פרוטוקול זה תוכנן כדי להבטיח שבעיות בהן נתקלים לעתים קרובות במהלך ניסויים קריסטלוגרפיים סדרתיים שנפתרו בזמן לא יפגעו באיכות הנתונים. אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו הוא הסתגלותה למערכות גבישים בודדות. בדיקת שבלט המצלמה במהירות גבוהה גם מאפשרת לנו למדוד ישירות יציבות שאקסטרוס.
ראשית, לטעון 50 microliters של מונולין גבישי מבוסס LCP במזרק 100 מיקרוליטר כ 30 דקות לפני הזריקה. להזרקה לתוך סביבת ואקום, לטעון חמישה microliters של MAG 7.9 וחמישה microliters של פרפין נוזלי לתוך החלק האחורי של מזרק שני. מחזיק את המזרק אנכית, לגרש את בועות האוויר מהמזרק.
חבר את המזרק עם MAG 7.9 ופרפין למחבר מזרק סטנדרטי. וטיהור האוויר מן המזוג על ידי לחיצה בעדינות על הבוכנה עד נפח קטן של התערובת גלוי בקצה המחט מזוג. חבר את מזרק המדגם מדר המזרק לוקח מכונית לא להכניס כל אוויר לתוך המדגם.
מערבבים את השומנים ופרפין על ידי העברת המדגם דרך מפוסל מספר פעמים. לאחר מכן, לטעון 20 microliters של LCP premixed במזרק נוסף 100 microliter. מוציאים את המזרק הריק מהמצמד ומצמידים את ה-LCP המהוקדם לקריסטל המכיל מזרק באמצעות מצמד מזרק סטנדרטי.
לאחר מכן, להעביר את המדגם דרך מזוג 100 פעמים. כדי להביא את המדגם לשלב מעוקב, להוסיף שלושה microliters של מונולין ומערבבים 50 פעמים. חזור על הליך זה רק עד שלב שקוף נוצר כדי למנוע עודף של מונולין.
כבדיקה ראשונית עבור נוקשות מדגם extrudability, לנתק את המזרק הריק מן מוביגם המזרק, והחזקת המזרק אנכית, לסחוט כמות קטנה של סמפלר דרך מובייר. אם המדגם שבלט יוצר גליל זקוף, אז המדגם מוכן לבדיקת שבלט. כוונן את עוצמת הקול הכוללת של המדגם ל- 100 מיקרוליטרים על-ידי הוספת LCP נוסף.
חבר את מזרק הדגימה ושני מזרקים ריקים למצמד המזרקים תלת-כיוון. מערבבים לפחות 50 פעמים על ידי העברת מחצית המדגם לתוך המזרק השני ולאחר מכן לחיצה על שני חצאי המדגם לתוך המזרק השלישי בו זמנית. מניחים את המזרק המכיל את הדגימה המעורבת תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לאמת התפלגות הומוגנית של גבישים.
נקו משאבת HPLC ואת כל קווי המים כדי להבטיח שתעריפי הזרימה מדויקים. לאחר מכן, לטהר את השלב ההידראולי של המזרק. לאחר מכן, הפעל וחבר את המצלמה לתוכנה שסופקה.
כאשר סרטון בשידור חי פועל לקבלת משוב חזותי, מקם את קצה הזרבובית במרכז המסגרת והבא אותו לפוקוס עם שלב שלושת הצירים. הגדר את קצב המסגרות במצלמה ל- 1,000 מסגרות לשנייה. לאחר מכן, הגדר את הרזולוציה ל- 512 על 512 פיקסלים.
כאשר זמן החשיפה מוגדר כעת לפי קצב הפריימים, התאם את רמת התאורה עד שהזורם יהיה גלוי. ממקם מחדש את קצה הזרבובית כך שהוא ירכז משמאל לימין וימוקם בשליש העליון של המסגרת. הגדר את המצלמה במצב זמן לשגות.
הגדר את המרווח ל- 30 שניות ואת החוזר ל- 40 פעמים. הגדר את מצב הגורם המפעיל לאקראי. והזן את מספר המסגרות לתיעוד ל- 1,000.
עכשיו, לטעון את המאגר עם 20 microliters של דגימת הבדיקה ולצרף את הזרבובית נימי. חבר את המאגר המלא למזרק. לאחר מכן, לחבר את צינור הגז לנמל על הזרבובית ולהתחיל את זרימת הגז.
לאחר מכן, הפעל בו זמנית את המשאבה ואת הקלטת המצלמה. לפקח על ההבלטה עד לחץ המשאבה בחדות משתוללת ליד זמן הסיום הצפוי. לאחר מכן, להפסיק להקליט, לכבות את המשאבה, ול לפרוק את לחץ המערכת על ידי פתיחת שסתום ההקלה.
לאחר מכן, פתח את קובץ הווידאו עם תוכנת הניתוח וכייל את כלי המדידה. מצא מסגרת בסרטון שבו יש תכונה הניתנת למעקב גלויה בהבלטה. רשום את מספר המסגרת.
לאחר מכן, קדם את הווידאו למסגרת שבה אותה תכונה גלויה אך עברה ממקומתו בשלב הקודם. רשום את מספר המסגרת. בעזרת כלי מדידת הקו הישר, למדוד את המרחק מנקודת ההתחלה והסיום של התכונה באמצעות מדידת ניתוח.
חזור על השלבים הקודמים מספר פעמים עבור כל מקטע בסרטון. לבסוף, התווה את סידרת הנתונים. חומר ההתחלה האידיאלי עבור ההליך המתואר כאן הוא צפיפות גבוהה של microcrystals משולב לתוך מדיום נושא צמיג עבור המזרק.
גבישי חלבון שימשו לאיסוף נתוני TRSFX על החיידק השאוב פרוטון rhodopsin, אשר חשף את השינויים המהירים במיוחד המתרחשים לאחר ספיגת פוטון. לאחר הכנת מדגם באמצעות מזוג תלת-אופן, בדיקה חזותית של החומר במזרק מראה הומוגניות מדגם. ותמונות מיקרוסקופ יכולות לאשר את צפיפות הגבישים.
המדגם נמצא בשלב מעוקב כאשר מדיום המסירה ברור וצמיג. תערובות טורביות הן אינדיקציה לכך שהדגימה נמצאת בשלב ספוג או למלולר, אך אינן חד משמעיות מכיוון שצפיפות גביש גבוהה עלולה לטשטש את בהירות ה- LCP. בדיקת לחץ נמוך לזיהוי שלב הספוג יכולה להתבצע על ידי משיכת בוכנה המזרק הרחק מהדגימה.
במהלך בדיקת הסילון, המדגם צריך להחדיר עמודה רציפה ארוכה של LCP שזז במהירות כמעט קבועה. דגימות פועלות במצב טפטוף מציינות כי צמיגות נמוכה מדי. נתונים מדוגמאות יוצרות עמודה צריכים להראות שההבלטה נשארת מעל למהירות מינימלית המוכתבת על-ידי הפרמטרים הניסיוניים.
לאחר אופטימיזציה באמצעות פרוטוקול זה ניתן לאסוף נתונים גבישיים טוריים בפתרון זמן במתקן מומחה. זה יחשוף את השינויים הקונפורמיים בחלבון כולו כפי שהוא מבצע את תפקידו.
