Name: transient expression in nicotiana benthamiana leaves for triterpene production at a preparative scale
Uploaded: 2018-08-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי נוריץ מחקר פארק Studentship (הבן), הנדסת הג'וינט ואת המועצה מחקר מדעי/Biotechnological במימון מחקר מדעי ביולוגי, המועצה BBSRC OpenPlant סינתטי ביולוגיה המרכז לחקר הענק (BB / L014130/1) (M.J.S., ואחרות); ג'ון אינס מרכז הידע Exchange ומסחור הענק (BB/KEC1740/1) (בי); ואת המענק תוכנית אסטרטגית BBSRC מכון 'מולקולות מן הטבע' (BB/P012523/1) וקרן ג'ון אינס (ואחרות). ברצוננו להודות ג'ורג Lomonossoff למתן את הווקטורים pEAQ אנדרו דייוויס לצילום.

<ol>
	<li>Thimmappa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triterpene+biosynthesis+in+plants.">Triterpene biosynthesis in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 65, 225-257 (2014).</li><li>Seki, H., Tamura, K., Muranaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P450s+and+UGTs:+Key+players+in+the+structural+diversity+of+triterpenoid+saponins.">P450s and UGTs: Key players in the structural diversity of triterpenoid saponins.</a> Plant Cell Physiology. 56 (8), 1463-1471 (2015).</li><li>Roy, A., Saraf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limonoids:+overview+of+significant+bioactive+triterpenes+distributed+in+plants+kingdom.">Limonoids: overview of significant bioactive triterpenes distributed in plants kingdom.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 29 (2), 191-201 (2006).</li><li>Kamble, S. M., Goyal, S. N., Patil, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+pentacyclic+triterpenoids+as+adjuvants+in+cancer+chemotherapy:+a+review.">Multifunctional pentacyclic triterpenoids as adjuvants in cancer chemotherapy: a review.</a> RSC Advances. 4 (63), 33370-33382 (2014).</li><li>Liby, K. T., Sporn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+oleanane+triterpenoids:+multifunctional+drugs+with+a+broad+range+of+applications+for+prevention+and+treatment+of+chronic+disease.">Synthetic oleanane triterpenoids: multifunctional drugs with a broad range of applications for prevention and treatment of chronic disease.</a> Pharmacological Reviews. 64 (4), 972-1003 (2012).</li><li>Yadav, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+inflammatory+pathways+by+triterpenoids+for+prevention+and+treatment+of+cancer.">Targeting inflammatory pathways by triterpenoids for prevention and treatment of cancer.</a> Toxins. 2 (10), 2428-2466 (2010).</li><li>Christensen, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ginsenosides+chemistry,+biosynthesis,+analysis,+and+potential+health+effects.">Ginsenosides chemistry, biosynthesis, analysis, and potential health effects.</a> Advances in Food and Nutrition Research. 55, 1-99 (2009).</li><li>Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+synthetic+biology+platform+for+rapid+access+to+gram-scale+quantities+of+novel+drug-like+molecules.">A translational synthetic biology platform for rapid access to gram-scale quantities of novel drug-like molecules.</a> Metabolic Engineering. 42, 185-193 (2017).</li><li>Andersen-Ranberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+landscape+of+diterpene+structural+diversity+through+stereochemically+controlled+combinatorial+biosynthesis.">Expanding the landscape of diterpene structural diversity through stereochemically controlled combinatorial biosynthesis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (6), 2142-2146 (2016).</li><li>Peyret, H., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pEAQ+vector+series:+the+easy+and+quick+way+to+produce+recombinant+proteins+in+plants.">The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants.</a> Plant Molecular Biology. 83, 51-58 (2013).</li><li>Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pEAQ:+versatile+expression+vectors+for+easy+and+quick+transient+expression+of+heterologous+proteins+in+plants.">pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants.</a> Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).</li><li>Sainsbury, F., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+high-level+and+rapid+transient+protein+production+in+plants+without+the+use+of+viral+replication.">Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication.</a> Plant Physiology. 148 (3), 1212-1218 (2008).</li><li>Voinnet, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+transient+expression+system+in+plants+based+on+suppression+of+gene+silencing+by+the+p19+protein+of+tomato+bushy+stunt+virus.">An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus.</a> The Plant Journal. 33 (5), 949-956 (2003).</li><li>Holtz, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commercial-scale+biotherapeutics+manufacturing+facility+for+plant-made+pharmaceuticals.">Commercial-scale biotherapeutics manufacturing facility for plant-made pharmaceuticals.</a> Plant Biotechnology Journal. 13 (8), 1180-1190 (2015).</li><li>Bucar, F., Wubea, A., Schmidb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+product+isolation+-+how+to+get+from+biological+material+to+pure+compounds.">Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds.</a> Natural Product Reports. 30, 525-545 (2003).</li><li>Kaufmann, B., Christen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+extraction+techniques+for+natural+products:+microwave-assisted+extraction+and+pressurised+solvent+extraction.">Recent extraction techniques for natural products: microwave-assisted extraction and pressurised solvent extraction.</a> Phytochemical Analysis. 13 (2), 105-113 (2002).</li><li>Larsen, E., Christensen, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+saponification+method+for+the+quantitative+determination+of+carotenoids+in+green+vegetables.">Simple saponification method for the quantitative determination of carotenoids in green vegetables.</a> Journal of Archaeological and Food Chemistry. 53 (17), 6598-6602 (2005).</li><li>Sainsbury, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+virus-derived+system+to+manipulate+plant+natural+product+biosynthetic+pathways.">Using a virus-derived system to manipulate plant natural product biosynthetic pathways.</a> Methods Enzymology. , 185-202 (2012).</li><li>Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Cloning+using+in+vitro+site-specific+recombination.">DNA Cloning using in vitro site-specific recombination.</a> Genome Research. 10, 1788-1795 (2000).</li><li>Ting, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNARE-RNAi+results+in+higher+terpene+emission+from+ectopically+expressed+caryophyllene+synthase+in+Nicotiana+benthamiana.">SNARE-RNAi results in higher terpene emission from ectopically expressed caryophyllene synthase in Nicotiana benthamiana.</a> Molecular Plant. 8, 454-466 (2015).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+production+of+artemisininin+in+Nicotiana+benthamiana+is+boosted+by+a+specific+lipid+transfer+protein+from+A.+annua.">Transient production of artemisininin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua.</a> Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).</li><li>Nielsen, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redirecting+photosynthetic+reducing+power+toward+bioactive+natural+product+synthesis.">Redirecting photosynthetic reducing power toward bioactive natural product synthesis.</a> ACS Synthetic Biology. 2, 308-315 (2013).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoterpene+biosynthesis+potential+of+plant+subcellular+compartments.">Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments.</a> New Phytologist. 209, 679-690 (2016).</li><li>Ferrero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+morphogenesis+of+the+endoplasmic+reticulum+driven+by+the+membrane+domain+of+3-hydroxy-3-methylglutaryl+Coenzyme+A+reductase+in+plant+cells.">Proliferation and morphogenesis of the endoplasmic reticulum driven by the membrane domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A reductase in plant cells.</a> Plant Physiology. 168, 899-914 (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

הסתננות ואקום גבוה-דרך-הניח מאפשרת פרוטוקול זה לשמש באופן שגרתי במעבדה שלנו לייצור מיכשור וציוד של תרכובות טריטרפן עניין ליישומים שונים במורד הזרם. מנגנון ואקום הסתננות המתוארים כאן בקלות משוכפלת. תוספת של המאגר ואקום, מומלץ להקטין את הזמן הנדרש כדי למשוך את הואקום הכרחי, אולם ניתן פשוט מחדש תנור ואקום יאומתו כמו תא הסתננות. הגנה על משאבת ואקום באמצעות תוספת של הקבל מתאימים תיאורטית הגיונית, אבל במעבדה שלנו אנחנו גילינו שזה יהיה מיותר.
כיסוי הסתננות בסכנה אם העלים לא שקועים לחלוטין ההשעיה הסתננות. בעיה זו ממוזער על-ידי הבטחת כי הרמה של המתלה מגיע לפני השטח העליון של בעל המפעל, כי בעל המפעל הוא צר על האמבטיה הסתננות. הערה מאיור 2 כי המשטח העליון של בעל המפעל שקוע לאמבטיה הסתננות כאשר במקום. זו מושגת על ידי פאנלים על הקצוות האמצעי של בעל אשר מהווים נקודת העיגון עם החלק העליון של האמבטיה הסתננות. המתלה הסתננות יחייב תוספות תקופתיים כדי לשמור על רמת ההשעיה. זו מושגת בצורה הטובה ביותר על ידי תוספת של חדירת עודפי ההשעיה כדי למנוע צמצום הדרגתי של ה OD600 במהלך החדירה batch-wise גדול. עם זאת, בידיים שלנו, החלפת מים לא נראה יש השפעה ניכרת על התשואות הצפויה בקנה מידה מפוח, אמנם זה לא היה quantitively חקר. ועמדו להסתנן כמה צמחים של אצווה אחת של הסתננות ההשעיה היא עדיין שאלה פתוחה. אנחנו באופן שגרתי לחדור בין צמחים 100 ו-200 עם אצווה בודדת של הסתננות ההשעיה. בנוסף, זה נורמלי עבור אדמה תסנן לתוך ההשעיה חדירה במהלך תהליך הסתננות. זה לא נמצאה השפעה ניכרת על הסתננות היעילות.
במשך הקציר. זה רצוי (אך לא קריטית) כדי לקצור רק העלים היו שחדרו (כמה עלים תהיה גדול שלאחר חדירה). בציר סלקטיבי מונע דילול עם רקמת יצרנית, אשר אחרת להגביר את היחס של זיהומים אנדוגניים יחסית למתחם של ריבית. זה יש השפעה הנומינלית על הקלות של טיהור במורד הזרם ומגביר את קנה המידה של תהליכים אלה. בעת שימוש tHMGR כדי להגביר את אספקת קודמן, הפנוטיפ necrosed נצפית לעיתים קרובות לפתח על התקופה שלאחר הסתננות צמיחה. זה נורמלי, למעשה מסייע בציר סלקטיבי, תהליך הייבוש במורד הזרם. ניתן לאחסן את האבקה עלים יבשים בדרך כלל במיכל אטום במקום קריר, יבש, חשוך, אבל באופן אידיאלי desiccator תחת ואקום. זה תלוי היציבות של המתחם של עניין. לנקוט זהירות אם בוחר לאחסן במקפיא-80 ° C. להבטיח את יבשים העלים הם במיכל עמיד למים, על הסרה של אחסון, לאפשר את המכל כדי לחמם לטמפרטורת החדר לפני הפתיחה. כך תגרום rewetting של העלים, הפרעה עיבוד מטה-stream.
השלבים שלאחר הקציר של פרוטוקול זה ניתנים להמחשה, וניסיון כדי לסייע החוקרים האלה תהיה מוגבלת כימיה מעשית. הם הרבה מכדי רבים טכניקות החילוץ/טיהור אחרות מוצר טבעי. כמפורט במבוא, פסי יתרונות רבים, אולם הבירה עלות המנגנון PSE זמינים מסחרית ייתכן שהעלות ולאחר זה לא חיוני. טיפול בסיסי חילוף יונים-שרף היא שיטה מאוד נוח להחליף המסורתי סיבון ואחריו נוזלי/נוזל למחיצות. עם זאת, היא לא מתאימה עבור מוצרים המכילים חומצה קרבוקסילית קבוצות או קבוצות פונקציונליות זה הידרוליזה בתנאים בסיסיים, כגון אסטרים. מוצרים אלה יהיה צפוי יישמרו על שרף חילוף יונים בסיסיים. עם זאת, יש פוטנציאל לנצל את זה עבור לכידה, לשחרר את ההליך (לא מתועדים כאן). איפה סיבון מסורתי יהיה הולם, טיפול בסיסי חילוף יונים-שרף מגישה כתחליף נוח. כבר מצאו את שיטת כרומטוגרפיה שמתואר בשלב 9, ניתן להכליל עבור תרכובות המתואר באיור3. עם זאת, תרכובות של קוטביות מוגברת עשוי לדרוש 100% אתיל אצטט • תנאי תקופה ארוכה. התייחסות צעד 9.2, טיהור בסדר במורד הזרם הוא ספציפי מורכבים לחלוטין, הוא גם תלוי בקנה מידה. סיבובים חוזרים ונשנים של כרומטוגרפיה פלאש מידה קטן יותר עם מעברי צבע ממוטב, מספיקה בדרך כלל להשגת טוהר המתאים לניתוח NMR. על קשקשים גדולים, התגבשות לעתים קרובות חלופה נוחה. במקרים קשים, מפוח או מפוח למחצה ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) יכול להיות מועסק בהתאם לכמות הרצויה של המתחם מבודד. דוגמאות של תהליכי טיהור במורד הזרם עבור מגוון של תרכובות נציג ניתן למצוא במקום8.
בפרוטוקול הנוכחי, כפי שהוצג כאן, משמש באופן שגרתי במעבדה שלנו, הוכיח את השירות. עם זאת, ישנו טווח עדיין משמעותיים נוספים מיטוב של פלטפורמת הביטוי. עבודה מתמשכת במעבדה שלנו לחקור איך נוסף מסלול הנדסה, שליטה דיפרנציאלית על רמות ביטוי החלבון יכול לשפר טריטרפן הפקה נוספת, תוך תיווכה רעילות לתאים המארח. יש גם פוטנציאל לחקור המניפולציה של20,של מערכות תחבורה תאיים21, הכיוון של אנזימים תאים סלולריים שונים22,23, השדרות אשר יכול לשפר היעילות של אירועי חמצון מרובים. גם ניתן לסייר היתרונות הפוטנציאליים לפעילות שינוי המבנה הבסיסי של organelles מפתח. לדוגמה, ביטוי של התחום ממברנה של תודרנית לבנה HMGR נצפתה לזירוז היפרטרופיה של רשתית תוך-פלזמית צמחים24; אתר המפתח לפעילות CYP450. פרוטוקול זה הוא אידיאלי עבור הייצור של מיליגרם ל בקנה מידה גרם כמויות של מוצרים טריטרפן, יכול להיות מועסק במסגרת מחקר כדי לגשת תרכובות למחקר במורד הזרם (למשל, חקר מבנה-פעילות שיטתית קשרי הגומלין ולאחר חקירות ראשוני למאפיינים pharmacodynamic ו פרמוקוקינטיים של אחרים-ריאקטיבים עניין קליניים). עם זאת, הפלטפורמה היא לינארית, באופן אמין ומדרגי פשוט על-ידי הגדלת מספר צמחים בשימוש, ומעשיות של ביטוי חולף דרך agroinfiltration הוכח בקנה מידה תעשייתי לייצור של חלבונים התרופות 14, לפיכך יש פוטנציאל עבור הפלטפורמה שיורחבו לייצור מסחרי של triterpenes בעלי ערך גבוה. לחלופין, זה גם אפשרי לדמיין את הייצור של transformants יציב נושאת את המעבר biosynthetic הוחלף נגזר multigene הגדול יצורים עילאיים הרצון גיבוש, המאפשר גידול המוני והמשיך "חקלאות" של הטרנסגניים benthamiana ש זנים ייצור תרכובות שונות של ערך מסחרי.

Triterpenes הם אחד מהגדולים רוב המשפחות מגוונות מבחינה מבנית של מוצרים טבעיים מהצומח. למרות המגוון העצום שלהם, כל המוצרים הטבעיים טריטרפן הסברה להיגזר את אותו קודמן לינארית 2, 3-oxidosqualene, תוצר של השביל mevalonate בצמחים. Cyclization של 2, 3-oxidosqualene יזם, נשלט על-ידי משפחה של אנזימים כינה oxidosqualene cyclases (OSCs). שלב זה cyclization מייצג את הרמה הראשונה של גיוון, עם מאות פיגומים טריטרפן שונים שיש דווחו טבע1. פיגומים אלו מגוונים נוספים על-ידי התאמת אנזימים כולל אך לא מוגבל, ציטוכרום p450s1,(CYP450s)2. מסלולים biosynthetic הוחלף נגזר כזה יכול להוביל מורכבות עצומה, לפעמים וכתוצאה מכך המוצרים הסופיים אשר בקושי לזיהוי מ טריטרפן האב. לדוגמה, מבנה מורכב אזדרכטין limonoid חזק של חרקים, antifeedant הוא האמין שואבים טריטרפן tetracyclic של tirucallane סוג3.
רבים נגזר טריטרפן מוצרי טבע, אפילו אלה עם האב יחסית שלא שונתה פיגומים, הוכחו בעלי פעילות ביולוגית רלוונטית מסיבות בריאותיות4,5,6,7. עם זאת, עד כה פוטנציאל זה לא תורגמה שפע של סמים נגזר טריטרפן במרפאה. . זה ניתן לטעון (לפחות חלקית) תוצאה של גישה מוגבלת סינתטי מעשי ברמה זו של המתחם, בעיה אשר יכולים להחניק חקר מבנה-פעילות הגומלין ופיתוח של עופרת מועמדים על ידי מסורתי מרפא כימיה זרימות עבודה.
הביטוי ארעית של אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר טריטרפן ממינים אחרים צמח benthamiana ש העלים להסיט אספקה אנדוגני של 2, 3-oxidosqualene לעבר הייצור של מוצרים חדשים בעלי ערך גבוה טריטרפן (איור 1). תהליך זה יכול לשמש באופן פונקציונלי לאפיין את המועמד אנזימים, בנייה מחדש של מסלולים biosynthetic הוחלף נגזר של מטבוליטים חשובים המתרחשים באופן טבעי. באותה מידה, אפשר גם לנצל את זה ב biosynthetic הוחלף נגזר גישות קומבינטורית. לייצר מוצרים חדשניים טריטרפן, אסטרטגיה שיכול לגרום ספריות של תחליפי הקשורות מבנית, המאפשר חקר הקשרים מבנה-פעילות שיטתית מעופרת פעילים ביולוגית תרכובות8,9.
Agroinfiltration הוא אמצעי יעיל ופשוט של השגת ביטוי ארעי העלים benthamiana ש . התהליך כרוך החדירה של עלים עם השעיה של tumefaciens א נושאת את construct(s) בינארי ביטוי של עניין. זו מושגת באמצעות הפעלת לחץ שכופה את הנוזל דרך הפיוניות, האוויר במרחב המערכת, והחלפתו המתלה tumefaciens א . החיידק להעביר את T-DNAs בהתאמה הפנים של תאי הצמח, והתוצאה היא ביטוי חלבון מקומי ולא ארעית בתוך רקמת העלה הסתנן.
תוך כדי כל וקטור בינארי מתאימים עבור יצירת הצמחים הטרנסגניים עשוי להיות מועסק לביטוי ארעי, אנו מנצלים לוביה פסיפס וירוס CPMV, נגזר Hypertranslational (HT) חלבון ביטוי מערכת10, 11. במערכת זו הגן עניין משני צדדיה אזורים לא מתורגם (UTR) מ CPMV RNA-2. 5' UTR מכיל שינויים וכתוצאה מכך רמות גבוהות מאוד של חלבון תרגום עם אין הסתמכות על שכפול ויראלי12. שיטה זו פותחה לתוך הסדרה וקטור בינארי קל ומהירה (pEAQ) הכוללת רקומבינציה בייעודי לאתר שיבוט תואם פרוטוקול בונה (pEAQ -HT- DEST)10,11. רוב pEAQ וקטורים מכילים גם עם עגבניות פעלולים בושי נגזר וירוס P19 שתיקה משתיק קול ג'ין13 בתוך החלק T-DNA בקלטת ביטוי, אשר עוקף את הצורך coinfiltrate זן P19 נושא נפרד, ונותנת לו מאוד ביטוי חלבון ברמה גבוהה במארח הצמח תא10,11.
שימוש benthamiana (ש ע) כמו מארח ביטוי יש יתרונות מסוימים בעת עבודה עם מסלולים biosynthetic הוחלף נגזר הצמח. הארכיטקטורה תא תומך מיסודו mRNA המתאים לעיבוד חלבון, ואת מידור תקין, בנוסף פו-טי של אנזימים הדרושים לעבודה, reductases (עבור CYP450s) ו מבשרי מטבולית. מקור הפחמן הוא הפוטוסינתזה; לפיכך, ניתן פשוט לגדל צמחים קומפוסט איכותי, המחייב רק מים, CO2 (מן האוויר), ואור שמש כקלט. הפלטפורמה היא גם מאוד נוח עבור ביטוי משותף של צירופים שונים של חלבונים, כמו זה ניתן להשיג facilely באמצעות חדירה שיתוף של זנים שונים של tumefaciens א, שלילת הצורך לבנות ביטוי multigene הגדול יצורים עילאיים גדול קלטות. יתר על כן, התהליך וניתן באופן ליניארי ובאמינות לשנותם פשוט על-ידי הגדלת מספר צמחים המשמשים את הניסוי.
העבודות הקודמות במעבדה שלנו הוכיחה את התועלת של הפלטפורמה עבור ניסויים בקנה מידה מפוח. זה כלל את הכנת triterpenes הרומן לשימוש אתריים מבחני בקנה מידה למעלה כדי להשיג גרם כמויות של מוצר בודד. יתר על כן, ניתן להגדיל הצטברות של מוצרים טריטרפן heterogenous כמה לקפל על ידי ביטוי משותף של טופס N-מסוף-קטום, משוב-רגישות של הידרוקסי 3, 3-methyglutary-קואנזים רדוקטאז (tHMGR), הגבלת קצב נגד הזרם אנזים מסלול mevalonate8.
המפתח ניסויים מפוח בקנה מידה כזה הוא היכולת בנוחות עד בקנה מידה תהליך הסתננות. בניסוי טיפוסי, עשרות עד מאות צמחים עשוי להידרש כדי להשיג את המטרה כמות המוצר מבודד. הסתננות עלים בודדים באופן ידני (באמצעות מזרק מיותר) היא מבצעית תובעניים, וצורך לעתים קרובות מדי, עיבוד בשיטה זו מעשי עבור הסולם שגרתית. הסתננות ואקום מציעה יתרונות חדירה יד, הוא אינו תלוי רמת המיומנות של המפעיל ומאפשר החדירה של אזור רחב יותר של פני העלים. הליך זה משמש מסחרית לייצור בקנה מידה גדול של חלבונים התרופות14. פרוטוקול זה מנצל מכשירים חדירה ואקום בקלות ניתן לשכפול, אשר יכול להיות בנוי חלקים זמינים מסחרית. דבר זה מאפשר חדירה בו זמנית של עד 4 צמחים, מנקר מהירה ומעשית batch-wise חדירה של מאות צמחים בתקופה קצרה של זמן (איור 2 א -2b). מנגנון ואקום הסתננות מורכב תנור ואקום המהווה תא חדירה (2f איור). התנור מחובר משאבה באמצעות מאגר ואקום. זה מפחית באופן משמעותי את הזמן הנדרש כדי להשיג את הואקום הרצויה בבית הבליעה הסתננות. צמחים מאובטח ב בעל העידו והפכתי לתוך אמבט מים מפלדת 10 L מלא עם הבולם tumefaciens א (איור 2 א -2 c). טבילה מלאה חלקים אווירי של הצמחים חשוב חדירה יעיל. המים הרותחים הוכנסה בתוך תא חדירה (איור דו-ממדי -2e), את ואקום להחיל כדי לצייר את האוויר מתוך הרווחים interstitial עלה. ברגע הלחץ הופחת 880 mbar (תהליך אשר לוקח כ 1 דקות) תא הסתננות הוא החזיר במהירות הלחץ האטמוספרי 20-30 s על-ידי פתיחת שסתום כניסת את התנור, ואז חדירה הושלם.
חמישה ימים לאחר חדירה חומר צמחי מוכן עבור חילוץ האיסוף ובעקבות ובידוד של המוצר הרצוי. מנקודה זו התהליך הוא פשוט אחד מוצר טבעי מיצוי וטיהור מחומר עלה, זרימת עבודה המוכרת כל כימאי מוצר טבעי. שיטות שונות רבות הראשונית מיצוי וטיהור הבאים קיימים15. הבחירה המתאימה ביותר של שיטות בדיוק את אותם התנאים בשימוש תלויה מאוד התכונות הכימיות מסוים של המתחם של עניין, בנוסף זמינותו של מיומנויות ו/או ציוד. . זה לא ניתן לכלול בפרוטוקול זה שיטה להכליל באופן מלא, שלב אחר שלב העיבוד במורד הזרם של חומר צמחי שנקטפו עלה על מוצר בודד יכול להיות אחריו באופן עיוור על כל מוצר טריטרפן עניין, וגם זה יהיה מתאים כדי לנסות לעשות זאת. עם זאת, פרוטוקול זה יספק סקירה כללית של העבודה הבסיסי בשימוש המעבדה שלנו כמה שיטות בשלבים המוקדמים של התהליך, אשר מניסיוננו הוכיחו להכליל למוצרים טריטרפן אגליקון ביותר מחומצן. זה כולל שתי טכניקות נדיר יחסית, כלומר, חילוץ הממס בלחץ (פסי), ו שיטה נוחה שלב heterogenous להסרת כלורופיל באמצעות שרף יונים בסיסיים מאוד.
פסי היא טכניקה יעילה במיוחד לצורך הוצאת מולקולות אורגניות קטן ממטריצות מוצק. עקירות נעשות תחת לחץ (ca. 100-200 bar), היתרון העיקרי להיות היכולת להשתמש להקלה טמפרטורות אשר חורגים הרתיחה הצבע של הממס החילוץ. זה יכול להפחית באופן משמעותי את הזמן ואת כמות הממס הדרוש להשגת הוצאה ממצה, לעומת טכניקות אחרות ממס חם כגון refluxing פשוטה או עקירות Soxhlet16. מסחרי ספסל-העליון PSE כלים זמינים, אשר לנצל את תאי החילוץ להחלפה, הממס אוטומטיות טיפול חימום, ניטור. זה הופך את הטכניקה הזו מאוד נוח. . זה גם ניתן לטעון מסוכנים פחות, במיוחד עבור אופרטורים בעלי ניסיון בכימיה המעשית מוגבלת.
סיבון של תמציות עלה גולמי תחת ריפלוקס ואחריו נוזלי/נוזל למחיצות היא טכניקה נפוצה להסרת בצובר chlorophylls לפני טיהור עוקבות או ניתוח. עם זאת, זה לעיתים קרובות מבצעית דורשת הרבה על סולמות גדול יותר. יתר על כן, זיהוי של ממשק או אובדן המוצר עקב היווצרות של אמולסיות יכול להיות בעייתי. השימוש בחום בסיסי חילוף יונים-שרפים לבצע הידרוליזה heterogenous שלב יכול לשמש כתחליף נוח. החלק פיגמנט של כלורופיל הידרוליזה נשאר מודבקת שרף, ו ניתן להסיר רק באמצעות סינון. פרוטוקול זה מנצל עיבוד מפוח בקנה מידה של ההליך האנליטי שדווחה בעבר17 מעסיקה שרף יונים בסיסיים זמינים מסחרית.
להלן נתאר פרוטוקול מפורט, מהיר ומדויק לייצור בקנה מידה מפוח triterpenes ניצול פלטפורמה זו מבוססת על צמחים. פרוטוקול זה משמש באופן שגרתי במעבדה שלנו כדי להכין עשרות למאות מיליגרם של המוצר טריטרפן מבודדים עבור יישומים כגון אפיון מבניים על-ידי תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה ו / או המשך מחקר בפונקציונלי מבחני.

<table><tbody><tr><td>GC-MS instrument</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler suitable for performing PCR reactions</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 100 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 10 &amp;micro;L, and 2 &amp;micro;L )</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/&gt; 15000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/&gt; 4000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/&gt; 4000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Standing incubator</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge bottles (1 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum infiltration apparatus</td><td>bespoke</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>9 x 9 cm plant pots</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Freeze drying apparatus (=/&gt; 8 litre condenser capacity)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument)</td><td>Buchi</td><td>SpeedExtractor E-914</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator apparatus</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Spatulas (assorted sizes)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Analytical balance (5 figures)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Balance (2 figures)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>A -80 freezer</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument</td><td>Biotage</td><td>ISO-1EW</td><td></td></tr><tr><td>Safety glasses</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Lab coat</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette tips (Sizes : 1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 100 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 10 &amp;micro;L, and 2 &amp;micro;L )</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Transfer pipettes (size 2 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (Size: 100 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage&amp;reg; SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges</td><td>Biotage</td><td>FSK0-1107-0100</td><td></td></tr><tr><td>HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable purple nitrile gloves</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Top filter for E-914, cellulose</td><td>Buchi</td><td>51249</td><td></td></tr><tr><td>Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber</td><td>Buchi</td><td>11055932</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quartz sand, 0.3 - 0.9 mm</td><td>Buchi</td><td>37689</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545 (diatomaceous earth)</td><td>Simga-Alrich</td><td>22140-1KG-F</td><td></td></tr><tr><td>Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm)</td><td>Merck</td><td>1.09385.5000</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Simga-Alrich</td><td>208337-100G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Simga-Alrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;5&amp;rsquo;-dimethoxy-4&amp;rsquo;-acetophenone (acetosyringone)</td><td>Simga-Alrich</td><td>D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60836</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Gibco</td><td>11815-032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Simga-Alrich</td><td>S6501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>MP biomedicals</td><td>190057</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE gel</td><td>Melford</td><td>MB1203</td><td></td></tr><tr><td>LB broth Millar</td><td>Simga-Alrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Simga-Alrich</td><td>A5306-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Alrich</td><td>M2773-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Alrich</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ambersep&amp;reg;&amp;nbsp;900 hydroxide (basic ion exchange resin)</td><td>Sigma-Alrich</td><td>06476-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Fisher</td><td>H/0406/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher</td><td>E/0900/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Fisher</td><td>D/1852/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>M/4056/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma-Alrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20821-330</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q water</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F1 Compost</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F2 Compost</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit).</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td><td>Supplier New England Biolabs Ltd</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>pEAQ-HT-DEST1 vector</td><td>Lomonossoff laboratory John Innes Center</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>Thermo-Fisher</td><td>pDONR207</td><td></td></tr><tr><td>A. tumefaciens LBA4404</td><td>Thermo-Fisher</td><td>18313015</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M7822</td><td></td></tr><tr><td>PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE</td><td>New England Biolabs Ltd</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP SET 100mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>RNEASY PLANT MINI KIT</td><td>Qiagen Ltd</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNASE-FREE DNASE</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Fisher</td><td>10308632</td><td></td></tr><tr><td>Trytone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana seeds</td><td>any reputable supplier</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

transient expression in nicotiana benthamiana leaves for triterpene production at a preparative scale

Triterpenes הם אחד מהגדולים רוב המשפחות מגוונות מבחינה מבנית של מוצרים טבעיים מהצומח. רבים נגזרים טריטרפן הוכחו בעלי פעילות ביולוגית רלוונטית מסיבות בריאותיות. עם זאת, עד כה פוטנציאל זה לא תורגמה שפע של סמים נגזר טריטרפן במרפאה. . זה ניתן לטעון (לפחות חלקית) תוצאה של גישה מוגבלת סינתטי מעשי ברמה זו של המתחם, בעיה אשר יכולים להחניק חקר מבנה-פעילות הגומלין ופיתוח של עופרת מועמדים על ידי מסורתי מרפא כימיה זרימות עבודה. למרות המגוון העצום שלהם, triterpenes כל נגזרים מתוך הקדמה ליניארי יחיד, 2, 3-oxidosqualene. ביטוי heterologous ארעי של אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר benthamiana ש להסיט אספקה אנדוגני של 2, 3-oxidosqualene לעבר הייצור של מוצרים בעלי ערך גבוה טריטרפן חדשים לא המיוצרים באופן טבעי על-ידי מחשב מארח זה. אגרו-חדירה הוא אמצעי יעיל ופשוט של השגת ביטוי benthamiana שארעית. התהליך כרוך חדירה של צמח עלים עם השעיה של Agrobacterium tumefaciens נושאת את construct(s) ביטוי של עניין. הסתננות שותף נוסף tumefaciens א זן נושאת לבנות ביטוי קידוד מגבירה את אנזים זה מגביר אספקת קודמן באופן משמעותי את התשואות. לאחר תקופה של חמישה ימים, החומר העלה הסתנן ניתן לקצור ולעבד לחלץ ולבודד את המוצר טריטרפן וכתוצאה מכך. זהו תהליך זה באופן ליניארי ובאמינות מדרגיים, פשוט על ידי הגדלת מספר צמחים המשמשים את הניסוי. בזאת הוא תיאר פרוטוקול לייצור מיכשור וציוד בקנה מידה מהירה triterpenes ניצול פלטפורמה זו מבוססת על צמחים. הפרוטוקול מנצל מכשירים חדירה ואקום בקלות ניתן לשכפול, אשר מאפשר חדירה בו זמנית של עד ארבעה צמחים, ומאפשרת חדירה batch-wise של מאות צמחים בתקופה קצרה של זמן.

התשואות מבודד טיפוסי תלויות השילוב אנזים/אנזים תחת חקירה, את היציבות הכימית של המתחם היעד, איך מאתגר את תהליך החיטוי היה. בעבר דיווחנו התשואות מבודד של β-amyrin נגזרים מן הניסויים שלנו ביוסינטזה קומבינטורית ועד 0.12 מ ג 3.87 גרם של יבש benthamiana ש אבקה. תרכובות אלו נע באופן נרחב רמת חמצון, וכללה שילובים לא טבעי של אנזימים (איור 3)8. פרוטוקול זה משמש באופן שגרתי במעבדה שלנו כדי לייצר עשרות או מאות מיליגרם של המוצר מטוהרים עבור אפיון מבניים NMR ספקטרוסקופיה ו מבחני פונקציונלי במורד הזרם. גם הראו את התועלת מפוח של פלטפורמה זו על-ידי הפקת 0.8 גר' טריטרפן לגרדום β-amyrin-טוהר של יותר מ-98%. ניסוי זה נעשה שימוש בצמחים 459, ומייצג של התשואה מבודד של 3.3 מ ג לגרם של יבש benthamiana ש העלה אבקת8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig1.jpg"> איור 1: סיכום סכמטי. ייצוג סכמטי של תהליך ניצול הביטוי ארעית של אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר benthamiana ש עלה להטיית אנדוגני אספקה של 2, 3-oxidosqualene לכיוון לייצור מוצרים חדשים בעלי ערך גבוה טריטרפן מפוח. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig2.jpg"> איור 2: ואקום המסתנן ובניה בתהליך.) העידו צמח בעל כנף אחד מנותק. b) Bespoke צמח בעל כנפיים המצורפת. c) היפוך, ועלייתו של צמחים. d) החדרת האמבט הסתננות. e) הסתננות אמבטיה במקום בתוך תא הסתננות. המסתנן ואקום f) ביצוע: משאבת ואקום (1) (2) התקשרות של משאבת ואקום כדי מאגר ואקום (3) ואקום מאגר בידוד שסתום (4) הקשר בין מאגר ואקום שסתום היניקה (7) (5) מד הלחץ (6) אוויר קאמרית הסתננות הסתננות קאמרית (8) ואקום המאגר. g) נציג עלים מצמח אחד שחדר עם לבנות ביטוי עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לאחר חמישה ימים שלאחר הסתננות צמיחה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig3.jpg"> איור 3: בעבר דיווחו על תוצאות נציג לייצור מיכשור וציוד נגזרים β-amyrin באמצעות פרוטוקול זה8. טבלה זו הוא הורה על ידי תשואות מבודד. עמודות מעוצבים באופן מותנה עם צבע אינדיקציה הערך היחסי. אדום = גבוה, ירוק = נמוך (למרות ביניים צהוב). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale at JoVE.com

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

ארעי ביטוי טבק Benthamiana משאיר לייצור טריטרפן בקנה מידה מפוח

הביטוי heterologous ארעי של אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר benthamiana טבק העלים להסיט אספקה אנדוגני של 2, 3-oxidosqualene לעבר הייצור של מוצרים בעלי ערך גבוה טריטרפן חדשים. בזאת הוא תיאר נוהל מפורט לייצור מיכשור וציוד בקנה מידה מהירה (5 ימים) של triterpenes, תחליפי ניצול פלטפורמה חזקה זו מבוססת על צמחים.

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

transient-expression-nicotiana-benthamiana-leaves-for-triterpene

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

17.2K Views.  John Innes Centre. הביטוי heterologous ארעי של אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר benthamiana טבק העלים להסיט אספקה אנדוגני של 2, 3-oxidosqualene לעבר הייצור של מוצרים בעלי ערך גבוה טריטרפן חדשים. בזאת הוא תיאר נוהל מפורט לייצור מיכשור וציוד בקנה מידה מהירה (5 ימים) של triterpenes, תחליפי ניצול פלטפורמה חזקה זו...

Video: Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Environment

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture organisms, such as hyphae-building fungi and anaerobic bacteria, has hastened the use of recombinant technologies in this field. Plant expression methods are a desirable system for large-scale production of enzymes and other industrially useful proteins. Herein, methods for the transient expression of a fungal endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum are demonstrated. Successful protein expression is shown, monitored by fluorescence using an mCherry-enzyme fusion protein. Additionally, a set of basic tests are used to examine the activity of transiently expressed T. reesei Cel5A, including SDS-PAGE, Western blotting, zymography, as well as&#160;fluorescence and dye-based substrate degradation assays. The system described here can be used to produce an active cellulase in a short time period, so as to assess the potential for further production in plants through constitutive or inducible expression systems.

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Tobacco plants were used to produce a fungal cellulase, TrCel5A, via a transient expression system. The expression could be monitored using a fluorescent fusion protein, and the protein activity was characterized post-expression.

ביטוי של רקומביננטי Cellulase Cel5A מ<em&gt; Reesei Trichoderma</em&gt; בצמחים טבק

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the additional advantage of short development and production times, but expression levels can vary significantly between batches thus giving rise to regulatory concerns in the context of good manufacturing practice. We used a design of experiments (DoE) approach to determine the impact of major factors such as regulatory elements in the expression construct, plant growth and development parameters, and the incubation conditions during expression, on the variability of expression between batches. We tested plants expressing a model anti-HIV monoclonal antibody (2G12) and a fluorescent marker protein (DsRed). We discuss the rationale for selecting certain properties of the model and identify its potential limitations. The general approach can easily be transferred to other problems because the principles of the model are broadly applicable: knowledge-based parameter selection, complexity reduction by splitting the initial problem into smaller modules, software-guided setup of optimal experiment combinations and step-wise design augmentation. Therefore, the methodology is not only useful for characterizing protein expression in plants but also for the investigation of other complex systems lacking a mechanistic description. The predictive equations describing the interconnectivity between parameters can be used to establish mechanistic models for other complex systems.

We describe a design of experiments approach that can be used to determine and model the influence of transgene regulatory elements, plant growth and development parameters, and incubation conditions on the transient expression of monoclonal antibodies and reporter proteins in plants.

אפיון של מערכות מורכבות באמצעות העיצוב של גישת ניסויים: ביטוי חלבון חלוף בטבק כמקרה מבחן

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Bioengineering

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

גישה ניתנת להתאמה אישית לייצור אנזימטי וטיהור המוצרים הטבעיים של Diterpenoid

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Biology

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

אופטימיזציה וניצול<em&gt; Agrobacterium</emייצור חלבון חלוף&gt; בתיווך ב<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

ניתוח השוואתי של ביטוי חלבון רקומביננטי בBiofactories שונה: חיידקים, תאי חרקים וצמחי מערכות

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה Assay העלים טבק benthamiana עבור Transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing need in developing efficient methods for recombinant antibody production. As of 2019, there were more than 70 FDA-approved monoclonal antibodies, and there is exponential growth potential. Despite their promise, limiting factors for widespread use are manufacturing costs and complexity. Potentially, plants offer low-cost, safe, and easily scalable protein manufacturing&#160;strategies. Plants like Nicotiana benthamiana not only can correctly fold and assemble complex mammalian proteins but also can add critical post-translational modifications similar to those offered by mammalian cell cultures. In this work, by using native GFP and an acid-stable variant of green fluorescent protein (GFP) fused to human monoclonal antibodies, we were able to visualize the entire transient antibody expression and purification process from N. benthamiana plants. Depending on the experiment&#39;s purpose, native GFP fusion can ensure easier visualization during the expression phase in the plants, while acid-stable GFP fusion allows for visualization during downstream processing. This scalable and straightforward procedure can be performed by a single researcher to produce milligram quantities of highly pure antibody or antibody fusion proteins in a matter of days using only a few small plants. Such a technique can be extended to the visualization of any type of antibody purification process and potentially many other proteins, both in plant and other expression systems. Moreover, these techniques can benefit virtual instructions and be executed in a teaching laboratory by undergraduate students possessing minimal prior experience with molecular biology techniques, providing a foundation for project-based exploration with real-world applications.

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We describe here a simple method for expression, extraction, and purification of recombinant human IgG fused to GFP in Nicotiana benthamiana. This protocol can be extended to purification and visualization of numerous proteins that utilize column chromatography. Moreover, the protocol is adaptable to the in-person and virtual college teaching laboratory, providing project-based exploration.

ייצור חלבוני פיוז'ן IgG המתבטאים באופן ארעי בניקוטיאנה

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

מיצוי וטיהור יעיל של GFP-His מעלי N. benthamiana

Apoplast-Extraction Based Method to Improve the Purity of Plant Produced Recombinant Protein

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from plants is one of the most critical steps in the production process. Typically, proteins were purified from total soluble proteins (TSP), and the presence of miscellaneous intracellular proteins and cytochromes poses challenges for subsequent protein purification steps. Moreover, most therapeutic proteins like antigens and antibodies are secreted to obtain proper glycosylation, and the presence of incompletely modified proteins leads to inconsistent antigen or antibody structures. This work introduces a more effective method to obtain highly purified recombinant proteins from the plant apoplastic space. The recombinant Green fluorescent protein (GFP) is engineered to be secreted into the apoplast of Nicotiana benthamiana and is then extracted using an infiltration-centrifugation method. The GFP-His from the extracted apoplast is then purified by nickel affinity chromatography. In contrast to the traditional methods from TSP, purification from the apoplast produces highly purified recombinant proteins. This represents an important technological improvement for plant production systems.

מחבר זרקור: אופטימיזציה של מיצוי חלבון אפופלסט להתאוששות יעילה של חלבונים רקומביננטיים מתאי צמח

The purification of recombinant proteins from plant systems is usually challenged by plant proteins. This work provides a method to effectively extract and purify a secreted recombinant protein from the apoplast of Nicotiana benthamiana.

שיטה מבוססת מיצוי אפופלסט לשיפור הטוהר של חלבון רקומביננטי המיוצר על ידי צמחים  

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from ...

ארעי ביטוי טבק Benthamiana משאיר לייצור טריטרפן בקנה מידה מפוח

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST