האסטרטגיות הנוכחיות להקרנת תרופות שתן יקרות לביצוע לניתוח שגרתי של לוחות גדולים יותר ויותר של תרופות של התעללות כנדרש לבדיקות מקום עבודה, כמו גם יישומים לניטור תרופות טיפוליות. בנוסף, שיטות המבוססות על בדיקות אמינו נוטות להטיה והן מוגבלות בסופו של דבר לניתוח יעד של לוחות תרופות ידועים. היתרון העיקרי של השיטה שלנו, המכונה MSI-CE-MS, הוא שהיא מאפשרת הקרנה מהירה של פאנל סמים ללא הגבלה ואת המטבוליטים שלהם עם דיוק גבוה ובדיקות מדגם מינימלי.
יש צורך דחוף בשיטת סינון בתפוקה גבוהה ובמחיר סביר כדי לשפר את תוצאות המטופל על ידי אישור דבקות ואופטימיזציה של משטרי מינון סמים, תוך חשיפת שימוש בסמים לא חוקיים. פלטפורמת הפרדה מרובת-קישורים זו יכולה להיות מיושמת במגוון תחומי מחקר אחרים הקשורים לאפיון מטבוליטים ממוקד או לא ממוקד בדגימות ביולוגיות מורכבות. התחל על ידי הפשרת דגימות שתן בוקר דה מזוהה שנאספו מחולים עם היסטוריה ידועה תרופות מרשם עבור מינוס 80 מעלות צלזיוס אחסון על קרח מערבולת הדגימות המופשרות במשך 30 שניות.
לאחר מכן, משתק את הדגימות על ידי צנטריפוגה ולשלב שלושה 10 aliquots microliter של כל מדגם עם 10 microliters של סטנדרטים פנימיים deuterated, חמישה microliters של 4-פלואורו-L-פנילאלנין ו 3-כלורו-L-טירוסין פתרון ו 25 microliters של מים מינונים. לאחר מכן צנטריפוגה את תערובות במשך דקה אחת ולהעביר 20 microliters של כל מדגם לתוך בקבוקונים פוליפרופילן בודדים. כדי להגדיר את הפרמטרים מיזוג סיליקה נימי מותך, לחתוך 135 ס"מ אורך, 50 מיקרומטר קוטר פנימי, ו 360 מיקרומטר בקוטר חיצוני נימי מסליל.
השתמש במכונת חלון נימי כדי להסיר כ 7 מילימטרים של ציפוי פוליאמיד משני הקצוות של כל נימי. לאחר מכן, להתקין את כניסת נימי לתוך אלקטרופורזה נימי, או מחסנית CE, על ידי לולאה כל נימי עבור שני פניות 360 מעלות, דואג לבולט כשני מילימטרים של שקעים נימי מתוך מחט מרסס CE. כאשר כל נימי הותקנו, בזהירות לטעון את מחסנית CE לתוך מערכת CE ולאחסן את מרסס CE מתוך מקור היון.
מניחים את הכרומטוגרפיה הנוזלית, או מרסס LC, במקור היון ובחרו סומק בתוכנת המערכת כדי להגדיר את המיזוג נימי. הגדר את משך המתנול, נתרן הידרוקסיד טוחן אחד, מים deionized, ו אלקטרוליטים ברקע סומק ל 30 דקות לכל סומק ולהניח את המשאבה isocratic על המתנה במהלך תקופת מיזוג נימי. לאחר הסומק האחרון, לנקות את ספקטרומטר מסה אלקטרופורזה נימי, או מרסס CE-MS, ואת האלקטרודה CE עם מגבונים ספוגים מתנול.
נקה את ממשק CE-MS עם פתרון מים isopropanol אחד לאחד כדי להסיר את כל שאריות פיקדונות מלח. החלף את מרסס LC עם מרסס CE-MS ניקה נימי מותנה לאחרונה לתוך ממשק נוזלי נדן קואקסיאלי. לאחר מכן להפעיל את המשאבה isocratic ולהחיל מתח של 30 קילו-וולט במשך 15 דקות כדי להבטיח כי פרופיל זרם CE יציב מושגת לפני ניתוח השתן.
בתוכנת המערכת, בחר תנאי מוקדם, הגדר את הריקום ל- 600 שניות וציין מיקום קובץ אלקטרוליטים ברקע. הגדר את הזריקה הידרודינמית להזריק את הדגימות ב 100 מיליבארים במשך חמש שניות כדי להזריק אלקטרוקינטית את חללי אלקטרוליטים ברקע ב 30 קילו-וולט במשך 75 שניות. הגדר את המתח המוחל ל- 30 קילו-וולט, את טמפרטורת המחסנית ל- 25 מעלות צלזיוס ואת זמן הריצה הכולל ל- 40 דקות.
לאחר מכן, באמצעות לוח הזמנים, להחיל שיפוע לחץ של שני מיליברים לדקה מאפס עד 40 דקות במהלך ההפרדה. כאשר רכישת המדגם הושלמה, לשטוף את נימי ב 50 מיליבארים של לחץ עם אלקטרוליטים ברקע לילה בעוד נימי הוא מרסס CE במקור היונים. הגדר את זיהוי היונים החיוביים של TOF-MS כך שישתרע על-פני יחס מסה-טעינה של 50 עד 1, 700, עם קצב רכישת נתונים של 500 אלפיות שניה לכל ספקטרום, ואשר שגם נתוני הפרופיל וגם נתוני המרכז מאוחסנים בתבנית קובץ D.
הגדר את תנאי יינון electrospray נימי ומתח זרבובית של 2000 וולט כל אחד, גז nebulizer ל 10 פאונד לאינץ 'מרובע, ואת אספקת גז ייבוש לשמונה ליטר לדקה ב 300 מעלות צלזיוס עם זרימת גז נדן של 3.5 ליטר לדקה ב 195 מעלות צלזיוס במהלך הרכישה. לאחר מכן הגדר את הגדרות המתח של MS של המפצל, הרחפן והתדר אוקטפול אחד ל- 120, 65 ו- 750 וולט, בהתאמה, והגדר את פרמטרי בקרת המכשירים ורכישת הנתונים בהתאם לעיצוב הניסוי. לצורך ניתוח נתונים, פתח את נתוני CE-MS מרובי המקטעים בתוכנת המערכת.
תחת כרומטוגרמות, הגדר את נתוני החילוץ ואת תבניות הנתונים הספקטרומטריים של הכרומטוגרמה והמסה למצב פרופיל. תחת החלקה, בחר סביצקי-גוליי מעוקב מרובע והגדר את רוחב הפונקציה ל-15 נקודות. לאחר מכן לחץ על שלב טרשת נפוצה והגדר את האינטגרטור כ"זריז".
תחת מסנני שיא, הגדר את מספר הפסגות המרבי ל- 11. תחת תצוגה, לחץ על רשימת שיא של שילוב ובחר מספר שיא, זמן שמירה, אזור שיא, גובה שיא ויחס אות לרעש. לאחר מכן שמור את הפרמטרים תחת שם פעולת שירות ייחודי והחל את פעולת השירות על התהליך עבור הפרשנות של כל ערכת נתונים.
בניתוח מייצג זה של תרופות isomeric isobaric שונים של התעללות מטבוליטים שלהם, 30 פסגות נפתרה מ 10 דגימות עצמאיות של תערובת סמים זוהו ללא משאיות מדגם. שני אופיואידים isobaric אחרים ניתן לפתור באופן מלא כמו 20 פסגות נפרדות עם רכישת נתוני סריקה מלאה. באופן דומה, שני isomers מיקום אמפטמין נפתרו באופן מלא בניתוח CE-MS מרובה מקטעים זה, כדי להבחין התעללות מתאמפטמין לא חוקי משימוש לרעה פוטנציאלי של phentermine, ממריצה מרשם המשמש מדכא תיאבון לירידה במשקל.
בניתוח סינון תרופות מייצג זה, תוצאת בדיקת סינון חיובית למתדון הושלכה על ידי זיהוי של שיא אות גדול הנודד יחד עם פסגת המתדון-d3 עם שגיאת מסה נמוכה. לא זוהו אותות אחרים בדגימות שתן אחרות באותה ריצה וריכוז המתדון שזוהה חרג פי 13 ממגבלת הניתוק המומלצת בהשוואה ליחס תגובת היונים הנמדד שלו בדגימה ותוקן על ידי גורם דילול שתן של פי ארבעה, המאשר למטופלים הקפדה על טיפול תחזוקת מתדון. כאן, תצורת הזרקה סדרתית ב- CE-MS מרובה מקטעים, הכוללת חמישה כיול תרופות שונים, נותחה בשכפול בתוך ריצה אחת יחד עם ריק שתן סינתטי.
מטבוליטים התרופה זוהו כמו היונים המולקולריים שלהם potenated מעל גבולות ניתוק ההקרנה שלהם. בעקבות הליך זה, מספר רב של מטבוליטים קוטביים ויוניים בשתן ניתן לנתח גם על ידי MSI CMS בתמיכה במחקר מטבולית מבוססת גילוי. בנוסף, מעקב מקיף של מגוון רחב של תרופות אקסוגניים ואת המטבוליטים שלהם ניתן להשיג, כולל תרופות ללא מרשם וסמים לא חוקיים נוטים התעללות.
שיטה ממוטבת זו יכולה לשמש גם כדי לסנן באופן שגרתי תרופות אחרות של התעללות. אלה יכולים להיות מטבוליטים קנאביס או אלכוהול השיטה שלנו יכולה גם להבדיל בין מטריצת שתן סינתטית או מזויפת מדגם שתן טבעי, אמיתי, שנתרם באופן אותנטי גם כן. זכור תמיד לנקוט זהירות בעת עבודה עם נוזלים ביולוגיים.
