Name: methods for the study of regeneration in stentor
Uploaded: 2018-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Study of Regeneration in Stentor at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק-NIH R01 GM113602 (WFM) ואת ה-NSF 1144247 (אי אל). אנו להכיר מארק Slabodnick, נטלי קירקלנד לפיתוח הגירסאות הראשונית של כמה מהפרוטוקולים האלה, לדיונים אינפורמטיבי. אנו מודים קארינה Perlaza ולואיס גריסון על קריאה ביקורתית של כתב היד.

<ol>
	<li>Kirschner, M., Gerhart, J., Mitchison, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+"vitalism".">Molecular "vitalism".</a> Cell. 100 (1), 79-88 (2000).</li><li>Shulman, J. M., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+single+cells.">Pattern formation in single cells.</a> Trends in Cell Biology. 9 (12), M60-M64 (1999).</li><li>Wloga, D., Frankel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+molecules+to+morphology:+cellular+organization+of+Tetrahymena+thermophila.">From molecules to morphology: cellular organization of Tetrahymena thermophila.</a> Methods in Cell Biology. 109, 83-140 (2012).</li><li>Frankel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pattern Formation: Ciliate Studies and Models. , (1989).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+experiments+concerning+primordium+formation+in+Stentor+coeruleus.">Grafting experiments concerning primordium formation in Stentor coeruleus.</a> Journal of Experimental Zoology Part A. 131 (1), 75-121 (1956).</li><li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+smallest+parts+of+Stentor+capable+of+regeneration;+a+contribution+on+the+limits+of+divisibility+of+living+matter.">On the smallest parts of Stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor.">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macronuclear+genome+of+Stentor+coeruleus+reveals+tiny+introns+in+a+giant+cell.">The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell.</a> Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).</li><li>Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-repairing+cells:+How+single+cells+heal+membrane+ruptures+and+restore+lost+structures.">Self-repairing cells: How single cells heal membrane ruptures and restore lost structures.</a> Science. 356 (6342), 1022-1025 (2017).</li><li>Slabodnick, M., Prevo, B., Gross, P., Sheung, J., Marshall, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cytoplasmic+flow+during+single-cell+wound+healing+in+Stentor+coeruleus.">Visualizing cytoplasmic flow during single-cell wound healing in Stentor coeruleus.</a> Journal of Visualized Experiments. 82 (82), 50848 (2013).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Stentor. , (1961).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+regulator+mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+stentor+morphogenesis.">The kinase regulator mob1 acts as a patterning protein for stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), e1001861 (2014).</li><li>Harris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. 1, (2009).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

Culturing Stentor מציג מספר אתגרים. ראשית, כדי לבצע ניסויים הדורשים מספר גדול של תאים, אחד צריך לשמור על מספר רב של תרבויות Stentor , כמו תרבויות להיות לא בריא כאשר ריכוז Stentor עולה 20 תאים למ"ל. שנית, המיקרואורגניזמים יכול לזהם Stentor תרבויות קרובות לחלק מהר יותר Stentor , להציף את התרבות (מזהם נפוץ הוא rotifers). לפיכך, יש צורך לבחון את התרבות תחת מיקרוסקופ מעת לעת ולהסיר את המזהמים. לעיתים, תרבות חדשה צריכה להיות החל ממספר קטן של תאים ניצלה באופן ידני מתרבות מזוהמים. פעולה זו מגדילה את הזמן הנדרש כדי לשמור על תרבויות Stentor בריאים. שלישית, הרחבת תא בודד לתוך תרבות 400 מ ל דורש לפחות חודש אחד, כי מחזור התא Stentor הוא 3-5 ימים. רביעית, בניגוד מודל אחר ciliates, Stentor לעיתים רחוקות ללכת לתוך ציסטה טופס, הם לא יכולים להיות קפוא.
היבט חשוב של culturing Stentor הוא הבחירה של אורגניזם מזון המתאים. שיטות שונות עבור culturing Stentor שתוארו קודם לכן. אחד מהם מציע להשתמש חלב רזה התרבות חיידקים אשר מאכילים Stentor. כזה טכניקה יעילה culturing Stentor; עם זאת, יישום של טכניקות גנומית דורש דוגמאות טהור כדי למנוע בלבול הנובע קריאות גנומית של אורגניזמים מזון לא מוגדר. משתמש בפרוטוקול הנוכחי, ניתן לגדל Stentor במסה, כי את האוכל שלהם, Chlamydomonas, יש כבר וסודרו, הנוכחות של זיהום גנומית של האורגניזם המזון ועוזרת מבוקר על. מסיבות לא ידועות, טרטר נאלץ לחדש את המלאי שלו על-ידי החזרת עד היכן הוא מצא Stentor לפני. עם הפרוטוקול הנוכחי, הצלחנו לשמור על Stentor במשך שנים.
התחדשות ניסויים עם Stentor הם בדרך כלל פשוטה, אבל יש כמה פרטים קריטיים שכדאי לזכור. לגבי סעיף 2, חיתוך Stentor תאים לחצי יכול להיות מומחה תוך דקות. מאסטרינג כירורגיים מתקדמים יותר של Stentor עשויים לדרוש שבוע של תרגול. בזמן ביצוע טיפול סוכרוז או אוריאה (סעיף 3), אם בתחילת הדמיה רוב התאים עדיין יש להקות membranellar שלהם, להגביר את זמן הדגירה על ידי 10-30 s עבור מתי סוכרוז הטיפול מבוצע הבא. לא להאריך את זמן הטיפול סוכרוז מעבר 3 דקות הדגירה מכיוון שהתוצאה תהיה מוות של תאים.
הדמיה של Stentor התחדשות דורש שיטות לתאים גדולים התמונה לאורך פרקי זמן ארוכים. שיטת הדמיה מפורטת בסעיף 4 יכול לשמש רק עם מיקרוסקופ זקוף. אם במיקרוסקופ הפוכה זמין במקום, ואז התאים ניתן להניח בשקופית או coverslip בתאי קטן. שיטה אחת היא ליצור תא מחוץ וזלין ולכסות עם coverslip אחר כדי למנוע אידוי. לחלופין, תא עבור תא בודד יכול להתבצע על ידי עושה חור עם אגרופים חור בגודל הרצוי 1 x 1 ס מ2 מרובע של סיליקון מרווח (טבלה של חומרים), הצבת את מרווח coverslip, שם תאים בבית הבליעה , מכסה את התא עם coverslip אחרת. כאשר הדמיה, אם Stentor אינם לכיוון הנכון כדי לבחון את התכונות האופייניות של כל שלב של התחדשות, הקש על לוח בחוזקה כדי להפוך את החוזה תא. לצפות את התא להרחיב כדי לזהות את השלב של התחדשות (למיתוח לוקח בערך 45 s). אם התא נמצא עדיין הכיוון הלא נכון, חזור הנקישות. הדימויים המוצגים באיור 1 , איור 6 צולמו על ידי מיקרוסקופ זום סטריאו; עם זאת, כל הניסויים מפורט ניתן לבצע באמצעות 5 X לנתח סטריאו מיקרוסקופ.
אתגר נוסף מלבד culturing והדמיה Stentor הוא המעקב של התחדשות, במיוחד את כמות הזמן הדרוש כדי לזהות בשלבים. אם התא ההתחדשות מכוון בצורה מושלמת עם האזור של ראשית הפה נראה בבירור, זיהוי של הבמה לוקח כמה שניות. לפעמים, אולם, התא Stentor היא בכיוון מניעת הקצאה ברורות של שלב התחדשות, ובכך לקחת יותר זמן כדי לזהות. משך הזמן הנדרש כדי שלב ההתחדשות תאים בודדים עשוי לעכב את כימות של כל התאים ההתחדשות, ובכך להקטין את הדיוק הטמפורלי של היערכות ודרישה המתבונן לחכות, להתקין מחדש התא אחריו עברה משמעותית כיוון חדש. כתוצאה מכך, הניסוי הזה הוא גם זמן וגם עבודה אינטנסיבית. מסיבות אלו, רצוי מאוד לפתח בשיטות אוטומטיות עבור Stentor התאים ולהתאושש הקצאת בשלבים של התחדשות בנתוני מיקרוסקופ וידאו. אלה יאפשרו גם לניסויים לשחזור יותר, מגדילה גודל המדגם, הסרת הטיה אנושית.
הופעתה של שיטות רגישה מאוד גנומית פרוטיאומיה מבנית החלה להכניס יד מחקרים של תאים בודדים. עבור ניתוחים תא בודד כזה, בגודל ענק של תא Stentor הופך נושא הבדיקה רצוי עבור ניסויים הוכחה הרעיון. לניסויים כזה בלתי אפשרי, culturing Stentor הוא מהותי, אז בשיטות המתוארות כאן צריך לשחק תפקיד להמשך פיתוח של טכניקות מתקדמות יותר מתא בודד.

התאים אינם תיקים פשוטים של אנזימים, אבל מאוד מורכבת למדי מכונות שהרכיבים בקפידה לשינוי הגודל הנכון, לארגן תפקידים מוגדרים היטב. מורפוגנזה של תאים בודדים מייצג תהליך מפתח התא וביולוגיה התפתחותית, אך המנגנון המולקולרי שלה לא ידוע1,2. בעוד כמה תאים בתרבית דומות כתמים, אורגניזמים חד־תאיות יכול מאוד סיבכו ארכיטקטורות, ומעוררות את דפוסי בקליפת המוח מורכבת ראיתי3,ciliates4.
אולי הדוגמה הקיצונית ביותר של תא מאוד מובנית הוא Stentor coeruleus, heterotrichous ענק ciliate קשור Tetrahymena ו- סנדלית. Stentor הוא באורך של 1 מ מ, והוא מכוסה עם יותר מ-100 פסים אורכיים של פיגמנט כחול לסירוגין עם שורות של cilia מאורגנים בערימות מקבילים של סרטים microtubule להפעיל את משך כל התא. התא הוא חצוצרה בצורת (איור 1), עם תזמורת membranellar מכשירים דרך הפה (OA) לסיומה הקדמי, ואת holdfast שמתחבר התא המצע בקצה האחורי שלו. בנוסף הקוטביות ברור הקדמי, האחורי, התא גם מראה המתבנת כיראלי, ייחודי כך ריווח בין שורות ciliary בהדרגה גדל עם כיוון השעון. התוצאה רציפות שם השורה הצר פוגש את השורה הרחב ביותר, ואת אזור זה של פני השטח של התא, המכונה מיקומה של פס ניגודיות, יכולים לגרום להיווצרות הסט השני של מבנים הקצה הקדמי כאשר הושתל אל תא אחר5, . עושה את זה באופן רשמי המקביל לסדרן של Spemann. לפיכך, כל תהליכי מפתח ביולוגיה התפתחותית יש תחליפי שלהם ב- Stentor: axiation, תבניות ו אינדוקציה. העובר, תהליכים אלה מונעים על ידי הגורל ההבדלים בין תאים שונים, אבל ב- Stentor, הם חייבים להיות מונע על ידי הגורל הבדלים בין אזורים שונים בתוך תא בודד. מה שמגדיר את ההבדלים בין האזורים בתוך Stentor היא בגדר תעלומה.
אם חלק כלשהו של Stentor נחתך, החתיכה החסרה של התא יכול להתחדש להניב תאים נורמליים תוך מספר שעות. אם תא לחתוך לחצי, או אפילו לחלקים קטנים הרבה יותר, כל קטע מארגנת מחדש ויהיו לתוך תא שנראה נורמלי אבל קטנים יותר ומשחזרת את המידתיות נכונה בין תא חלקים6,7. אפילו שברירי, 1/64th לגודל התא המקורי, מסוגלים להתחדש בתוך תא קטן, אך בדרך כלל פרופורציות ולאחר מכן לגדול בגודל מלא6. Stentor ובכך מציגה הזדמנות ייחודית ללמוד את המנגנונים של אברון גודל שינוי גודל של תאים צמיחה תקנה בשיטות כירורגיות המוחלות בדרך כלל ברמה של רקמות או אורגניזם שלם.
אחד המאפיינים של Stentor ומאפשרת לו להתחדש מתוך מגוון רחב של ניתוחים כירורגיים הוא שהוא מכיל macronucleus nodulated יחיד (איור 1) עם בערך 50,000 עותקים של כל הגנים8. כל עוד קטע התא מכילה צומת macronuclear אחד לפחות, הוא בעל יכולת להתחדש באופן מלא. מאפיין נוסף המשמש כבסיס יכולת התחדשות של Stentor, היא יכולתה ריפוי פצע עצום. סוגי תאים רבים אמנם מסוגל ריפוי הפצעים שלהם9, Stentor הוא מסוגל להתאושש במגוון יוצא דופן של לפליטת הפיזי. דוגמה Stentor ההתאוששות מן ההפרעות דרסטית, יחד עם השיטות להמחשת זרימה cytoplasmic Stentor10 דווחו בעבר. שיטות אלה מאפשרות לימוד משפיעים על התחדשות איך ופצעו ובעקבות המצב הפיסי של הציטופלסמה.
גודל עצום של stentor, יכולת התחדשות יוצאת דופן, והעובדה כי זה בא לידי ביטוי, תופעות התפתחותיות אצל העוברים multicellular (כגון המארגנים, axiation והמתבנת) רבות נמשך ביולוגים התפתחותיים רבים במהלך הפנייה של המאה הקודמת, לרבות תומאס הנט מורגן7. במהלך החמישים והשישים, גישות המיקרוכירורגית הדגים מערך מדהים של תהליכים morphogenetic ולעירור החד-תאי הזה11. עם זאת, Stentor פותחה כמערכת מודל בביולוגיה מולקולרית רק לאחרונה. במהלך השנים האחרונות, הגנום של Stentor היה וסודרו והתכנסו8, ואת השיטה perturb ביטוי גנים באמצעות RNAi מאכילים היה מפותח12.
אחת הסיבות Stentor פותחה לתוך אורגניזם מודל הביולוגיה המולקולרית המודרנית רק לאחרונה היה הקושי של גידול גדול התרבויות בגלל מחזור התא ארוכה שלה (3 עד 5 ימים). עם זאת, שיטות מודרניות גנומית פרוטיאומיה מבנית לדרוש פחות חומר מאשר הם נהגו, הנפח של תא בודד Stentor היא מספקת שיטות אלה, אפילו בלי להזדקק העדינה שיטות שפותחו עבור הניתוח של יחיד תאים קטנים בהרבה Stentor. בסעיף 1 של הפרוטוקול מפרט את ההליך עבור יצירת תרבות גדול מתא Stentor בודד. אותה גישה יכול לשמש כדי ליצור תרבות גדול מרסיס תא שהושג על ידי חיתוך תא. בסעיף 1 מספק גם ההנחיות לשמירה על תרבויות Stentor בריאים לאורך פרקי זמן ארוכים. סעיף 2 של הפרוטוקול מספקת את המתודולוגיה להשראת התחדשות התאים על ידי גזירה את התאים באופן ידני עם מחט זכוכית. סעיף 3 של הפרוטוקול מוקדש שתי שיטות של גרימת לרגנרציה של תא מסוים מבנים (membranellar band ואוראלי-המנגנון): טיפול תאי עם סוכרוז או אוריאה שמוביל שפיכת של מבנים אלה, ואחריו שלהם התחדשות. סעיף 4 של הפרוטוקול פירוט שיטת ההדמיה של תאים בודדים ההתחדשות במשך פרקי זמן ארוכים. סעיף 4 מסתיים התיאור של השלבים של התחדשות וטיפים על הניתוח של התחדשות דינמיקה.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Stentor coeruleus&lt;/em&gt; live culture</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>131598</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Chlamydomonas&lt;/em&gt; &lt;em&gt;reinhardtii&lt;/em&gt; on agar</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>152040</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurized springwater, 1-quart bottle</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>132458</td><td></td></tr><tr><td>Methyl cellulose, 1500 cP</td><td>Millipore Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex glass spot plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>13748B</td><td></td></tr><tr><td>Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>715740</td><td></td></tr><tr><td>2-cup glass container with glass lid</td><td>Pyrex</td><td>1095600</td><td></td></tr><tr><td>CultureWell silicone sheet material</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Fisher finest</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>TAP Growth Media, optimized for &lt;em&gt;Chlamydomonas&lt;/em&gt; culture</td><td>ThermoFisher</td><td>A1379801</td><td></td></tr><tr><td>Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Petrolatum, Petroleum Jelly, White</td><td>Spectrum</td><td>P1037</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary tubes.&lt;br/&gt; OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm.</td><td>Sutter Instrument</td><td>B120-90-10</td><td></td></tr><tr><td>Needle puller P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000 stereo microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiozoom V16, stereo zoom microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methods for the study of regeneration in stentor

התאים צריכים להיות מסוגלים לחדש את החלקים שלהם להתאושש לפליטת חיצוניים. Ciliate חד־תאיות Stentor coeruleus הוא אורגניזם מודל מצויין ללמוד ריפוי הפצע התחדשות התאים הבאים. הגנום Stentor הפכו לזמינות לאחרונה, יחד עם שיטות בביולוגיה מולקולרית מודרניים, כגון RNAi. כלים אלה מאפשרים ללמוד תא בודד התחדשות ברמה המולקולרית. המקטע הראשון של הפרוטוקול מכסה הקמת Stentor תרביות תאים תאים בודדים או שברי תאים, ביחד עם הנחיות כלליות לשמירה על תרבויות Stentor . Culturing Stentor בכמויות גדולות מאפשרת שימוש בכלים יקר כמו ביוכימיה, רצף ספקטרומטר מסה. המקטעים הבאים של הפרוטוקול לכסות גישות שונות כדי גרימת התחדשות ב- Stentor. חיתוך באופן ידני תאים עם מחט זכוכית מאפשרת ללמוד לרגנרציה של חלקי תאים גדולים, כאשר מתייחסים תאים עם סוכרוז או אוריאה מאפשר ללמוד לרגנרציה של מבנים ספציפיים ממוקם בקצה הקדמי של התא. שיטת הדמיה תאים בודדים ההתחדשות מסופק, יחד עם טבלת עזר להערכת הישגים היערכות וניתוח את הדינמיקה של התחדשות. התהליך כולו של התחדשות מחולק בשלושה שלבים. דמיין את הדינמיקה של ההתקדמות של אוכלוסיה של תאים דרך השלבים, הוא הפגין את הטרוגניות בתזמון התחדשות.

Stentor תרבויות אמינה שהוקמו והותאמו מתוחזק תאים בודדים או שברי תאים באמצעות בסעיף 1 של הפרוטוקול. דוגמה מייצגת של תרבות בריא גדול מוצג 1 וידאו.
הקורס זמן של התחדשות נמדדה ב Stentor באמצעות שיטת טיפול סוכרוז לאתחול של התחדשות המתוארים שלב 3.1, בשילוב עם הדמיה ושיטת ניתוח שנדונו בסעיף 4 (איור 7). מגרש זה מציין כי כפולה אחת באורך שעה מהזמן נלקח על ידי אוכלוסיית תאים כדי להגיע בכל שלב מסוים. סוג זה של ניתוח מאפשר חקר הטרוגניות טמפורלית בתהליך התחדשות אוכלוסיה של התחדשות תאים.
לפניכם סיכום של תזמון התחדשות זה נצפתה עד כה לאחר עשרות טיפולים סוכרוז (איור 4 , איור 6). שלב ראשון הוא כאשר התאים Stentor נראים כמו דמעות בלי שום להקה membranellar (בשלב זה מתחיל מיד לאחר שטיפה סוכרוז). שלב זה נמשך 3-6 ח' שלב 2 הוא כאשר מופיעה להקה membranellar גדל (3-6 שעות לאחר הטיפול סוכרוז). שלב זה נמשך 3-4 ח' בשלב 3 הוא כאשר ראשית דרך הפה מופיע בקצה האחורי של הלהקה membranellar (6-8 שעות לאחר הטיפול סוכרוז), שני מבנים מועברים לקראת סוף התא הקדמי. שלב זה נמשך 1-2 h. הלהקה membranellar והן את המנגנון אוראלי הגיע לקצה הקדמי של התא, זה הצביעו על השלמתו של התחדשות. התא אימצה צורה אופיינית בחצוצרה Stentor . התאים היו לגמרי מחדש 8-9 שעות לאחר הטיפול סוכרוז.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig1.jpg"> איור 1. תמונת מצב של Stentor. הלהקה membranellar את המנגנון אוראלי מוצגים בקצה הקדמי של התא. Holdfast נמצאת בקצה האחורי של התא. Stentor macronucleus הוא nodulated. מוזן היטב Stentor יש ירוק וקואלות מזון המכיל בעיקר Chlamydomonas. סולם בר הוא 0.5 מ מ. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig2.jpg"> באיור 2. הגדרת חיתוך stentor . תא חיתוך מתבצע על ידי באופן ידני מניפולציה מחט זכוכית בזמן שאני מסתכל על התא באמצעות מיקרוסקופ סטריאו ויבתר זמינים מסחרית. מטרת העיתון רקמות היא לספק הרקע הלבן כדי לראות את התאים יותר טוב. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig3.jpg"> איור 3. תמונות של 3 וידאו המדגימה כיצד לחתוך את Stentor עם מחט זכוכית- (א) א Stentor מיד לפני זה נוגע המחט. (B) A Stentor סחוט בעדינות בין שקופית מחט וזכוכית. (ג) א מתכווץ Stentor מגיב בכוח המחט. (ד) A Stentor שהוא נחתך על ידי בעדינות לחיצה על התא עם הצד של המחט. (E) A Stentor עכשיו לחתוך לשניים אבל לא מופרדים. (F) שני קטעים Stentor . סולם בר הוא 0.25 מ"מ. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2.jpg"> באיור 4. ויזואליזציה סכמטי של סעיף 3, סעיף 4 של הפרוטוקול. זהו פרוטוקול מאויר לביצוע סוכרוז או אוריאה טיפול והתבוננות של התחדשות התאים. הזמן שצוין בחלונית התחתונה נמדד מתחילת לשטוף את 1. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig5.jpg"> איור 5. הגדרת להשגחה הדמיה ו/או ישיר של התחדשות עם מיקרוסקופ זקוף. רביב כל-µL 4 תלוי coverslip, יש תא אחד בתהליך התחדשות. מים הבארות של לוח הזכוכית ספוט מגביל אידוי טיפות. התקנה זו מאפשרת בעקבות ההתחדשות של תאים מרובים במקביל. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig6.jpg"> איור 6. תמונות של Stentor בכל שלב ושלב של הלהקה membranellar והתחדשות המנגנון אוראלי. (א) שלב ראשון מאופיין על-ידי צורה דמוית דמעה תא ואת העדר הלהקה membranellar. (B) שלב 2 מתאפיינת במראה של הלהקה membranellar, מבנה מבוסס-cilia שמרביץ ללא הרף. להקות Membranellar מסומנים באמצעות קווים מקווקווים לבן פאנלים B - ד (C ו- D) שלב 3 מתאפיינת במראה של ראשית דרך הפה (מסומן בחץ). ראשית דרך הפה נראה כמו invagination בקצה האחורי של הלהקה membranellar. ראשית דרך הפה ואז לעלות כלפי החלק הפנימי של התא להפוך המנגנון אוראלי. התחדשות (E) הושלמה כאשר התא אימצה האופיינית Stentor חצוצרה צורה, המנגנון אוראלי (מסומן בחץ) הרחיב בקצה הקדמי של התא. סולם בר הוא 0.25 מ"מ. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig7.jpg"> איור 7. מוערמים תיבת מגרש מראה איך הפרופורציות של תאים בכל שלבי חידוש לאחר טיפול סוכרוז את השינויים לאורך זמן. העלילה מציגה הטרוגניות בתזמון של התחדשות שלבים בתוך אוכלוסייה של תאים ההתחדשות. "רג סיום" מצביע על השלמתו של התחדשות. מספר התאים: 28. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57759/57759video1.jpg"> וידאו 1. דוגמה של תרבות Stentor בריא. באופן כללי, אם תרבות זה מרוכז, פיצול התרבות מומלץ. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video1.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57759/57759video2.jpg"> וידאו 2. מאט Stentor עם methylcellulose. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video2.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/57759/57759video3.jpg"> וידאו 3. חיתוך Stentor. תאים בודדים ניתן לחתוך באופן ידני לחלקים מרובים תחת מערכת סטריאו לנתח מיקרוסקופ על ידי לחיצה על מחט זכוכית דרך התא. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video3.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>בעיה עם תרבות</td>
			<td>פתרון אפשרי</td>
			<td>מניעה אפשרי</td>
		</tr>
<tr>
<td>תרבות היא מוצפת rotifers או אורגניזמים גדולים אחרים.</td>
			<td>להסיר כמה שיותר Stentor ככל האפשר לתוך תבשיל תרבות חדשה. לאחר מכן לשטוף את התאים שלוש פעמים.</td>
			<td>לשטוף ביסודיות Stentor בעת קבלת אותם, אפילו בעת רכישת אותם מן הספק מסחרי.</td>
		</tr>
<tr>
<td>תרבות היא מוצפת פטריה או אורגניזמים קטנים אחרים.</td>
			<td>לזהות לפינה שם יש לפחות Stentor. באזור הזה, להסיר כמה שיותר מדיה ככל האפשר מבלי להסיר רבים Stentor ולהוסיף ב PSW חדש. מערבבים בעדינות אך ביסודיות כדי distrubute אורגניזמים הפולשים. דלג על ההזנה הבא, Stentor יאכלו אותם.</td>
			<td>לבחון את התרבות באופן קבוע ולהסיר לכלוך קטן על ידי החלפת מדיה עבור PSW טריים.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor שוכבים אחד על השני.</td>
			<td>לפצל את התרבות הריכוז הוא תאים למ"ל פחות מ-20.</td>
			<td>פיצול תרבויות לעתים קרובות יותר.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor תאים ההזדווגות.</td>
			<td>להאכיל מדי 4 ימים במקום כל 5 ימים.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>תרבות יש הרבה חומר פסולת כהה.</td>
			<td>הסר כל כך הרבה של החומר האפל, Stentor פסולת ככל האפשר מבלי להסיר את התאים. אם Stentor מחוברים לחומר האפל, פיפטה למעלה ולמטה כדי לשחרר את התאים Stentor מפסולת שלהם ולאחר מכן להסיר את התקשורת עם הפסולת מבלי להסיר את התאים. או, להסיר את Stentor ולהאכיל בהתאם פחות.</td>
			<td>הזנה Stentor 1 מ"ל פחות מזון לכל 100 מ של תרבות.</td>
		</tr>
<tr>
<td>למראה בריא (vacuolated/נפוח או מעוגל) Stentor.
</td>
			<td>להסיר כמה שיותר מדיה ככל האפשר מבלי להסיר תאים Stentor רבים ולהוסיף PSW חדש.</td>
			<td>חילופי המדיה באופן קבוע.</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1. מדריך לפתרון בעיות עבור culturing Stentor.

Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Study of Regeneration in Stentor at JoVE.com

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

שיטות המחקר של התחדשות ב- Stentor

Ciliate ענק, Stentor coeruleus, היא מערכת מצויינת ללמוד התחדשות ואף ריפוי פצעים. אנו מציגים את הליכי הקמת Stentor תרביות תאים תאים בודדים או שברי תאים, גרימת התחדשות על ידי חיתוך תאים, מבחינה כימית גרימת לרגנרציה של להקת membranellar, המנגנון אוראלי, הדמיה, וניתוח של תא התחדשות.

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

methods-for-the-study-of-regeneration-in-stentor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

11.7K Views.  University of California San Francisco. Ciliate ענק, Stentor coeruleus, היא מערכת מצויינת ללמוד התחדשות ואף ריפוי פצעים. אנו מציגים את הליכי הקמת Stentor תרביות תאים תאים בודדים או שברי תאים, גרימת התחדשות על ידי חיתוך תאים, מבחינה כימית גרימת לרגנרציה של להקת membranellar, המנגנון אוראלי, הדמיה, וניתוח של תא התחדש...

Video: Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

התרמת התחדשות פוליפ שלמה מן Aboral Physa של שושנת ים הכוכבת<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Despite the considerable progress made in the stent development in the last decades, cardiovascular diseases remain the main cause of death in western countries. Beside the benefits offered by the development of different drug-eluting stents, the coronary revascularization bears also the life-threatening risks of in-stent thrombosis and restenosis. Research on new therapeutic strategies is impaired by the lack of appropriate methods to study stent implantation and restenosis processes. Here, we describe a rapid and accessible procedure of stent implantation in mouse carotid artery, which offers the possibility to study in a convenient way the molecular mechanisms of vessel remodeling and the effects of different drug coatings.

A model of stent implantation in mouse carotid artery is described. Compared to other similar methods, this procedure is very rapid, simple and accessible, offering the possibility to study in a convenient way the vascular wall reaction to different drug-eluting stents and the molecular mechanisms of restenosis.

דגם Murine של השתלת תומכן בעורק הראשי לחקר restenosis

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Medicine

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

Here we present a protocol that is based on spinal cord slices cultured on multi-electrode arrays to study functional regeneration of propriospinal connections in vitro.

חוקר התחדשות פונקציונלית בחוט השדרה שיתוף תרבויות Organotypic גדלו על מערכים רב-אלקטרודה

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

Neuroscience

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

Immobilization Planarian, הקרנה חלקית, השתלת רקמות

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

Biology

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Assay עבור התחדשות קו לרוחב בדג הזברה למבוגר

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

A Standardized Murine Model of Extracorporeal Shockwave Therapy Induced Soft Tissue Regeneration

Shockwave therapy (SWT) shows promising regenerative effects in several different tissues. However, the underlying molecular mechanisms are poorly understood. Angiogenesis, a process of new blood vessel formation is a leading driver of regeneration in softer tissues as well as a recently discovered effect of SWT. How the mechanical stimulus of SWT induces angiogenesis and regeneration and which pathways are involved is not fully understood. To further improve the clinical use of SWT and gain valuable information about how mechanical stimulation can affect tissue and tissue regeneration, a standardized model of SWT is needed. We, hereby, describe a standardized, easy to implement murine model of shockwave therapy induced regeneration, utilizing the hind-limb ischemia model.

This article describes a standardized murine model of tissue regeneration via shockwave treatment.

Shockwave therapy (SWT) shows promising regenerative effects in several different tissues. However, the underlying molecular mechanisms are poorly ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that has emerged as an essential model for regeneration studies. Little is known about how revascularization occurs in the context of regeneration in these animals. Here we report a simple method for visualization of the vasculature in axolotl via perfusion of 1,1&#8217;-Dioctadecy-3,3,3&#8217;,3&#8217;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI is a lipophilic carbocyanine dye that inserts into the plasma membrane of endothelial cells instantaneously. Perfusion is done using a peristaltic pump such that DiI enters the circulation through the aorta. During perfusion, dye flows through the axolotl&#8217;s blood vessels and incorporates into the lipid bilayer of vascular endothelial cells upon contact. The perfusion procedure takes approximately one hour for an eight-inch axolotl. Immediately after perfusion with DiI, the axolotl can be visualized with a confocal fluorescent microscope. The DiI emits light in the red-orange range when excited with a green fluorescent filter. This DiI perfusion procedure can be used to visualize the vascular structure of axolotls or to demonstrate patterns of revascularization in regenerating tissues.

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Using a lipophilic 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) staining technique, Ambystoma mexicanum can undergo vascular perfusion to allow for easy visualization of the vasculature.

DiI זלוף כשיטת ויזואליזציה של כלי הדם<em&gt; Ambystoma מקסיקניום</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds of genes&#8212;many not associated with the oral apparatus (OA)&#8212;that are differentially regulated in phases throughout the regeneration process. It was hypothesized that this systemic reorganization and mobilization of cellular resources towards growth of a new OA will lead to observable changes in movement and behavior corresponding in time to the phases of differential gene expression. However, the morphological complexity of S. coeruleus necessitated the development of an assay to capture the statistics and timescale. A custom script was used to track cells in short videos, and statistics were compiled over a large population (N ~100). Upon loss of the OA, S. coeruleus initially loses the ability for directed motion; then starting at ~4 h, it exhibits a significant drop in speed until ~8 h. This assay provides a useful tool for the screening of motility phenotypes and can be adapted for the investigation of other organisms.

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

We present a protocol for the characterization of motility and behavior of a population of hundred micron- to millimeter-sized cells using brightfield microscopy and cell tracking. This assay reveals that Stentor coeruleus transitions through four behaviorally distinct phases when regenerating a lost oral apparatus.

ניתוח דפוסי תנועתיות של סטנטור במהלך ואחרי התחדשות מנגנון הפה באמצעות מעקב אחר תאים

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds ...

שיטות המחקר של התחדשות ב- Stentor

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST