המחברים הכריזו אין ניגוד אינטרסים.

פרוטוקול הכולל דורש 2 ימים, כולל ביום הראשון של אלח דם אינדוקציה ובידוד של נוזל BAL החיה, ביום השני exosomes בידוד מן העכבר BALF. כל ההליכים נבדקו ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה ב אטלנטה VA medical center.
1. עכבר ריאות זיהומית חריפה פציעה מודל
<ol><li>להשתמש 6-8 שבועות - בן זכר פראי-סוג C57BL/6J עכברים (משקל 20-22 גרם) לבעל החיים מודל, ולבצע כל ההליכים באמצעות טכניקות aseptic וכלי נגינה. אוטוקלב כל מכשירי ניתוח, כולל מלקחיים ומספריים במשך 20 דקות-121 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>באופן אקראי להפיץ עכברים לתוך ניסיוני, קבוצת הביקורת. לרסן עכברים על לוח כירורגי. לטפל עכברים עם ליפופוליסכריד Escherichia coli (LPS, 15 מ"ג/ק"ג) על ידי תוואי בקרום הבטן. לפי משקל גוף פרטי, לדלל במינונים המתאימים LPS עד 0.1 מ"ל PBS לכל בעכבר, ואז הזרקת LPS הפתרון באמצעות מזרק 1 מ"ל עם המחט 27 G ולהזריק אמצעי שוות ערך ל- PBS לבעלי שליטה.</li>
	<li>שמור עכברים המתקן BSL2 בבעלי חיים, אשר מורכב של הכלובים נקיים בטמפרטורת החדר המתאים.</li>
	<li>24 שעות לאחר מכן, המתת חסד עכברים עם שאיפת2 CO.</li>
	<li>בחר את האזור הכירורגי במרכז הצוואר העכבר. עושים חתך קטן (כ 5 מ מ), ולהפריד בעדינות שרירים עבור גישה לקנה הנשימה באמצעות מלקחיים בוטה עד קנה הנשימה הוא חשוף.</li>
	<li>תיסוג העכבר נוזל בל עם מזרק סטרילי 10 מ"ל עם מחט 27 גרם. ראשית, בעדינות, את המחט לתוך קנה הנשימה, להזריק 1 מ"ל של PBS סטרילי לאט לתוך קנה הנשימה, לאחר מכן צייר BALF לתוך מזרק חד פעמיות 3 מ עם מחט 27 G. עם סיום ההליך, תשליך מזרקים ומחטים במיכל שרפ חומרים מסוכנים.</li>
	<li>לטיפול כירורגי מכשירים עם כלור דיאוקסיד, כפי שתואר קודם לכן על ידי. Chauret et al. 27, ולחטא ואז כל מכשירי ניתוח על-ידי autoclaving עבור 20 דקות-121 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>2. Exosomes בידוד-סדרתי אולטרה-צנטריפוגה ואפיון
<ol><li>לאסוף את העכבר BAL נוזל צינורות חרוט 15 מ"ל. הקציר תאים מכתשי, צנטריפוגה דגימות 10 דקות ב g 1,000, ב 4 º C.</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע צינורות חרוט 15 mL החדש, ואז צנטריפוגה דגימות למשך 30 דקות ב g x 4,000 ב 4 ° C כדי להסיר שאריות תאים.</li>
	<li>לאסוף את תגובת שיקוע של צינורות ultracentrifuge ודוגמאות צנטריפוגה עבור 60 דקות ב g x 10,000 ב 4 ° C כדי להסיר חלקיקים גדולים יותר הסלולר.</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע צינורות חרוט החדש ולאחר מכן לסנן את הדגימות דרך 0.2 µm מזרק-מסנן כדי להסיר נותרו חלקיקים גדולים יותר.</li>
	<li>לאסוף דגימות ultracentrifuge צינורות, ולאיזון צינורות. צנטריפוגה הדוגמאות עבור 2 h ב g x 140,000-4° C עד הצניפה את exosomes. הערה: גודל exosomes משתנה 20-200 ננומטר. 0.2 µm הסינון משמש עבור הסרת חלקיקים גדולים יותר כי הם יותר מ-200 nm, בגודלה.</li>
	<li>למחוק את supernatants בעדינות. להמיס את גלולה עם 100 µL PBS או פירוק פתרון, העברת דגימות exosomes 1.5 mL צינורות, לאחסן ב- 80 ° C עד השימוש. הערה: מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים מומלץ לוודא exosomes מבודדים.</li>
	<li>בצע את הדגימה TEM תקן עיבוד פרוטוקול28. לנתח דגימות exosomes באמצעות סרגל במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, וכן לקחת תמונות, בר 200 ננומטר.</li>
</ol>3. הכנת miRNA, הבמה miRNA-q-RT-PCR
הערה: miRNA-q-RT-PCR מומלץ לנתח את רמת הביטוי miRNAs.
<ol><li>בצע miRNAs רגיל בידוד פרוטוקול, הקפד להשתמש כמות שווה של RNAs מטוהרים שעתוק במהופך יחיד-strand24.</li>
	<li>בצע את הפרוטוקול הסטנדרטי PCR בזמן אמת לגילוי רמת microRNA exosomal בנוזל BAL. שימוש ספציפי בזמן אמת PCR primers נגד מיר-155, מיר-146a ו- U6 SnRNA. להפעיל את תגובת ה-PCR עם מנגנון ה-PCR כמותי, לנרמל את הערכים בביטוי snRNA בקרה פנימית U6. הערה: כל קבוצה מורכבת מדגמים triplicate24.</li>
</ol>4. Exosomes תיוג וטיהור
<ol><li>להשעות exosomes גלולה עם פתרון הבולם µL 100 1.5 mL צינור פוליפרופילן, ולאחר מכן להוסיף µL 0.4 של לצבוע exosomes לתוך הצינור השני עם µL 100 של הפתרון ההשעיה.</li>
	<li>. ובמהירות להוסיף exosomes בפתרון הפתרון לצבוע לערבב ביסודיות על ידי pipetting לשמור דגימות עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, להגן מפני אור.</li>
	<li>מכניסים עמודה אחת של ספין exosome צינור • תנאי 1.5 mL. להעביר את התערובת פתרון המרכז של העמודה ספין exosome.</li>
	<li>לסובב את העמודה למשך 2 דקות ב g x 800 בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>למחוק את העמודה ולאחסן את הדגימה eluted ב-20 ° C עד השימוש.</li>
</ol>5. אימות של Up Exosomes נלקחה על ידי תאים הנמען
<ol><li>זרע עונה 1 פרק 104 MLE 12 /cell של שקופיות הקאמרית 8-ובכן, ואת התרבות תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.</li>
	<li>להוסיף 10 µL התווית על-ידי פלורסנט exosomes התאים. תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להסיר את תרבות המדיה, לשטוף תאים עם PBS, לאחר מכן לתקן תאים עם 1% paraformaldehyde במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>טעינת השקופית הר בינוני עם דאפי.</li>
	<li>לנתח דגימות דרך מיקרוסקופ פלורסצנטיות, תמונות, 40 X הגדלה.</li>
</ol>6. אימות של האינטראקציה בין Exosomes לבין תאים הנמען
<ol><li>זרע 2 x 105 MLE12/טוב בצלחת 12-ובכן תרבות המכילות בינוני תרבות המתאים, ואת התרבות תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.</li>
	<li>להוסיף 20 µg exosomes מן העכבר BAL נוזל לתאים MLE12 ולהגדיר משכפל לכל קבוצה ניסיונית.</li>
	<li>24 שעות מאוחר יותר, לשטוף תאים עם PBS ולהוסיף 600 µL פירוק מאגר לבאר. בעדינות לנער את הצלחת ולאסוף דגימות פירוק בצינור 1.5 mL עם פיפטה.</li>
	<li>בצע את פרוטוקול RNA בידוד מוחלט תקני ופרוטוקול שעתוק במהופך cDNA, להשלים שעתוק במהופך יחיד-strand cDNA29.</li>
	<li>בצע את הפרוטוקול הסטנדרטי PCR בזמן אמת כדי לזהות רמת ביטוי mRNA תאי הנמען29. שימוש ספציפי בזמן אמת PCR primers נגד TNF-α, IL-6 וזואי-1. הפעל את תגובות PCR עם מנגנון ה-PCR כמותי, לנרמל את הערכים בביטוי בפקד פנימי GAPDH. הערה: כל קבוצה מורכבת מדגמים triplicate.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rubenfeld, G. D., Herridge, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+outcomes+of+acute+lung+injury.">Epidemiology and outcomes of acute lung injury.</a> Chest. 131, 554-562 (2007).</li><li>Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+manipulated+mouse+models+of+lung+disease:+potential+and+pitfalls.">Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L485-L497 (2012).</li><li>Han, S., Mallampalli, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+respiratory+distress+syndrome:+from+mechanism+to+translation.">The acute respiratory distress syndrome: from mechanism to translation.</a> Journal of immunology. , 855-860 (1950).</li><li>Aeffner, F., Bolon, B., Davis, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Acute+Respiratory+Distress+Syndrome:+A+Review+of+Analytical+Approaches,+Pathologic+Features,+and+Common+Measurements.">Mouse Models of Acute Respiratory Distress Syndrome: A Review of Analytical Approaches, Pathologic Features, and Common Measurements.</a> Toxicologic pathology. 43, 1074-1092 (2015).</li><li>Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+acute+lung+injury.">Animal models of acute lung injury.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L379-L399 (2008).</li><li>Terrasini, N., Lionetti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+Critical+Illness.">Exosomes in Critical Illness.</a> Critical care medicine. , (2017).</li><li>Fujita, Y., Kadota, T., Araya, J., Ochiya, T., Kuwano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles:+New+Players+in+Lung+Immunity.">Extracellular Vesicles: New Players in Lung Immunity.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. , (2017).</li><li>Kubo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+in+Lung+Disease.">Extracellular Vesicles in Lung Disease.</a> Chest. 153, 210-216 (2018).</li><li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis,+function+and+decay.">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nature reviews. Genetics. 11, 597-610 (2010).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+target+recognition+and+regulatory+functions.">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li><li>Fanini, F., Fabbri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CANCER-DERIVED+EXOSOMIC+microRNAs+SHAPE+THE+IMMUNE+SYSTEM+WITHIN+THE+TUMOR+MICROENVIRONMENT:+STATE+OF+THE+ART.">CANCER-DERIVED EXOSOMIC microRNAs SHAPE THE IMMUNE SYSTEM WITHIN THE TUMOR MICROENVIRONMENT: STATE OF THE ART.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. , (2016).</li><li>Agarwal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental,+Systems,+and+Computational+Approaches+to+Understanding+the+MicroRNA-Mediated+Reparative+Potential+of+Cardiac+Progenitor+Cell-Derived+Exosomes+From+Pediatric+Patients.">Experimental, Systems, and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients.</a> Circulation research. 120, 701-712 (2017).</li><li>Prattichizzo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+microRNAs+and+endothelial+hyperglycaemic+memory:+a+therapeutic+opportunity?.">Extracellular microRNAs and endothelial hyperglycaemic memory: a therapeutic opportunity?.</a> Diabetes, obesity &amp; metabolism. 18, 855-867 (2016).</li><li>Huang-Doran, I., Zhang, C. Y., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles:+Novel+Mediators+of+Cell+Communication+In+Metabolic+Disease.">Extracellular Vesicles: Novel Mediators of Cell Communication In Metabolic Disease.</a> Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 28, 3-18 (2017).</li><li>Khalyfa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Plasma+Extracellular+Microvesicle+MicroRNA+Cargo+and+Endothelial+Dysfunction+in+Children+with+Obstructive+Sleep+Apnea.">Circulating Plasma Extracellular Microvesicle MicroRNA Cargo and Endothelial Dysfunction in Children with Obstructive Sleep Apnea.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 194, 1116-1126 (2016).</li><li>Thomou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+circulating+miRNAs+regulate+gene+expression+in+other+tissues.">Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues.</a> Nature. 542, 450-455 (2017).</li><li>Gregson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Exosomal+RNA+Profiles+in+Bronchoalveolar+Lavage+from+Lung+Transplants+with+Acute+Rejection.">Altered Exosomal RNA Profiles in Bronchoalveolar Lavage from Lung Transplants with Acute Rejection.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 192, 1490-1503 (2015).</li><li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature cell biology. 9, 654-659 (2007).</li><li>Doxaki, C., Kampranis, S. C., Eliopoulos, A. G., Spilianakis, C., Tsatsanis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+Regulation+of+miR-155+and+miR-146a+Genes+during+Induction+of+Endotoxin+Tolerance+in+Macrophages.">Coordinated Regulation of miR-155 and miR-146a Genes during Induction of Endotoxin Tolerance in Macrophages.</a> Journal of immunology. , 5750-5761 (2015).</li><li>Schulte, L. N., Westermann, A. J., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activation+and+functional+specialization+of+miR-146+and+miR-155+in+innate+immune+sensing.">Differential activation and functional specialization of miR-146 and miR-155 in innate immune sensing.</a> Nucleic acids research. 41, 542-553 (2013).</li><li>Alexander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-delivered+microRNAs+modulate+the+inflammatory+response+to+endotoxin.">Exosome-delivered microRNAs modulate the inflammatory response to endotoxin.</a> Nature communications. 6, 7321 (2015).</li><li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM-1+is+induced+in+tumor+associated+macrophages+by+cyclo-oxygenase+pathway+in+human+non-small+cell+lung+cancer.">TREM-1 is induced in tumor associated macrophages by cyclo-oxygenase pathway in human non-small cell lung cancer.</a> PloS one. 9, e94241 (2014).</li><li>Xu, R., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+In+Vitro+Co-Culture+Model+in+Anti-Cancer+Drug+Development+Cascade.">Development of In Vitro Co-Culture Model in Anti-Cancer Drug Development Cascade.</a> Combinatorial chemistry &amp; high throughput screening. 20, 451-457 (2017).</li><li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM-1-accentuated+lung+injury+via+miR-155+is+inhibited+by+LP17+nanomedicine.">TREM-1-accentuated lung injury via miR-155 is inhibited by LP17 nanomedicine.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L426-L438 (2016).</li><li>Sadikot, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dose+dexamethasone+accentuates+nuclear+factor-kappa+b+activation+in+endotoxin-treated+mice.">High-dose dexamethasone accentuates nuclear factor-kappa b activation in endotoxin-treated mice.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 164, 873-878 (2001).</li><li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+mediated+epigenetic+modulation+inhibits+TREM-1+expression+in+response+to+lipopolysaccharide.">Curcumin mediated epigenetic modulation inhibits TREM-1 expression in response to lipopolysaccharide.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 44, 2032-2043 (2012).</li><li>Chauret, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorine+dioxide+inactivation+of+Cryptosporidium+parvum+oocysts+and+bacterial+spore+indicators.">Chlorine dioxide inactivation of Cryptosporidium parvum oocysts and bacterial spore indicators.</a> Applied and environmental microbiology. 67, 2993-3001 (2001).</li><li>Cizmar, P., Yuana, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+Characterization+of+Extracellular+Vesicles+by+Transmission+and+Cryo-Transmission+Electron+Microscopy.">Detection and Characterization of Extracellular Vesicles by Transmission and Cryo-Transmission Electron Microscopy.</a> Methods in molecular biology. , 221-232 (2017).</li><li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-related+proteins+prolong+macrophage+survival+through+induction+of+Triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-1.">HIV-related proteins prolong macrophage survival through induction of Triggering receptor expressed on myeloid cells-1.</a> Scientific reports. 7, 42028 (2017).</li><li>Jackson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Mitochondrial+Transfer+in+Direct+Co-cultures+of+Human+Monocyte-derived+Macrophages+(MDM)+and+Mesenchymal+Stem+Cells+(MSC).">Analysis of Mitochondrial Transfer in Direct Co-cultures of Human Monocyte-derived Macrophages (MDM) and Mesenchymal Stem Cells (MSC).</a> Bio-protocol. 7, (2017).</li><li>Fujita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles:+New+Players+in+Lung+Immunity.">Extracellular Vesicles: New Players in Lung Immunity.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 17, 474-484 (2017).</li><li>Gunasekaran, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-Derived+Exosomes+With+Lung+Self-Antigens+in+Human+Lung+Allograft+Rejection.">Donor-Derived Exosomes With Lung Self-Antigens in Human Lung Allograft Rejection.</a> American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, 474-484 (2017).</li><li>Kalra, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomics+evaluation+of+plasma+exosome+isolation+techniques+and+assessment+of+the+stability+of+exosomes+in+normal+human+blood+plasma.">Comparative proteomics evaluation of plasma exosome isolation techniques and assessment of the stability of exosomes in normal human blood plasma.</a> Proteomics. 13, 3354-3364 (2013).</li><li>Baranyai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Exosomes+from+Blood+Plasma:+Qualitative+and+Quantitative+Comparison+of+Ultracentrifugation+and+Size+Exclusion+Chromatography+Methods.">Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods.</a> PloS one. 10, e0145686 (2015).</li><li>Nordin, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafiltration+with+size-exclusion+liquid+chromatography+for+high+yield+isolation+of+extracellular+vesicles+preserving+intact+biophysical+and+functional+properties.">Ultrafiltration with size-exclusion liquid chromatography for high yield isolation of extracellular vesicles preserving intact biophysical and functional properties.</a> Nanomedicine : nanotechnology, biology, and medicine. 11, 879-883 (2015).</li></ol>

עבודה זו נתמכה על ידי סקירה ההצטיינות VA 2I01BX001786-06A1 מימון ר'.

העכבר מודלים של מחלות משמשות כדי להעריך את תפקוד פיזיולוגי גנים ספציפיים וכדי להפחית את העלות של ניסויים2. הפגיעה ריאות זיהומית חריפה המתוארים כאן מחקה לתגובה דלקתית אצל בני-אדם עם ARDS. מודל זה רלוונטי לחקור בפתוגנזה מולקולרית, פיתוח של סמנים ביולוגיים, לבחון את פוטנציאל טיפול...

עלי ARDS הם הצורות סכנת חיים של כשל נשימתי עם hypoxemia חמורה נגרמת על ידי בצקת ריאות שאינה קרדיוגני אשר משפיע על 1 מיליון אנשים ברחבי העולם מדי שנה1. האטיולוגיה של ARDS כולל פגיעה ישירה אל הריאות מפני זיהומים או שאיפה ועוד מגוון של עלבונות עקיף. בעשור האחרון חלה הבנה מוגברת של מולקולרית בפתוגנזה של ARDS, עם זאת, טיפולים פרטניים יישוב ARDS הם עדיין להיות שפותחה2,3.
מספר מודלים חייתיים של פגיעת ריאות חריפה פותחו המספקות גשר לתרגום טיפולים ניסויים בבני אדם4,5. דגמים נפוצים כוללים התקנה מקומית של חומצה אולאית, חיידקים, LPS bleomycin. גישות אחרות כוללות איסכמיה-פגיעה reperfusion, ניקוב מצדו cecal, פציעה מתיחה הנוצרות על-ידי אוורור מכני, מעידות או ניהול מערכתי חיידקים ו LPS5. מודלים אלה מספקים מערכת ביולוגית שימושי כדי לבדוק השערות קליני לפיתוח של טיפולים פוטנציאליים. כדי לדמות אנושית ARDS, מודלים בעלי חיים צריכים לשחזר דלקת חריפה לפגיעה אפיתל ותאי אנדותל עם פגמים בתפקוד מכשול בריאות.
Exosomes הם קרום שלפוחית עם 20-200 ננומטר בקוטר, שתוכנם מולקולרית מכיל חלבונים, DNA, RNA, ושומנים, וכדי להקל על תקשורת בין-תאית ברקמות microenvironment באמצעות העברה ההרכב המולקולרי. Exosomes המופרשים על ידי סוגים שונים של תאים, כגון תאי אנדותל, תאי אפיתל, תאי שריר חלק, תאים סרטניים, ולא קיים בנוזל הגוף האנושי. מחקרים מצביעים על כך exosomes לווסת צולבות לדבר בין תאים חיסוניים לבין תאי סטרומה במהלך זיהומיות ומחלות דלקתיות סטרילי שחרורם חריג שנראה ולהיות מוסדר על ידי גירויים טבעיים וניסויים שונים במהלך פיזיולוגיים תהליכים פתולוגיים6. רשת תקשורת כזה עשוי לשחק תפקיד חשוב בפתוגנזה של מחלות ריאה, עשוי להשפיע על התקדמות pathophysiological7,8. כמו 18-22 נוקלאוטיד אי קידוד RNAs, miRNAs קיימים רקמות וגם נוזלי הגוף, פלזמה, סרה, לווסת את ביטוי ה-mRNA ברמה post-translational9,10.
MiRNAs ארוזים בשנת exosomes בידול והתפקוד של סוגים שונים של תאים, ולהשפיע על רמות מוגזמות קשורים עם מגוון רחב של מחלות, כולל סרטן, מחלות ריאה, השמנת יתר, סוכרת, מחלות לב וכלי דם11, 12,13,14,15,16. הזנת התאים הנמען ושל הליכה הלוך ושוב של exosomal miRNAs להקל על המערכת תקשורת שינוי את hemostasis17,microenvironment18. ריאות חריפה-פגיעה היא תהליכים מורכבים, הכוללים סוגי תאים מרובים עם התקשורת המערכת נרחב עד exosomes8. miR-155 מיר-146a לשתף מנגנון רגולטורי תעתיק נפוצות, לתרום את התגובה דלקתית ו19,את המערכת החיסונית סובלנות20. מחקרים שנעשו לאחרונה עולה כי שניהם לווסת את התגובה דלקתית ויה exosomal miRNAs ונעים בין תאים חיסוניים21. אולם, המנגנונים המולקולריים שבבסיס ההשפעות modulatory של exosomal miRNAs על מכתשי בתגובה אנדוטוקסין אינן ברורות, ללא ספק פוטנציאל להיות קליני ואת הכשרון במשתמע translational להמשך החקירה.
תרבות שיתוף מודלים להיות מועסקים כדי להגדיר את האינטראקציה של סוגי תאים מסוים בסביבת מורכבים, כגון דלקת וסרטן22,23. פלטפורמות אלה מספקים אסטרטגיית חלופי לחקור צלב דיבורים בין סוגי תאים במיוחד עבור תאים חיסוניים ומבניים.
אינטרה-הנשימה, ניהול שידורה, בקרום הבטן או מערכתית של LPS נמצאים בשימוש נרחב לזירוז ריאות ניסיוני פציעה24,25,26, הראו לזירוז חדירות אפיתל, אנדותל פגמים. כאן אנו משתמשים LPS בקרום הבטן לזירוז מודל ספיגה של פגיעת ריאות חריפה בעכברים. בתוך 24 שעות של הממשל בקרום הבטן של LPS, פגמים חדירות הם המושרה בריאות עם הגיוס של תאים דלקתיים. יתרה מזאת, אנו מראים כי exosomes מ- BAL מכילות miRNA-155 מיר-146a, exosomes מן נוזל BAL זירוז ביטוי ציטוקינים פרו-דלקתיים בתאי אפיתל הנמען, כולל IL-6 ו- TNF-α. נתונים אלה הם הראשון להראות כי miRNAs exosomal המופרשים ב BAL במודל זה הפגיעה ריאות זיהומית חריפה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1276px;" width="1276">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:691px;">lipopolysaccharide</td>
			<td style="width:181px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">Escherichia coli 055:B5</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS pH7.2(1X)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mirVana miRNA isolation kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">449774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mmu-miR-155 (002571) primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">4427975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">has-miR-146a (000468) primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">4427975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U6snRNA primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">4427975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TNF-&#945;(Mm00443258_m1 ) primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IL-6 (Mm00446190_m1&#160;&#160; )primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZO-1 (Mm00493699_m1&#160; )primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">minimal essential medium (MEM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11095-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trysin-EDTA solution(0.05%)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosomes were labeled with PKH67 through PKH67 Green Fluorescent Cell linker Mini Kit&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI67-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome Spin Columns (MW3000)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td align="right">4484449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Beckman Coulter Optima L-100XP ultracentrifuge&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L-100XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra-clear centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td align="right">344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">transmission electron microscopes (TEM)</td>
			<td>JEOL Ltd</td>
			<td>120 kV TEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Olympus BX41 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX41</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bronchoalveolar lavage exosomes in lipopolysaccharide-induced septic lung injury

פגיעת ריאות חריפה (עלי), תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) מייצגים קבוצה הטרוגנית של מחלות ריאה, אשר ממשיכה יש תחלואה גבוהה של תמותה. בפתוגנזה מולקולרית של עלי זה להיות טוב יותר מוגדרים; עם זאת, בשל האופי המורכב של המחלה טיפולים מולקולריים טרם להתפתח. כאן אנו משתמשים דגם העכבר המושרה ליפופוליסכריד (LPS) של פגיעת ריאות זיהומית חריפה על התפקיד של exosomes בתגובה דלקתית. באמצעות מודל זה, הצלחנו להראות כי עכברים נחשפים LPS בקרום הבטן מפרישים exosomes בנוזל שטיפה (BAL) Broncho-מכתשי מהריאות הארוזים עם miRNA, ציטוקינים המסדירה תגובה דלקתית. עוד יותר באמצעות מערכת מודל תרבות משותפת, אנו מראים כי exosomes של מקרופאגים לשבש את הביטוי של צומת חזק חלבונים בתאי אפיתל הסמפונות. תוצאות אלו מראים כי הצלב לדבר 1) בין תאי מערכת החיסון ומבניים מולדת דרך exosomal הליכה הלוך ושוב לתרום התגובה דלקתית, שיבוש המכשול מבנית ואת 2) מיקוד miRNAs אלה עשויים לספק פלטפורמה חדשנית לטיפול עלי, ARDS.

כדי לגרום לפציעה ריאות זיהומית, טופלו עכברים LPS בקרום הבטן (15 מ"ג/ק"ג). בתוך 24 שעות של LPS מינהל, זרם neutrophilic נראתה בריאות, כפי שמוצג באיור 1A. העכבר BAL נוזל נמשך, ואחריו בידוד, טיהור של exosomes. המורפולוגיה של BALF exosomes אושר ע י שידור מיקרוסקופ (איור 1B).</p...

Watch this Scientific Journal Video about Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury at JoVE.com

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Exosomes Bronchoalveolar שטיפה בפציעה ליפופוליסכריד-induced ריאות זיהומית

עכברים נחשפים LPS בקרום הבטן מפרישים exosomes בנוזל שטיפה (BAL) Broncho-מכתשי הארוזים עם miRNAs. באמצעות מערכת תרבות משותפת, אנו מראים כי exosomes שוחרר בנוזל BAL לשבש את הביטוי של צומת חזק חלבונים בתאי אפיתל הסמפונות ולהגדיל את הביטוי של ציטוקינים פרו-דלקתיים זה להדגיש פגיעת ריאות.

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

bronchoalveolar-lavage-exosomes-lipopolysaccharide-induced-septic

Research

JoVE Journal

Genetics

10.8K Views.  Atlanta VAMC. עכברים נחשפים LPS בקרום הבטן מפרישים exosomes בנוזל שטיפה (BAL) Broncho-מכתשי הארוזים עם miRNAs. באמצעות מערכת תרבות משותפת, אנו מראים כי exosomes שוחרר בנוזל BAL לשבש את הביטוי של צומת חזק חלבונים בתאי אפיתל הסמפונות ולהגדיל את הביטוי של ציטוקינים פרו-דלקתיים זה להדגיש פגיעת ריאות...

Video: Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

This protocol describes a method for efficiently transfecting siRNA in freshly isolated human villous cytotrophoblasts using microporation and identifying DNA-protein complexes in these cells. Transfected cells can be monitored by Western blot and EMSA analyses during the 4-day culture time.

ניתוח Transfection siRNA ו Emsa על Cytotrophoblasts Villous אדם המבודד טרי

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

באתרו תיוג של דנ&quot;א מיטוכונדריאלי שכפול תסיסנית למבוגרים השחלות ידי edu מכתים

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ&quot;א סתר החיפושית,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control in model organisms. Technologies including short hairpin RNAs (shRNAs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) have enabled such screens in diploid mammalian cells. Here we describe a large-scale shRNA screen for regulators of X-chromosome inactivation (XCI), using a murine cell line with firefly luciferase and hygromycin resistance genes knocked in at the C-terminus of the methyl CpG binding protein 2 (MeCP2) gene on the inactive X-chromosome (Xi). Reactivation of the construct in the reporter cell line conferred survival advantage under hygromycin B selection, enabling us to screen a large shRNA library and identify hairpins that reactivated the reporter by measuring their post-selection enrichment using next-generation sequencing. The enriched hairpins were then individually validated by testing their ability to activate the luciferase reporter on Xi.

We report a small hairpin RNA (shRNA) and next generation sequencing-based protocol for identifying regulators of X-chromosome inactivation in a murine cell line with firefly luciferase and hygromycin resistance genes fused to the methyl CpG binding protein 2 (MeCP2) gene on the inactive X chromosome.

במאגר shRNA מסך עבור הפעלה מחדש של MeCP2 על כרומוזום X לא פעיל

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly defined states of chromatin organization. The dynamic architecture of the nucleus is controlled by multiple mechanisms and shapes the transcriptional output programs. It is, therefore, important to determine locus-specific chromatin accessibility in a reliable fashion that is preferably independent from antibodies, which can be a potentially confounding source of experimental variability. Chromatin accessibility can be measured by various methods, including the Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements (FAIRE) assay, that allow the determination of general chromatin accessibility in a relatively low number of cells. Here we describe a FAIRE protocol that allows simple, reliable, and fast identification of genomic regions with a low protein occupancy. In this method, the DNA is covalently bound to the chromatin proteins using formaldehyde as a crosslinking agent and sheared to small pieces. The free DNA is afterwards enriched using phenol:chloroform extraction. The ratio of free DNA is determined by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) or DNA sequencing (DNA-seq) compared to a control sample representing total DNA. The regions with a looser chromatin structure are enriched in the free DNA sample, thus allowing the identification of genomic regions with lower chromatin compaction.

The plasticity of nuclear architecture is controlled by dynamic epigenetic mechanisms including non-coding RNAs, DNA methylation, nucleosome repositioning as well as histone composition and modification. Here we describe a Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements (FAIRE) protocol which allows the determination of chromatin accessibility in a reproducible, inexpensive, and straightforward manner.

בסיוע פורמלדהיד בידוד של אלמנטים הרגולציה על אמצעי נגישות כרומטין בתאים בתרבית

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene expression, but whether looping is responsible for or a result of alterations in gene expression is still unknown. Until recently, how chromatin looping affects the regulation of gene activity and cellular function has been relatively ambiguous, and limitations in existing methods to manipulate these structures prevented in-depth exploration of these interactions. To resolve this uncertainty, we engineered a method for selective and reversible chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9). The dynamism of the CLOuD9 system has been demonstrated by successful localization of CLOuD9 constructs to target genomic loci to modulate local chromatin conformation. Importantly, the ability to reverse the induced contact and restore the endogenous chromatin conformation has also been confirmed. Modulation of gene expression with this method establishes the capacity to regulate cellular gene expression and underscores the great potential for applications of this technology in creating stable de novo chromatin loops that markedly affect gene expression in the contexts of cancer and development.

Chromatin looping plays a significant role in gene regulation; however, there have been no technological advances that allow for selective and reversible modification of chromatin loops. Here we describe a powerful system for chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrated to selectively and reversibly modulate gene expression at targeted loci.

CRISPR בתיווך ארגון מחדש של הכרומטין לולאה

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome editing, embryonic stem (ES) cell-based gene-targeting technology does not have these shortcomings and is widely used to modify animal/mouse genome ranging from large deletions/insertions to single nucleotide substitutions. Notably, identifying the relatively few homologous recombination (HR) events necessary to obtain desired ES clones is a key step, which demands accurate and reliable methods. Southern blotting and/or conventional PCR are often utilized for this purpose. Here, we describe the detailed procedures of using those two methods to identify HR events that occurred in mouse ES cells in which the endogenous Myh9 gene is intended to be disrupted and replaced by cDNAs encoding other nonmuscle myosin heavy chain IIs (NMHC IIs). The whole procedure of Southern blotting includes the construction of targeting vector(s), electroporation, drug selection, the expansion and storage of ES cells/clones, the preparation, digestion, and blotting of genomic DNA (gDNA), the hybridization and washing of probe(s), and a final step of autoradiography on the X-ray films. PCR can be performed directly with prepared and diluted gDNA. To obtain ideal results, the probes and restriction enzyme (RE) cutting sites for Southern blotting and the primers for PCR should be carefully planned. Though the execution of Southern blotting is time-consuming and labor-intensive and PCR results have false positives, the correct identification by Southern blotting and the rapid screening by PCR allow the sole or combined application of these methods described in this paper to be widely used and consulted by most labs in the identification of genotypes of ES cells and genetically modified animals.

Here, we present a detailed protocol for identifying homologous recombination events that occurred in mouse embryonic stem cells using Southern blotting and/or PCR. This method is exemplified by the generation of nonmuscle myosin II genetic replacement mouse models using traditional embryonic stem cell-based homologous recombination-mediated targeting technology.

זיהוי של אירועי רקומבינציה הומולוגית בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות סופג הדרומי ואת תגובת שרשרת פולימראזית

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

אפיון שינויים Post-translational שינוי היסטון במודלים ניווניות Proteinopathy שמרים

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant viruses they vector. Despite numerous studies of the biology of these species in different environments, a key life history parameter, offspring sex ratios, has received little attention, yet is important for predicting population dynamics. The primary sex ratio (sex ratio at oviposition) of Bemisia tabaci has never been reported but can be found by determining the egg fertilization rate of this haplodiploid insect. The technique involves the dechorionation of eggs with bleach, a series of fixation steps, and the application of the general DNA fluorescent stain, DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole, a DNA-binding fluorescent dye), to bind to female and male pronuclei. Here, we present the technique, and an example of its application, to test whether an endosymbiotic bacterium, Rickettsia sp. nr. bellii, influenced the primary sex ratio of B. tabaci. This method may assist in population studies of whiteflies, or in determining if sex allocation exists with certain environmental stimuli.

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

We present a simple cytogenetic technique using 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to determine the fertilization rate and primary sex ratio of the haplodiploid invasive pest Bemisia tabaci.

קביעת שיעור הפריה הביצית של כנימת עש הטבק בטכניקה Cytogenetic

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...