שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האנרגטיות, כגון בריאות המיטוכונדריאלית, יעילות אנרגטית ושימוש באנרגיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי צריכת חמצן של מיטוכונדריה מבודדת נמדדת ישירות. אין צורך לתקן את התוצאות עבור תהליכים מטבוליים תאיים אחרים.
החלטנו לראשונה להמשיך בשיטה זו בבקר חלב כשרצינו לבחון כיצד יעילות המיטוכונדריה משפיעה על יעילות המזון. הדגמת וידאו של שיטה זו היא קריטית כמו השלבים בבידוד המיטוכונדריאלי קשה ללמוד כי הם צריכים להיות עקביים ומדויקים. בהקדם האפשרי לאחר דגימת הכבד מוסר מן הפרה לשטוף את המדגם בתקשורת בידוד המיטוכונדריה כדי להסיר את תאי הדם האדומים.
שימוש במספריים מרכך דק את הרקמה לתוך מקור מקורר המכיל מספיק מדיית בידוד כדי לשמור על הרקמה לחה. מעבירים את הכבד הטחון לבקבוקון זכוכית 30 מיליליטר המכיל תקשורת בידוד מיטוכונדריה. הוסף עלה טפלון כי יש אישור של 0.16 מילימטרים וזה כבר דגירה בקרח הומוגנית דגימת הכבד ב 500 סל"ד במשך דקה אחת עם ארבע משיכות לדקה.
לאחר מכן, להעביר את homogenate לצינור המכיל תקשורת בידוד מיטוכונדריה ולמקם את זה לתוך מקור ארוז קרח. הומוגני צנטריפוגה ב 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. השליכו את גלולת הכדור והעברו את העל-טבעי לצינור צנטריפוגה צונן.
צנטריפוגה supernatant וכתוצאה מכך ב 10, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להשיג את גלולת המיטוכונדריה. יש להתריע ולשטוף את גלולה ב-10 מיליליטר של מדיית בידוד מיטוכונדריה עם BSA נטול חומצות שומן. ואז צנטריפוגה ב 8, 100 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את גלולת הכדור ב-200 מיקרוליטרים של מדיית בידוד. מניחים את זה על קרח עד מוכן לשימוש עבור צריכת החמצן ואת דליפת פרוטונים מים קינטיים. לקבוע את ריכוז החלבון של ההשעיה גלולה באמצעות ערכת חומצה ביצינצ'ונית לכל הוראות היצרן באמצעות BSA כסטנדרט.
תחילה, צור מדיה לצריכת חמצן כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הדגירה את אמצעי צריכת החמצן ב 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להגדיר את תא הנשימה, משאבה ואלקטרודה חמצן עבור מערכת oxygraph על פי הוראות היצרן.
ואז למקם מיליליטר אחד של תקשורת צריכת חמצן לתא הנשימה. לאחר מכן מוסיפים 0.35 מיליגרם של חלבון מיטוכונדריאלי לתא. מערבבים במרץ כדי להבטיח כי הפתרון הופך רווי באוויר ולשמור על טמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
תקליט את צריכת החמצן במשך כחמש דקות. כאשר צריכת החמצן הופכת קבועה המיוצגת על ידי קו ישר יורד, רשום זאת כצריכת החמצן הבסיסית. הוסף 1.25 microliters של פתרון רוטנון ארבעה מילימולר כדי לעכב אחד מורכב, ולאחר מכן להוסיף חמישה microliters של פתרון אחד succinate טוחן כדי להגיע לריכוז סופי של חמישה סוצ'ילרים succinate בתא הנשימה.
זוהי צריכת חמצן IV המדינה. לאחר מכן, להוסיף מיקרוליטר אחד של פתרון ADP 100 מילימולר כדי להגיע לריכוז סופי של 100 micromolar בתא הנשימה. צריכת החמצן תרד למשך כחמש דקות ולאחר מכן תהפוך לקו ישר.
רשום את צריכת החמצן הזו כנשימה השלישית. חשב את יחס בקרת הנשימה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. ואז לשאוף את כל הפתרונות מתוך תא הנשימה.
שוטפים את התא מספר פעמים במים כפולים. ראשית, להכין פתרון של 80 ננוגרם למיליליטר של ניז'רין באתנול הגבלת כמות האתנול הוסיף פחות ממיקרוליטר אחד. כמו כן, להכין פתרון של שמונה מיקרוגרם לכל אוליגומיצין מיליליטר באתנול.
לאחר שטיפה יסודית של התא במים כפולים, מניחים מיליליטר אחד של מדיית צריכת החמצן בתא הנשימה ומערבבים במרץ עם בר ערבוב מגנטי. מוסיפים 0.35 מיליגרם חלבון מיטוכונדריאלי לתא הנשימה. הוסף אלקטרודה רגישה למתיל טריפנילפוספוניום למערך התאים כדי לוודא שהצד השני מחובר כראוי למטר pH.
הוסף 1.25 microliters של פתרון רוטנונה ארבעה מילימולר לעכב I.Record מורכב הנשימה במשך שתיים עד חמש דקות. רשום את ערך צריכת החמצן כאשר הוא הופך קבוע. לאחר מכן, להוסיף 0.56 microliters של פתרון אוליגומיצין כדי לעכב ניצול ADP.
הקלט את הנשימה במשך כשתיים עד חמש דקות. רשום את ערך צריכת החמצן כאשר הוא הופך קבוע. לאחר מכן להוסיף 0.112 microliters של 80 ננוגרם לכל פתרון ניז'רין מיליליטר כדי לבטל את שיפוע ה- pH על פני הממברנה הפנימית המיטוכונדריאלית.
הקלט נשימה במשך שתיים עד חמש דקות ושים לב לערך צריכת החמצן כאשר הוא הופך קבוע. הוסף חמישה microliters של 10 מילימולר מתיל טריפנילפוספוניום פתרון הדגירה המיטוכונדריאלית כדי להתחיל להכין עקומה סטנדרטית. חזור על תוספת זו ארבע פעמים נוספות עד ריכוז כולל של 2.5.
מיקרומולר נוסף. לאחר מכן, להוסיף חמישה microliters של פתרון אחד לחות succinate לתא ליזום נשימה. הקלט את הנשימה עד להשגת עקבות יציבות.
לאחר מכן הוסף מלונט כדי להפוך את המערכת כמפורט בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, RCR ו קינטיקה דליפת פרוטון נמדדים בחלב של פרות חולבות הולשטיין 70 ימים לאחר פרות חלב הוזנו עם רמות שונות של נחושת, אבץ, מנגן במשך 28 ימים. המדינה הרביעית הנשימה נתפסת להיות הגבוה ביותר בפרות נתון רמות נמוכות של מנגן, עדיין הוא הנמוך ביותר בפרות שליטה, המציין כי מנגן ממלא תפקיד חשוב במזעור נשימה תלויי דליפת פרוטון.
ניתוח הנשימה תלוית דליפת הפרוטון בלחץ דם מגלה כי נשימה זו היא הגדולה ביותר בפרות שטופלו במנגן נמוך, והנמוך ביותר בפרות שליטה. תוצאות אלה מאשרות כי הקבוצה מנגן נמוך יש את המדינה הגדולה ביותר IV נשימה בעוד קבוצת הביקורת יש את הנמוך ביותר. בעוד יעילות ההזנה גבוהה יותר בהיגוי אנגוס שנולדו שוורים RFI נמוך מאשר שוורים גבוהים RFI, זה לא בא לידי ביטוי RCR המיטוכונדריאלי או קינטיקה דליפת פרוטון.
בעת ביצוע הליך זה חשוב לשמור את כל הבקבוקונים והבקבוקונים על הקרח תוך עיבוד המיטוכונדריה. לאחר התפתחותה טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום תזונת החלב לחקור את התפקיד של יעילות המיטוכונדריה ביעילות ההזנה ותפקוד המיטוכונדריאלי בכבד. אל תשכח כי עבודה עם רוטנונה יכול להיות מסוכן, אמצעי זהירות כגון לבישת כפפות, הגנה על העיניים PPE הנכון תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.
