאית של חיסון ננו-אמולסיה אדג'ובנט אופיופוגונין D

As a principal ingredient of vaccines, adjuvants can directly induce or enhance the powerful, widespread, innate, and adaptive immune responses associated ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and play a unique role within the immune system by linking the innate and adaptive immune responses. These cells can phagocytize and then present captured antigens to effector immune cells, triggering a diverse range of immune responses. This paper demonstrates a standardized method for the in vitro generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) isolated from cattle peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and their application in evaluating vaccine immunogenicity.
Magnetic-based cell sorting was used to isolate CD14+ monocytes from PBMCs, and the supplementation of complete culture medium with interleukin (IL)-4 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) was used to induce the differentiation of CD14+ monocytes into naive MoDCs. The generation of immature MoDCs was confirmed by detecting the expression of major histocompatibility complex II (MHC II), CD86, and CD40 cell surface markers. A commercially available rabies vaccine was used to pulse the immature MoDCs, which were subsequently co-cultured with naive lymphocytes.
The flow cytometry analysis of the antigen-pulsed MoDCs and lymphocyte co-culture revealed the stimulation of T lymphocyte proliferation through the expression of Ki-67, CD25, CD4, and CD8 markers. The analysis of the mRNA expression of IFN-&#947; and Ki-67, using quantitative PCR, showed that the MoDCs could induce the antigen-specific priming of lymphocytes in this in vitro co-culture system. Furthermore, IFN-&#947; secretion assessed using ELISA showed a significantly higher titer (**p &#60; 0.01) in the rabies vaccine-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture than in the non-antigen-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture. These results show the validity of this in vitro MoDC assay to measure vaccine immunogenicity, meaning this assay can be used to identify potential vaccine candidates for cattle before proceeding with in vivo trials, as well as in vaccine immunogenicity assessments of commercial vaccines.

The methodology describes the generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) and their application for the in vitro evaluation of antigenic candidates during the development of potential veterinary vaccines in cattle.

קביעת אימונוגניות החיסון באמצעות תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים של בקר

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...

An Immunological Technique to Monitor Adjuvant-Mediated Cytotoxic T Lymphocyte Generation

Source: Lirussi, D. et al., <a href="https://app.jove.com/v/57401">Rapid In Vivo&#160;Assessment of Adjuvant&#39;s Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The video demonstrates an immunological method to monitor in vivo adjuvant-induced cytotoxic T lymphocyte or CTL production. A mouse is pre-injected with genetically engineered, proliferative dye-stained donor CD8+ T lymphocytes. Subcutaneous injection of ovalbumin with adjuvants generates cytotoxic CD8+ T lymphocytes that are identified post-harvesting through immunostaining and flow cytometry.

טכניקה אימונולוגית לניטור יצירת לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T בתיווך אדג'ובנטי

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
All mice ...

מהירה In Vivo ובחינת יכולות הדור של לימפוציטים T ציטוטוקסיות של אדג'וונט לפיתוח חיסון

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST